CC BY
46
УДК 616.711-007.55:616-071
СКОЛИОТИЧЕСКАЯ БОЛЕЗНЬ: 50-ЛЕТНИЙ ОПЫТ ИССЛЕДОВАНИЙ
Алла Михайловна ЗАЙДМАН, Михаил Анатольевич САДОВОЙ, Елена Леонидовна СТРОКОВА
Новосибирский НИИ травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна Минздрава России 630091, г. Новосибирск, ул. Фрунзе, 17
Несмотря на многовековую историю существования идиопатического сколиоза (ИС), этиологический фактор патологии остается неизвестным. В представленной работе впервые показано, что асимметрия роста и формирование деформации позвоночника связаны с нарушением феногенотипа клеток пластинок роста (ПР) тел позвонков больных ИС. Цель исследования - идентификация генофенотипа клеток ПР тел позвонков больных ИС. Материал и методы. Клетки выделены из ПР тел позвонков с выпуклой и вогнутой сторон деформации у 50 оперированных больных с ИС, подвергнуты культивированию. Культивированные клетки были идентифицированы с помощью морфологических, нейроморфологических, иммуногистохимических методов и ПЦР анализа. Результаты. Клетки выпуклой стороны деформации идентифицированы как хондробласты. Клетки, выделенные из пластинок роста вогнутой стороны деформации, охарактеризованы как нейро- и глиобласты. Клетки формировали синапсы, содержали нейрофиламенты, экспрессировали нейральные и глиальные белки соответственно. На основании полученных результатов исследования предложены гипотезы трактовки клинических вариантов течения ИС. Рассмотрены возможные причины локализации клеток нейрального генеза на вогнутой стороне деформации. Заключение. Эктопическая локализация клеток производных нервного гребня в ПР тел позвонков является этиологическим фактором сколиотической болезни.
Ключевые слова: сколиоз, пластинка роста, нервный гребень, экспрессия белков, нейрофиламенты, синапсы, хондроциты.
История исследования сколиотической болезни уходит в глубокую древность. В V веке до н.э. Гиппократ впервые описал деформацию позвоночника: «изуродованное тело больного напоминает корявый древесный ствол с могучими ветвями - сильными руками и ногами и безобразным горбом». Гиппократ пытался понять механизм развития сколиоза путем наблюдения за больными, фиксируя на папирусе изменения в позвоночнике; по существу, это были первые истории болезни. В описаниях Гиппократ пытался ответить на вопросы: почему у одних больных «искривления» в верхних отделах позвоночника, а у других - в нижних, пытался найти причину «изуродованного позвоночника». Он впервые высказал предположение о семейной зависимости идиопатического сколиоза (ИС) - «признаки болезни заметны у дочери, но причины следует искать у матери» [7]. Методы лечения, применяемые Гиппократом, - это система гимнастики,
водные процедуры - «горячие термы», смягчающие мышцы. С целью профилактики легочных осложнений предлагалось громкое пение и дыхательные упражнения. Грубые формы деформации лечили при помощи вытяжения на основе тяг и противотяг. Из древности в обиход вошла замечательная «триада» Галена - «лордоз, кифоз и сколиоз», которая применяется ортопедами и в наши дни.
В эпоху Ренессанса были сделаны анатомические описания позвоночника (Рафаэль Санти, Альбрехт Дюрер, Мишель де Монтень, Мике-ланджело Буонарроти), но только Леонардо да Винчи подробно представил данные о строении и кровообращении позвоночника, систему мышц и сухожилий, что стало основой для дальнейших научных построений. На рисунках художника были изображены изменения позвоночника при движении тела. В этот период Гарвей провозгласил: «всякое исследование следует выводить из
Зайдман А.М. - д.м.н., проф., главный научный сотрудник, руководитель функциональной группы патоморфологии и теоретических исследований в вертебрологии лабораторно-экспериментального отдела, e-mail: [email protected]
Садовой М.А. - д.м.н., проф., директор института
Строкова Е.Л. - научный сотрудник функциональной группы патоморфологии и теоретических исследований в вертебрологии лабораторно-экспериментального отдела
его причины и, главным образом, из материальной действующей причины». В течение последующих столетий предпринимались попытки найти первопричину деформации позвоночника - этой тяжелой патологии, приводящей не только к косметическому дефекту, но и к нарушению функций дыхательной, сердечно-сосудистой систем. Возникали новые гипотезы (рахитическая [12], неврогенная [1], метаболическая [11], мышечная [3] и др.), на основе которых предлагались методы лечения, но сколиоз по-прежнему оставался «крестом ортопедии». Все гипотезы базировались в основном на анализе данных рентгенологии и макроморфологии. Морфологических сведений о структурных изменениях позвоночника при ИС в те времена еще не было.
