CC BY
782
УДК 637.142
Ч. Цэнд-Аюуш, В.И. Ганина
ПРОБИОТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ НАЦИОНАЛЬНЫХ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ МОНГОЛИИ
Цель данной работы - идентификация и изучение пробиотического потенциала молочнокислых бактерий, выделенных из национальных молочных продуктов Монголии. Исследовали 69 образцов продуктов, включая тараг, айраг, ааруул, бяслаг и ээзгий. В результате были выделены штаммы молочнокислых бактерий, идентификация которых проведена на основе определения последовательности их 16S гДНК. Все выделенные штаммы тестированы на толерантность к низким значениям рН и желчным кислотам, газообразованию и адгезии на Caco-2 клетках. Установлено, что 10 из изученных штаммов могут быть использованы в качестве пробиотиков, при этом 6 были выделены из хоормога, изготовленного из верблюжьего молока. На основе 16S-рибосомальной гДНК анализа и углеводного профиля их идентифицировали как Lactobacillus (L.) plantarum и L. paracasei.
Молочнокислые бактерии, пробиотические свойства, молочный продукт.
Введение
Молочнокислые бактерии и бифидобактерии, как сообщается в литературе, являются пробиотиками с полезными для здоровья свойствами [3-6, 8, 10].
В соответствии с данными рабочей группы Продовольственной и сельскохозяйственной организации объединенных наций (ООН) [9] и Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) [10] пробиотические бактерии определены как живые микроорганизмы, которые полезны при приеме внутрь в адекватных количествах.
Монгольская культура питания отличается от западных культур, особенно в потреблении кисломолочных продуктов. Молочные продукты занимали одно из ведущих мест в питании кочевых народов Монголии, для их изготовления употребляли молоко разных видов домашних животных (коров, овец, коз, яков, кобыл и верблюдиц). Национальные кисломолочные продукты Монголии - ааруул, ээзгий и бяслаг - являются наиболее употребляемыми, но сообщений о составе их микрофлоры нами не обнаружено, в то время как о микробиологическом составе тарага, хоормога и айрага имеются данные в литературе. В Монголии и Внутренней Монголии (Китай) также проводятся исследования в данном
направлении, но они пока очень малочисленны [7]. В Монголии для производства кисломолочных продуктов применяют импортируемые типовые закваски из разных стран мира. Однако до настоящего времени в Монголии не организовано собственное производство заквасок для национальных кисломолочных продуктов. В этой связи выделение и изучение свойств микрофлоры таких национальных кисломолочных продуктов, как тараг, хоормог, ааруул, бяслаг, ээзгий, является актуальной задачей.
Объекты и методы исследований
Объектами исследований были тараг (идентичен йогурту), хоормог - кисломолочный продукт из верблюжьего молока, айраг - кисломолочный напиток из кобыльего молока, бяслаг (типа сыра) и другие продукты, полученные в частных хозяйствах. Всего было изучено 66 образцов традиционной монгольской молочной продукции (табл. 1), которые отобраны из трех регионов: Тов, Хубсугул и Дор-ноговь. В исследованиях применяли стандартные методы биохимических и микробиологических исследований, а также генетические методы, в частности 168-рибосомальной ДНК.
Таблица 1
Названия исследованных национальных молочных продуктов, изготовленных из разного молочного сырья в регионах Тов, Хубсугул и Дорноговь
Наимено- вание региона Местность Продукты
Тараг и хоормог Айраг Ааруул Бяслаг Ээзгий
Ко- рова Коза Вер- блюд Овца Як Кобыла Корова Корова Корова
Тов Улаанбаатар В 3 5 5 3
Тов Алтанбулаг ІІ б 2 І 2 3 І 2
Хубсугул Мурун В
Дорноговь Сайншанд б
Всего 21 9 б 2 І 1 В І 5
Результаты и их обсуждение
Выделение и идентификация штаммов молочнокислых бактерий. Для предварительной идентификации все колонии, выделенные с питательных сред MRS и GYP, окрашивали по Граму и тестировали на каталазную активность. Из образцов национальных молочных продуктов выделили 543 изолята, все они были грамположительными и каталазанегативными (табл. 2). Штаммы, которые были грампозитивными и каталазанегативными, отнесены к молочнокислым бактериям.