Поиск этиологического фактора развития ИС был нами предпринят методом исследования структурных компонентов позвоночника у оперированных больных с деформациями позвоночника ГГ-ГУ степени. Этому способствовало расширение спектра оперативных вмешательств на позвоночнике. Это дало возможность впервые получить уникальные данные о структурных изменениях в пластинках роста (ПР) тел позвонков больных ИС ГГ-ГУ степени. Нами впервые установлено нарушение структуры ПР на вогнутой стороне деформации позвоночника у больных ИС. Известно, что в постнатальном периоде процесс роста продолжается за счет ПР - остатка эмбрионального хряща. В норме в периоды роста происходит пролиферация и дифференцировка хондробластов до полного остеогенного закрытия ПР. При сколиотической болезни эта закономерность оказалась нарушенной. Исследование показало, что в ПР на вершине вогнутой стороны деформации [6] локализовались малодифферен-цированные хондробласты, которые не проходили соответствующих стадий дифференцировки, пролиферации, остеогенеза, следовательно, не генерировали процесс роста [6]. На выпуклой стороне деформации процессы роста соответствовали возрастной норме. Причина асимметрии роста -в структурных изменениях ПР на вогнутой стороне деформации. Несостоятельно объяснение этого процесса неравномерной нагрузкой на выпуклую и вогнутую стороны деформации, потому что и на ранних стадиях сколиоза, и при грубых деформациях позвоночника морфологические изменения однотипны [10].
В 60-70 годы XX столетия господствующей стала генетическая теория ИС. С целью определения роли генетических факторов в развитии ИС нами были обследованы семьи алтайской и сибирской популяций, в которых пробанд страдал сколиозом [10]. Последующий сегрецион-
ный анализ на репрезентативной выборке родословных показал майоргенную зависимость ИС. Это означало, что в отсутствие мутантного гена ИС не развивается [12]. В крови обследованных больных и их родственников исследована возможная мутация гена агрекана - самого представительного протеогликана хрящевой ткани ПР тел позвонков. Выбор гена агрекана был основан на морфологических исследованиях нарушения синтеза сульфатсодержащих протео-гликанов хондроцитами ПР при ИС [4]. Исследования, однако, не выявили заинтересованности гена агрекана в этиологии ИС [21]. В последующие годы были созданы модели ИС на животных [2, 5, 15, 16]. Продолжался поиск маркеров этиологического фактора ИС клиническими, морфологическими, биохимическими методами с целью создания возможной доклинической диагностики патологии. Несмотря на эти усилия, оставалась неясна первопричина ИС. Возник вопрос: почему огромное количество репрезентативных генетических исследований не выявило гена/генов, причастных к ИС? На основании многолетних исследований (более 1000 препаратов больных ИС) высказано предположение о нарушении экспрессии генов в клетках ПР тел позвонков больных ИС.
Асимметричное изменение функции хондро-бластов в органе роста позвоночника - основного патогенетического признака ИС - предположительно могло быть обусловлено нарушением генетической регуляции функционирования клеток. Логично предположить, что асимметрия роста связана с нарушением экспрессии гена/ генов, регулирующих процессы, связанные с функционированием хондробластов на вогнутой стороне деформации. С этой целью методом ПЦР в реальном времени предпринято исследование экспрессии основных генов, сопряженных с ростом (IHH, Pax9, Sox9), синтезом матрикса и метаболизмом (ACAN, GUM, VCAN, COL1, COL12, HALPN1), гены сульфатирования и трансмембранного транспорта (DTDS1, CHST1, CHST3) [20]. Тем более что огромное количество генетических исследований крови больных, проводимых на самом высоком методическом уровне, не выявили связи с этиологией ИС. Анализ экспрессии 14 генов в ПР показал, что синтез коровых белков протеогликанов сохранен, но нарушен синтез линк-белка. Функция ростовых транскрипционных факторов, не реагирующих на сигналы пролиферации и дифференцировки, также нарушена. Факторный анализ выявил выраженные отличия фенотипа хондробластов ПР больных ИС от нормы [20]. Возникла необходимость в идентификации феногенотипа этих клеток.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Идентификация фенотипов клеток ПР тел позвонков больных ИС производилась методом их культивирования дифференцированно из выпуклой и вогнутой сторон деформации. Основанием для подобного подхода были данные Кнорре о том, что клетки в процессе культивирования проходят ранние стадии дифференцировки [9]. Объектом исследования послужили ПР тел позвонков 50 детей 11-15 лет с ИС III-IV степени, оперированных в клинике детской ортопедии Новосибирского НИИ травматологии и ортопедии. Образцы забирали в стерильные пробирки, содержащие 0,9%-й физиологический раствор и 20 мкг/мл гентамицина (Микроген). Гиалиновый хрящ ПР отмывали в физиологическом растворе, измельчали в чашке Петри с минимальным объемом среды RPMI (Биолот) до размеров 1-2 мм2, затем помещали в раствор 1,5%-й коллагена-зы (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США) в си-ликонизированной посуде и культивировали в СО2-инкубаторе при температуре 37 °С в течение 22-24 ч. Полученную суспензию клеток пропускали через нейлоновый фильтр для удаления кусочков ткани и осаждали клетки центрифугированием в течение 10 мин при 2000 об./мин.
Выделенные клетки культивировали в среде DMEM F12 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, США) с добавлением 15% FBS (эмбриональной телячьей сыворотки) (Gibco), стрептомицина (Биолот), пенициллина (Биолот) и амфотерицина В (Биолот) в С02-инкубаторе при 37 °С. В качестве культуральной посуды использовали пластиковые чашки Петри диаметром 60 мм. На дно культуральной посуды укладывали покровные стекла для последующих морфологических исследований. Выделение, посев и культивирование клеток осуществляли дифференцированно в соответствии с указанной высотой и стороной деформации. Клетки культивировали в течение 14 сут, среду меняли 1 раз в трое суток. Клетки не пассировали. Для морфологических исследований клетки извлекали в период от 5 до 21 суток; фиксировали в 70° спирте и окрашивали: гематоксилином, эозином, альциановым синим, по Кохалу и Нисслю.
Для исследований методом электронной микроскопии на 14-е сутки культивирования культуру хондроцитов пассировали смесью растворов трипсина (Биолот) и Версена (Биолот) в соотношении 1:1. Действие веществ инактивирова-ли средой DMEM F12 с добавлением 15 % FBS, стрептомицина, пенициллина и амфотерицина В. Клеточную суспензию центрифугировали 10 мин со скоростью 1 200 об./мин, ресуспендировали в
1 мл среды. В 12-луночном планшете размещали подложки и силиконизированные стерилизованные чипсы (Agar, Германия) для электронной микроскопии (по одной в лунку). Клетки сеяли в концентрации 10 мкл - на подложки и 5 мкл - на чипсы. Адгезию клеток контролировали в течение двух часов. В лунки с чипсами и пленками добавляли по 2 мл среды, оставляли на сутки. Образцы на чипсах для сканирующей электронной микроскопии фиксировали 2,5%-м глутаровым альдегидом, разведенным на среде для культивирования, в течение 15 мин, после чего переносили в раствор 2,5%-го глутарового альдегида на 0,1М какодилатном буфере и фиксировали в течение часа. После отмывки в двух сменах 0,1М какодилатного буфера образцы фиксировали в 1%-м растворе тетраокиси осмия, приготовленном на дистиллированной воде, отмывали в двух сменах воды, помещали в специальный держатель и дегидратировали, инкубируя по 10 мин в растворах спиртов возрастающей концентрации (30, 50, 70 и 100 %). Затем образцы высушивали по методу критической точки в приборе Critical Point Dryer (BAL-TEC, Лихтенштейн) и исследовали в сканирующем электронном микроскопе (Zeiss, Германия) до и после напыления хромом толщиной 1 нм в атмосфере аргона (Coating Unit, Leica Microsystems, Австрия). Анализ проводили при увеличении х 1000-30000 и ускоряющем напряжении 30kV.