Таблица 2
Количество выделенных штаммов из кисломолочных продуктов
Название продукта Количество выделенных штаммов молочнокислых бактерий
Количество %
Тараг и хоормог 420 77,3
Айраг 67 12,3
Ааруул 41 7,6
Бяслаг 15 2,8
Большинство штаммов молочнокислых бактерий выделено из тарага и хоормога - 77,3 % и составляло 420 штаммов, из айрага - 12,3 % и составляло 67 штаммов, из ааруула - 7,6 % и составляло 41 штамм, из бяслага - 2,7 % и составляло 15 штаммов. Штаммы, выделенные из тарага и хоормога, классифицированы на 17 видов с применением метода 16S-рибосомальной ДНК. Все штаммы, выделенные из айрага, классифицированы на 12 видов; из ааруула - на 10 видов; из бяслага -на 5. Штаммы, выделенные из тарага, идентифицировали на основе 500 пар оснований цепи, начиная с 5 конца 16S-рибосомальной ДНК (16S гДНК). Полученные данные представлены в табл. 3.
Большинство среди выделенных штаммов отнесено к следующим таксономическим группам: Lactobacillus (L.) delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus fermentum, Streptococcus (Str.) thermophilus. Представленные результаты идентификации штаммов микроорганизмов из продукта с одним названием, но полученного на основе молока разных сельскохозяйственных животных свидетельствуют и о разнообразном составе присутствующей в них микрофлоры. Это можно объяснить тем, что культура и получение монгольских молочных продуктов различны, а поэтому они могут включать потенциально необычные микроорганизмы. Результаты проведенных исследований позволяют заключить, что доминирующими видами молочнокислых бактерий в тараге являются L. delbrueckii ssp. bulga-ricus, L. helveticus, L. fermentum и S. thermophilus.
Таблица 3
Штаммы и количество LAB изолятов, выделенных из тарага
Молоко
корова коза верблюд овца як
Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus 91 41 9 7 4
Lactobacillus helveticus 58 8 10 1
Lactobacillus fermentum 27 17 10 3
Streptococcus thermophilus 39 3 1
Enterococcus durans 15 1
Lactococcus lactis ssp. lactis 4 7 4
Lactobacillus pentosus 6 1 5
Weissella confusa 10
Lactobacillus kefiri 6 1
Lactobacillus paracasei ssp. tolerans 2 4
Lactobacillus plantarum 1 4
Pediococcus parvulus
Leuconostoc citreum 1 2 2
Lactobacillus paracasei ssp. paracasei 1 3
Enterococcus faecium 1
Leuconostoc mesenteroides 1 1
Weissella viridescens 1
Всего 270 80 54 8 8
Проверка выделенных штаммов на пробиотическую активность. Выделенные штаммы молочнокислых бактерий из монгольских молочных продуктов были проверены на пробиотическую активность. Одной из важнейших характеристик, применяемых при отборе пробиотических штаммов, является их резистентность к желудочному соку и желчным кислотам. Выживаемость бактерий в искусственном желудочном соке анализировали путем проведения теста на толерантность к желчным кислотам путем выращивания в GYP бульоне, содержащем 0,2 % бычьей желчи.
Результаты исследований показали, что из 543 исследованных штаммов только 126 росли в среде бульона с добавлением 0,25 % желчи, т.е. были толерантны к желчным кислотам. Далее эти штаммы были тестированы на толерантность к желудочному соку. Считали, что штаммы толерантны к желудочному соку, если после их инкубации в течение 3 часов с 0,04 % пепсином (pH 3,0) количество клеток составляло не менее 7 log КОЕ/мл. Из 126 штаммов, толерантных к желчным кислотам, 114 были толерантної к желудочному соку (табл. 4).
К важнейшей характеристической особенности пробиотических бактерий относят их адгезивную способность. Порогом адгезии считали, что количество прикрепленных клеток к эпителию должно составлять 5,0* 104 КОЕ/мл. 42 штамма, проявляя-ющих гомоферментативные свойства, были тестированы на адгезивность к Сасо-2 клеткам. Установ-
лено, что 10 штаммов с числом колоний от 7,0* 103 имели наивысшие значения адгезии к Сасо-2 клеткам
до 7,5* 104 КОЕ/мл и штамм L. plantarum 05АМ23 (табл. 4 и 5).