Фиксацию клеток на специальных пластиковых подложках проводили в 2,5 %-м растворе глутарового альдегида на 0,1М какодилатном буфере (pH 7,4) в течение 1 ч, после чего материал отмывали в трех сменах 0,1М какодилатно-го буфера (pH 7,4). Образцы постфиксировали в 1%-м растворе тетраоксида осмия с добавлением 0,8%-го ферроцианата калия на том же буфере в течение 1 ч. После трехкратного отмывания дистиллированной водой клетки оставляли на ночь в 1%-м водном растворе уранилацетата при температуре 4 °С. На следующий день образцы отмывали водой и обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (по 5 мин в 30- и 50%-м, по 10 мин в 70-, 96- и 100%-м растворах этанола). Затем клетки дополнительно обезвоживали в ацетоне (2 раза по 20 мин) и пропитывали смесью смолы, включающей 4 компонента (Epon 812, DDSA, MNA и DMP-30) по следующей схеме: 1 объем смолы : 2 объема ацетона - 1 ч; 1 объем смолы : 1 объем ацетона - 2 ч; 2 объема смолы : 1 объем ацетона - 2 ч; чистая смола - 2 ч; чистая смола - 1 ч. Далее проводилась заливка образцов в формы из фольги и инкубация в течение ночи в эксикаторе с CaCl2 (для удаления пузырьков воз-
духа из смолы). Для полимеризации образцы помещались в термостат на +60 °С на 3 сут.
Процедуру иммуногистохимического исследования выполняли в соответствии с рекомендациями производителей антител. Срезы депа-рафинизировали и производили демаскировку антигенов тканей в модуле РТ Link (Dako, Дания) в цитратном буфере (pH 9,0) при температуре 95 °С в течение 60 мин. Затем блокировали эндогенную пероксидазу 3%-м раствором H2O2, проводили протеиновый блок сывороткой. Далее при температуре 22 °С в течение 30 мин инкубировали срезы ткани и клетки с антителами: кроличьими поликлональными к S100 (Dako), мышиными моноклональными к синаптофизину (клон DAK-SYNAP, Dako), мышиными моноклональными к белку нейрофиламента (NF, клон 2F11, Dako), глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP) (клон N1506, rabbit polyclonal, Dako). Все антитела разводили согласно указаниям фирмы-производителя. Для визуализации иммуноморфо-логической реакции использовали полимерную систему детекции EnVision FLEX Systems (Dako). Последним этапом докрашивали ядра клеток гематоксилином.
Для исследования методом флуоресцентной иммуногистохимии культивированные клетки фиксировали в 4%-м растворе формалина в течение 10 мин, затем отмывали от формалина натрий-фосфатным буфером в течение 10 мин. После отмывки клетки на предметных стеклах держали в 4%-м растворе тритона Х100 в течение 15 мин, вновь промывали натрий-фосфатным буфером 30 мин. Гибридизацию проводили раствором бычьего сывороточного альбумина во влажной камере в течение 5-30 мин. Клетки окрашивали первичными антителами к нейронально-му Р-тубулину класс III и к нейрофиламенту 200 (NF-200). Вторичные антитела, используемые в эксперименте: у1 green X 488 и у2а red X 568. Ядра подкрашивали DAPI.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Культивированные клетки, выделенные из наружных отделов ПР на высоте деформации, формировали монослой. Это были крупные округлые клетки с центрально расположенным ядром и 1-2 ядрышками (рис. 1, А). Хроматин был диспергирован. Цитоплазма интенсивно окрашивалась альциановым синим и содержала гранулы гликогена. Ультраструктурно: клетки с центрально-расположенным ядром и с инвагинатами. В цитоплазме комплекс Гольджи с диктосомами и множественными везикулами, расположенными как диффузно, так и вблизи плазматической
мембраны. Митохондрии с хорошо выраженными кристами, эндоплазматическая сеть с расширенными цистернами. Промежуточные филамен-ты расположены приядерно (рис. 1, Б). Вокруг клеток локализованы коллагеновые волокна и протеогликаны, формирующие контакты с коллагеном. Иммуногистохимически: в клетках наблюдалась экспрессия белков, агрекана, хондроитин-сульфатов А и С, коллагенов Г и II типов и Sox9 (рис. 1, В, Г). Эти клетки были идентифицированы как хондробласты.
На вогнутой стороне деформации выявлялись клетки двух фенотипов.
Первый тип - крупные мульти-, би- и псевдоуниполярные клетки с длинным отростком (аксоном) и ветвящимися короткими дендритами (рис. 2, А). Ядра в этих клетках были центрально расположены, а в цитоплазме клеток определялась субстанция Ниссля (рис. 3, А), экспрессия нейроспецифических белков: NF-1, Р-тубулин ГГГ, NF-200 (рис. 2, В, Г). Здесь же определялись унии биполярные клетки с окаймляющей ядро цитоплазмой, формирующей от обоих полюсов длинные отростки. Между отростками и клетками были сформированы связи. Цитоплазма клеток обнаруживала позитивные реакции со специфическими антителами к клеткам нервного гребня: Р-тубулину ГГГ, ОТ-200.
Ультраструктура (трансмиссионная микроскопия). Клетки имели вогнутую форму с крупным округлым ядром и 1-2 ядрышками. От тела клетки отходил длинный аксон, на котором локализовались множественные аксонные холмики в виде выпячивания мембраны. Шипики (аксонные холмики) содержали вакуоли в виде светлых пузырьков. Между аксонами и сомой клеток обнаруживались контакты - формирующиеся синапсы. По обе стороны синаптических мембран определялись вакуоли. В цитоплазме содержались гранулярные структуры, возможно, белковые включения. Эндоплазматический ретикулум (ЭПР) с плотным матриксом и узкими, удлиненными цистернами. Митохондрии характерной вытянутой формы с тонкими разветвленными кристами. Широко представлен аппарат Гольджи с диктосо-мами и вакуолями (рис. 2, Б). В отростках клеток располагались нейрофиламенты и стопки шероховатого ЭПР, подобного тельцам Ниссля. Наличие формирующихся синапсов с вакуолями в пресинаптической мембране и экспрессия ней-ральных белков и нейрофиламентов в цитаплазме клеток явились аргументом в пользу нейраль-ного генеза этих клеток. Кроме того, на поверхности отростков и на телах клеток определялись аксонные холмики «шипики», содержащие вакуоли.
Рис 1. А - монослой культивированных хондробластов (выпуклая сторона деформации позвоночника). Окраска гематоксилином и эозином, ув. 10 х 60. Б - ультраструктура хондробласта с выпуклой стороны ПР тела позвонка на вершине деформации больного ИС: а - общий вид клетки, содержащей ядро с инвагинациями и большое скопление промежуточных филаментов в цитоплазме; б, в - митохондрии с короткими поперечными кристами; узкие (б) и расширенные (в) цистерны шероховатого ЭПР; г - диктиосомы аппарата Гольджи; масштаб: а - 2 мкм, б-г - 0,5 мкм. В, Г - иммуногистохимическая реакция на коллаген I типа (В, зеленый), агрекан (Г, красный)
Второй тип - крупные клетки с центрально-расположенными ядрами и многочисленными разветвленными отростками на мембранах. В цитоплазме этих клеток наблюдалась экспрессия белка астроцитарной глии S100. Здесь же обнаруживались овальные клетки с длинными цито-плазматическими отростками, формирующими многочисленные контакты. Цитоплазма клеток позитивно окрашивалась по Гомери и Кохалу. Реакция с антителами на глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) была положительной (рис. 3, Б). На электронограммах: многоотрос-чатые клетки, за счет которых сформированы многочисленные связи. ЭПР широко представлен. Аппарат Гольджи с многочисленными везикулами и экзоцитозными пузырьками. В мито-
хондриях широкие кристы и плотный матрикс. Нейрофиламенты в цитоплазме отсутствуют, но определяется большое количество филаментов.
Сканирующая электронная микроскопия. На вогнутой стороне деформации определялись клетки вытянутой формы с длинными отростками, образующие контакты. Между клетками сформирован синапс и крупный «шипик». Многочисленные «шипики» на отростках нейронов (не напыленный препарат) (рис. 3, В).