Таблица 4
Результаты изучения пробиотических свойств штаммов, выделенных из национальных ферментируемых молочных продуктов Монголии
Наименование штаммов Количество Выживаемость в желчи Толерантность к низким рН Г азообразование (-) Адгезия на Caco-2 клетках
Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus 155 8 2 2 0
Lactobacillus helveticus 115 0
Lactobacillus fermentum 78 50 50 0
Streptococcus thermophilus 43 5 0
Enterococcus durans 17 0
Weissella confusa 16 16 16 0
Lactococcus lactis ssp. lactis 20 2 2 2 0
Lactobacillus buchneri 7 1 1 0
Lactobacillus kefiri 10 0
Lactobacillus plantarum 11 11 11 11 5
Lactobacillus pentosus 13 9 9 9 0
Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis 21 2 2 2 1
Pediococcus parvulus 5 5 5 5 0
Enterococcus faecium 5 0
Weissella viridescens 6 6 6 0
Lactobacillus paracasei ssp. torelans 6 5 5 5 2
Lactobacillus paracasei ssp. paracasei 4 4 4 4 2
Lactobacillus sakei 2 2 2 2 0
Leuconostoc mesenteroides 2 0
Leuconostoc citreum 6 0
Leuconostoc garlicum 1 0
543 125 114 42 10
Таблица 5
Характеристика штаммов LAB, тестированных на пробиотическую активность
№ Штаммы Толерантность к желчным кислотам (%)* Выживаемость при низких рН (log CFU/мл)** Адгезия на Caco-2 клетках (x^CFU/mf* Продукты Молоко Аймак Местность
05AM23 L. plantarum 97,0 8,1 75,0 Айраг Кобыла Тов Улаанбаа- тар
06Tca8 L. plantarum 88,9 8,2 7,0 Тараг Верблюд Дорноговь Cайншанд
06Tca19 L. paracasei ssp. paracasei 87,9 8,0 11,0 Тараг Верблюд Дорноговь Cайншанд
06Tca22 L. paracasei ssp. paracasei 92,6 8,0 12,0 Тараг Верблюд Дорноговь Cайншанд
06Tca39 L. paracasei ssp. tolerans 87,4 7,3 18,0 Тараг Верблюд Дорноговь Cайншанд
06Tca40 L. plantarum 85,4 7,7 13,0 Тараг Верблюд Дорноговь Cайншанд
06Tca43 L. paracasei ssp. paracasei 85,6 7,0 16,0 Тараг Верблюд Дорноговь Cайншанд
06CC2 L. plantarum 97,0 8,7 13,0 Ааруул Корова Тов Алтанбу- лаг
06CC3 L. delbrueckii ssp. lactis 83,0 8,5 27,0 Тараг Корова Тов Алтанбу- лаг
06CC9 L. plantarum 92,6 8,0 8,0 Ааруул Корова Тов Алтанбу- лаг
Процент выживших колоний в GYP бульоне, содержащем 0,2 % бычьей желчи по сравнению с контролем. Число выживших колоний LAB после обработки 0,04 % пепсином при pH 3,0 в течение 3 часов.
Число выживших колоний LAB, адгезированных на Caco-2 клетках после инкубации.
Таблица 6
Углеводный профиль штаммов LAB, выбранных в качестве пробиотиков
№ 05AM23 06Tca8 06Tca19 06Tca22 06Tca39 06Tca40 06Tca43 06CC2 06CC3 06CC9
Углеводы 1 1 2 2 2 1 2 1 3 1
D-Arabinose - - - - - - - - - -
L-Arabinose - - - - - - - - - -
D-Ribose + + + + + + + + - +
D-Xylose - - - - - - - - - -
L-Xylose - - - - - - - - - -
D-Galactose + + + + + + + + - +
D-Glucose + + + + + + + + + +
D-Fructose + + + + + + + + + +
D-Mannose + + + + + + + + + +
L-Rhamnose - - - - - - - - - -
D-Mannitol + + + + + + + + - +
D-Sorbitol + + + + + + + + - +
Amygdalin + + + + + + + + - +
Esculin + + + + + + + + - +
Salicin + + + + + + + + - +
D-Celibiose + + + + + + + + - +
D-Maltose + + + + + + + + - +
D-Lactose + + + + + + + + + +
D-Melibiose + + - - - + - + - +
D-Sucrose + + + + + + + + - +
D-Trehalose + + + + + + + + + +
D-Melezitose + + + + + - + - - +
D-Raffmose - - - - - + - + - +
Gluconate + + + + + + + + - +
Starch - - - - - - - - - -
Примечание: 1 - L. plantarum; 2 - L. paracasei ssp. paracasei; 3 - L. delbrueckii ssp. lactis; + позитивный; - негативный.