ОБСУЖДЕНИЕ
Идентификация феногенотипов клеток ПР выпуклой и вогнутой сторон деформации больных ИС показала, что на выпуклой стороне де-
Рис. 2. А - клетки нейрального генеза в культуре клеток вогнутой стороны (нативный препарат, ув. 10 х 40. Б -микрофотография культивированных клеток, выделенных из ПР тел позвонка (вогнутая сторона вершины деформации) больного ИС: а, б - нейроноподобные клетки вытянутой формы и длинным отростком (аксоном), многочисленные электронно-плотные гранулы вокруг ядер (n) и в цитоплазме клеток, формирующиеся на аксонах шипики; в - формирующийся контакт между отростком одной клетки и телом другой, многочисленные везикулы в месте контакта (стрелка); г - шипики, формирующиеся на теле и отростках клеток; д - фрагмент цитоплазмы одной из клеток культуры с развитым шероховатым ретикулумом (rer) и комплексом Гольджи (g); е - фрагмент аксона с обширной сетью нейрофиламентов (nf), пронизывающих отростки клеток, а также вытянутые митохондрии (М). Масштаб: а, б - 10 мкм, в-е - 1 мкм. Иммуногистохимические реакции на нейральные антитела в культивированных клетках вогнутой стороны деформации позвоночника (ИС): В - NF 200 (зеленый), Г - ß-тубулин III (красный)
формации локализуются клетки мезенхимально-го генеза - хондробласты, на вогнутой - клетки нейрального генеза: нейро- и глиобласты, производные нейроэктодермы. Об этом свидетельствуют нейроморфологические данные - ультраструктурная организация клеток, экспрессия тканеспецифических белков и протеогликанов. Наличие нейральных клеток в ПР больных ИС выявлено нами впервые. В доступной мировой литературе подобных данных не обнаружено.
Естественный вопрос: каким образом клетки нейрального генеза оказались в мезенхимном производном ПР тела позвонка? Обратимся к эмбриологии. На ранних стадиях эмбриогенеза (гаструляции) от нервной трубки отделяются клетки нервного гребня, которые мигрируют по эмбриону и в конечном итоге формируют вегетативную нервную систему, мозговое вещество надпочечников, ганглии, лицевой скелет и т.д. [8]. Миграция клеток нервного гребня осуществляет-
200 нм ЕНТ = 20.00 кУ 81япа1А=8Е1 Оа1е: 25 .Тип 2014 1-1_Ш) = 7.0тт_РЬоЮ N0 = 1200_Ма§ = 55.23 КХ
Рис. 3. а - культура клеток (ИС, вогнутая сторона на вершине деформации); окраска по Нисслю, ув. х 400; б - иммуногистохимические реакции на глиальный фибриллярный кислый белок, ув. х 200; в - сканирующая микроскопия. Нейроны в культуре клеток, полученной из ПР тела позвонка (вогнутая сторона вершины деформации) больного ИС (не напыленный препарат). Сформированные контакты между двумя клетками. Виден также синапс и крупный шипик. В цитоплазме нейронов, а также в отростках присутствуют небольшие плотные гранулы от 300 до 500 нм в диаметре. Масштабная линейка составляет 200 пт
ся по трем путям, один которых проходит через склеротом [9]. На выходе из склеротома клетки нервного гребня формируют чувствительные ганглии.
Наличие клеток нервного гребня в ПР вогнутой стороны деформации больных ИС вызвало вопрос о возможных нарушениях миграции и «депонировании» клеток нервного гребня в формирующемся позвоночнике. Известно, что траектория движения клеток нервного гребня осуществляется по субстрату, синтезируемому клетками склеротома под влиянием экспрессии гена РахЗ [14]. Поэтапный синтез версиканов определяет поступательное движение клеток нервного гребня. В процессе движения клеток нервного гребня происходит асимметричный синтез индукторов (версиканов) и ингибиторов (агрека-на), что определяет траекторию их движения [18]. Ингибирование агреканами обусловлено ограничением диспергирования клеток нервного гребня за счет боковых цепей гликозаминоглика-на агрекана [19]. Клетки нервного гребня в процессе миграции индуцируют в склеротоме процесс хондрогенеза, его удаление [13] приводит к формированию уродливого ганглия, что свидетельствует об определенной взаимозависимости морфогенеза позвоночника и ганглиогенеза [20]. Существующий тропизм этих двух структур ставит вопрос о степени нарушения функции чувствительных ганглиев при ИС. Эти данные могут быть диагностическим признаком ИС, особенно на ранних стадиях формирования деформации позвоночника.