Известно, что молочные бактерии могут ферментировать углеводы с образованием преимущественно одного конечного продукта брожения, т.е. быть гомоферментативными, и с образованием нескольких конечных продуктов брожения, т.е. быгть гетероферментативными. Данная характеристика очень важна для штаммов молочнокислых бактерий, поскольку позволяет определить целесообразность его применения в составе закваски для конкретного молочного продукта. Исследования показали, что из 114 штаммов, толерантных к желчным кислотам и желудочному соку, 42 штамма проявляли гомофер-ментные свойства, т.е. их можно применять для производства некоторых видов кисломолочнык продуктов, в частности йогуртов.
Выщеленныге штаммы с высокой адгезивной способностью были проанализированы по способности к сбраживанию углеводов. Полученные данные приведены в табл. 6.
Результаты идентификации изучаемых штаммов молочнокислых бактерий, за исключением 0бТСа39 штамма, совпадали с результатами ^S-рибосо-мальной ДНК.
Для определения возможности применения вновь выделяемых штаммов молочнокислых бактерий в технологии молочных продуктов следует очень тщательно проверять все их характеристики. Интересным представлялось определение гомологии между штаммами молочнокислых бактерий, отнесенных к одному виду, выделенных из одинаковых продуктов и одного места происхождения. Для этого был проведен RAPD-ПЦР анализ между следующими LAB
штаммами: L. plantarum 06Tca8 - L. plantarum 06Tca40, L. plantarum 06CC2 - L. plantarum 06CC9, L. paracasei spp. paracasei 06Tca19 - L. paracasei spp. paracasei 06Tca22 - L. paracasei spp. paracasei 06Tca43. Анализ полученных результатов с применением этого метода позволяет сделать заключение, что штаммы 06Tca8 - 06Tca40, 06CC2 - 06CC9 и 06Tca19 - 06Tca22 - 06Tca43 могут представлять индивидуальные изоляты (рис. 1).
Результаты исследований показали, что штаммы 06Tca8 и 06Tca40, выщеленныге из хоормога, изготовленного из верблюжьего молока местности Cайншанд Дорноговь региона, и штаммы 06CC2 и 06CC9, выделенные из тарага, изготовленного из коровьего молока местности Алтанбулаг Тов аймака, относятся к L. plantarum. Штаммы 0б,ГСА19, 06Tca22 и 06Tca43, выщеленныге из хоормога, изготовленного из верблюжьего молока местности Cайншанд Дорноговь региона, относятся к L. paraca-sei ssp. paracasei.
Основной и полезной микрофлорой в типовых йогуртах является L. delbrueckii ssp. bulgaricus и S. thermophilus. Технология производства тарага идентична технологии производства йогурта. На основе результатов проведенных исследований можно заключить, что доминирующими видами молочнокислых бактерий в тараге являются L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. helveticus, L. fermentum и S. thermophilus. Поэтому тараг и йогурт можно рассматривать как одиноковый тип молочного продукта. Поскольку культура получения молочных продуктов в Монголии отличается от производства в других странах,
они могут включать нехарактерные для йогурта микроорганизмы.