Ингибирование миграции клеток нервного гребня может быть связано с мутацией гена РахЗ и нарушением синтеза версиканов вдоль миграционного пути. Подобные предположения базируются на исследованиях КгиП [15]: нарушение секреции версиканов приводит к остановке миграции клеток нервного гребня. Необходимо выяснить, каким образом на вогнутой стороне деформации определяются малодифференциро-ванные хондроциты. Известно, что клетки нервного гребня в зонах конечной миграции приобретают фенотип клеток среды, в которую они мигрируют, но генотип остается исходным [17]. Клетки нервного гребня, находясь в ПР вогнутой стороны деформации, не детерминированы к процессу роста. Продолженный рост по выпуклой стороне деформации позвоночника приводит к асимметрии роста.
Анализ дифференцированного культивирования клеток ПР тела позвонков 50 больных ИС позволил выявить причины нарушения роста и формирования деформации позвоночника при ИС и предложить гипотезу, объясняющую вари-
анты клинических проявлений ИС, дать определение сколиотической болезни. Сколиотическая болезнь - нарушения морфогенеза позвоночника в раннем эмбриогенезе, реализуемые на стадии роста в сколиотическую болезнь с клиническими вариантами течения, зависящими от степени нарушения морфогенеза.
Вариабельность клинических вариантов деформации позвоночника при ИС до сих пор не находила объяснений. Известно, что существует две группы сколиотической болезни: одна из них прогрессирует, а вторая остается на стадии ско-лиотической осанки. На основании настоящих исследований можно заключить, что процесс прогрессирования определяется количеством депонированных в склеротоме клеток, так как их критическое количество определяет степень последующего нарушения морфогенеза позвоночника и формирования соответствующей клинической формы сколиоза.
До сих пор остается необъясненным клиническое проявление преимущественно правосторонней грудной деформации позвоночника при ИС. Наша гипотеза: так как миграция клеток нервного гребня происходит на стадии формирования четырех грудных сомитов в растрально-вентраль-ной части склеротома, то нарушение движения и депонирования клеток в этом отделе реализуется в процессе роста в правостороннюю грудную деформацию позвоночника при ИС. Приоритет развития ИС у девочек, вероятнее всего, связан с разными временными параметрами миграции клеток нервного гребня и формирования склеро-тома у мальчиков и девочек.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, этиологическим фактором сколиотической болезни является эктопическая локализация клеток, производных нервного гребня, в ПР тел позвонков, генетически не детерминированных к хондрогенной дифференцировке и процессу роста. Локальное нарушение хондро-генеза в ПР тел позвонков больных ИС является причиной асимметрии роста и формирования деформации позвоночника. В настоящее время создается экспериментальная модель деформации позвоночника, на которой будут подтверждены или отвергнуты представленные гипотезы.
БЛАГОДАРНОСТИ
Авторы выражают искреннюю благодарность за многолетнее сотрудничество и ценные советы при выполнении исследований - Бородину Павлу Михайловичу, Серову Олегу Леонидовичу, Аксе-
нович Татьяне Иосифовне; за помощь в проведении ультраструктурных исследований - Киселевой Елене Владимировне.
Исследования проводились в рамках комплексных НИР Новосибирского НИИ травматологии и ортопедии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Абальмасова Е.А., Левая Н.В. Сколиоз и кифоз // Актуальные вопросы травматологии и ортопедии. М., 1977. 19. 7-12.
2. Агафонов Ю.А. Экспериментальный сколиоз // Ортопедия, травматология и протезирование. 1978. 12. 1-7.
3. Вреден Р.Р., Козловский А.А. Сколиоз или боковое искривление позвоночника // Практическое руководство по ортопедии. Л., 1936. 347-368.
4. Зайдман А.М. Идиопатический сколиоз. Морфология, биохимия, генетика. Новосибирск, 1993.
5. Зайдман А.М., Фалк И.Г. Исследование структур позвоночника при некоторых гормональных воздействиях // Патология позвоночника. Л., 1976. 112-114.
6. Зайдман А.М. Молекулярно-генетические механизмы развития сколиоза // Мат. Европейского конгр. ревматологов. Сочи, 1987. 52-54.
7. История медицины / ред. Б.Д. Петров. М., 1954. 1. 64 с.