б
Рис. 1. Профили семи изолятов молочнокислых бактерий при проведении ПЦР со случайной амплификацией: а - дорожка 1, 2, 5 и 6 - использован праймер р7, дорожка 3, 4, 7 и 8 - использован праймер р11, дорожка М - маркер ДНК, дорожка 1 и 3 - 06Тса8, дорожка 2 и 4 - 06Тса40, дорожка 5 и 7 - 06СС2, дорожка 6 и 8 - 06СС9; б - дорожка 1, 2 и 3 - использован праймер АТ41, дорожка 4, 5 и 6 - использован праймер ВТ05, дорожка М - маркер ДНК, дорожка 1 и 4 - 06ТСА19, дорожка 2 и 5 - 06Тса22, дорожка 3 и 6 - 06Тса43
В результате проведенных исследований выявлено, что доминирующими видами молочнокислых бактерий в айраге были L. helveticus, L. delb-rueckii ББр. lactis, L. fermentum. Полученные данные отличаются от сообщенных ранее в работе [4]. Используя молекулярно-биологические методы, Watanabe й а1. идентифицировали из айрага в основном L. kefimnofaciens, которые не были обнаружены в исследованных нами образцах. В то же время обнаруженные и идентифицированные нами L. helveticus, L. delbrueckii ББр. lactis, L. fermentum не были обнаружены авторами работы [4]. Такие различные результаты свидетельствуют о видовом разнообразии микрофлоры продукта айраг, ее воз-
можном количественном и качественном изменении и необходимости продолжения исследований. Нами обнаружено, что в аарууле присутствуют гомофер-ментативные молочнокислые бактерии L. helveticus и L. delbrueckii єєр. ІасШі, а также гетерофермента-тивные молочнокислые бактерии L. /егшепШш, L. ЬисЫет и Ш. свп/ше.
В бяслаге доминировали L. delbrueckii єєр. Іасі и L. Іасиі єрр. Іасиі. Есть вероятность того, что гетеро-ферментативные молочнокислые бактерии в аарууле могли быть внесены из внешней среды, так как по традиционной технологии ааруул изготавливают кипячением тарага и последующей сушкой на солнце.
Ээзгий изготавливают кипячением и упариванием на медленном огне створоженного молока с последующим дроблением сгустка и сушкой на солнце. Вероятно, из-за продолжительного высокотемпературного технологического процесса приготовления в ээзгий молочнокислых бактерий не обнаружили.
Установлено, что 6 из 10 штаммов молочнокислых бактерий, выделенных из хоормога, обладают пробиотической активностью. Из 54 молочнокислых бактерий, идентифицированных как L. рІаШагиш или L. рагасаіеі єєр., 10 выделены из хоормога, изготовленного из верблюжьего молока.
Выводы
В результате проведенных исследований микрофлоры национальных молочных продуктов, отобранных в 3 регионах Монголии, удалось выделить и идентифицировать 10 гомоферментативных пробиотических штаммов молочнокислых бактерий. Они были идентифицированы и классифицированы как L. ріа^агиш, L. рагасаіеі єрр. Выделено большое количество гетероферментативных штаммов L. /ег-шепШш, толерантных к желчным солям и желудочному соку. Штаммы L. /егшепШш, которые имели сильную толерантность к желудочному соку и желчным солям, были также найдены в традиционных кенийских ферментированных молочных продуктах [11].
Таким образом, выделенные и идентифицированные штаммы молочнокислых бактерий, обладающие пробиотическими свойствами, можно рекомендовать для включения в коллекцию микроорганизмов Монголии и создания заквасок, применяемых в производстве кисломолочных продуктов.
Cписок литературы
а
1. Ганина, В.И. Новый синбиотический кисломолочный напиток / В.И. Ганина, Е.Н. Терешина, Л.В. Калинина, С.И. Перминов // Молочная промышленность. - 2008. - № 10. - С. 85.
2. Ганина, В.И. Пробиотики. Назначение, свойства и основы биотехнологии: монография / В.И. Ганина. - М.: МГУПБ, 2001. - 169 с.
3. Gupta, V. Probiotics / V. Gupta, R. Garg // Indian Journal of Medical Microbiology, 2009, 27. - Р. 202-209.
4. Ishida, Y. Clinical effects of Lactobacillus acidophilus strain L-92 on perennial allergic rhinitis: a double-blind, placebo-controlled study / Y. Ishida, F. Nakamura, H. Kanzato, D. Sawada, H. Hirata, A. Nishimura, O. Kajimoto, S. Fujiwara // Journal of Dairy Science, 2005, 88, 527-533.
5. Kato, K. Randomized placebo controlled trial assessing the effect of bifidobacteria fermented milk on active ulcerative colitis / K. Kato, S. Mizuno, Y. Umesaki, Y. Ishii, M. Sugitani, A. Imaoka, M. Otsuka, O. Hasunuma, R. Kurihara, A. Iwasaki, Y. Arakawa // Alimentary pharmacology & therapeutics, 2004, 20, 1133-1141.
6. Rosenfeldt, V. Effect of probiotic Lactobacillus strains in children with atopic dermatitis / V. Rosenfeldt, E. Benfeldt,
S.D. Nielsen, K.F. Michaelsen, D.L. Jeppesen, N.H. Valerius, A. Paerregaard // The Journal of allergy and clinical immunology, 2003, 111, 389-395.
7. Shuangquan. Microflora in traditional starter cultures for fermented milk, hurunge, from Inner Mongolia, China / Shua-ngquan, Burentegusi, Yu B, T. Miyamoto // Animal Science Journal, 2006, 77, 235-241.
8. Sullivan, A. Probiotics and gastrointestinal diseases / A. Sullivan, E.C. Nord // Journal of internal Medicine, 2005, 257, 78-92.
9. WHO, Health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with livelactic acid bacteria, a joint FAO/WHO expert consultation // Cordoba, Argentina, 1-4 October 2001 [homepage on the Internet].
10. World health organization (WHO) [cited 13 July 2009]. Available from URL.
11. Mathara, J.M. Functional characteristics of Lactobacillus spp. From traditional Maasai fermented milk products in Kenya / J.M. Mathara, U. Schillinger, C. Guigas, C. Franz, P.M. Kutima, S.K. Mbugua, H.K. Shin, W.H. Holzapfel // International Journal of Food Microbiology, 2008, 126, 57-64.
ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет
пищевых производств», І093І6, Россия, г. Москва, ул. Талалихина, ЗЗ.
Тел./факс: 8(495) 677-07-23 8(495) 677-03-90 е-mail: techmol@inbox.ru
Монгольский государственный университет науки и технологии, Институт пищевой инженерии и биотехнологии, Монголия, г. Улаанбаатор, Cyхбаатарский район, Бага Тойруу, 4б.
Тел.: +976-ІІ-32-45-90 Факс: +976-ІІ-324І2І e-mail: ico@must.edu.mn
SUMMARY Chuluunbat Tsend-Ayush, V.I. Ganina
PROBIOTIC PROPERTIES OF THE LACTIC ACID BACTERIA ISOLATED FROM NATIONAL DAIRY PRODUCTS OF MONGOLIA
The aims of this study were to investigate the diversity of lactic acid bacteria (LAB) isolated from traditional Mongolian dairy products, and to estimate the probiotic potential of the isolated strains. We collected 69 samples of such traditional Mongolian dairy products as tarag, airag, aaruul, byasulag and eezgii, from which 543 LAB strains were isolated and identified on the basis of 16S ribosomal DNA sequence. The probiotic potential of the LAB isolates for making yoghurt was evaluated. All the LAB isolates were screened for tolerance to low pH and to bile acid, gas production from glucose, and adherence to Caco-2 cells. We found І0 strains that might possess probiotic properties, and identified them as Lactobacillus (L.) plantarum or L. paracasei subspecies, using 16S ribosomal DNA and carbohydrate fermentation pattern. These strains were differentiated from each other individually by randomly amplified polymorphic DNA analysis. In addition, it has to be noted that 6 of the І0 strains were isolated from the Dornogovi province khoor-mog.
Lactic acid bacteria, probiotic properties, dairy products.
Moscow State University of Food Production 33, Talalikhina street, Moscow, І093І6, Russia Phone/Fax: +7(495) 677-07-23 +7(495) 677-03-90 е-mail: techmol@inbox.ru
Mongolian State University of science and technology Institute of food engineering and biotechnology 46, Bagh Toyruu, Sukhbaatarsky area, Ulaanbaatar, Mongolia
Phone: +976-11-32-45-90 Fax: +976-11-324121 e-mail: ico@must.edu.mn