8. Карлсон Б.М. Основы эмбриологии по Пэтте-ну. М., 1983.
9. Кнорре А.Г. Эмбриональный гистогенез. Л., 1971.
10. Цивьян Я.Л., Зайдман А.М. Морфогенез сколиоза. Новосибирск: Наука, 1978. 141 с.
11. Чаклин В.Д. К хирургии позвоночника // Ортопедия, травматология и протезирование. 1960. (7). 3-13.
12. Axenovich T.I., ZaidmanA.M., ZorkoltsevaI.V., Tregubova I.L., Borodin P.M. Segregation analysis of
idiopathic scoliosis, demonstration of a major gene effect // Am. J. Med. Genet. 1999. 86. (4). 389-394.
13. Bundy J., Rogers R., Hoffman S., Conway S.J. Segmental expression of aggrecan in the non-segmented perinotochordal sheath underlies normal segmentation of the vertebral column // Mech. Dev. 1998. 79. (1-2). 213-217.
14. Henderson D.J., Ybot-Gonzalez P., Copp A.J. Over-expression of the chondroitin sulphate proteoglycan versican is associated with defective neural crest migration in the Pax3 mutant mouse (splotch) // Mech. Dev. 1997. 69. (1-2). 39-51.
15. Krull C.E. Inhibitory interactions in the patterning of trunk neural crest migration // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1998. 857. 13-22.
16. Krull C.E., Collazo A., Fraser S.E., Bronner-Fraser M. Segmental migration of trunk neural crest: time-lapse analysis reveals a role for PNA-binding molecules // Development. 1995. 121. (11). 3733-3743.
17. Martin J.F. Expression of Cre Recombinase in the developing mouse limb bud driven by Prs1 enhancer // Jenesis. 2002. 33. (2). 77-80.
18. Peris R., Perissinotto D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration // Mech. Dev. 2000. 95. 3-21.
19. Pettway Z., Domowicz M., Schwartz N.B., Bronner-Fraser M. Age-dependent inhibition of neural crest migration by the notochord correlates with alterations in the S103L chondroitin sulfate proteoglycan // Exp. Cell Res. 1996. 255. 195-206.
20. Zaidman A.M., Zaidman M.N., Strokova E.L., Lebedeva A.O., Laktionov P.P., Sadovoy M.A. Analysis of expression of candidate genes - an etiologic factor of idiopathic scoliosis // PLOS One. In Press.
21. Zorkol'tseva I.V., Liubinskii O.A., Shari-pov R.N., Zaidman A.M., Aksenovich T.I., Dymshits G.M. Analysis of polymorphism of the number of tandem repeats in the aggrecan gene exon G3 in the families with idiopathic scoliosis // Rus. J. Genetics. 2002. 38. (2). 259-263.
SCOLIOSIS: A 50-YEAR EXPERIENCE OF RESEARCH
Alla Mikhaylovna ZAYDMAN, Mikhail Anatolyevich SADOVOY, Elena Leonidovna STROKOVA
Novosibirsk Research Institute of Traumatology and Orthopaedics n.a. Ya.L. Tsivyan 630091, Novosibirsk, Frunze str., 17
Despite the centuries-old history of the existence of idiopathic scoliosis, the etiologic factor of the pathology remains unknown. In the presented work it is shown for the first time that the asymmetry of growth and the formation of spinal deformity is associated with the phenotype violation of the growth plate cells of vertebral bodies in patients with idiopathic scoliosis. Objective: to identify the gene phenotype of the growth plate cells of the vertebral bodies in patients with idiopathic scoliosis. Material and methods. The cells were isolated from vertebral body growth plates on convex and concave sides of deformity in 50 operated patients with idiopathic scoliosis, and cultured. Cultured cells were identified by methods of morphology, neuromorphology, immunohistochemistry and PCR analysis. Results. The growth plate cells from the convex side of deformity were identified as chondroblasts. Those cells from the concave side were identified as neuro- and glioblasts. These cells formed synapses, contained neurofilaments, and expressed neural and glial proteins, respectively. Based on the results of the study, hypotheses were proposed on variations of clinical course of idiopathic scoliosis. Probable causes of localization of neural genesis cells on the concave side of the deformity are discussed. Conclusion. Ectopic localization of the neural crest-derived cells in the vertebral body growth plate is the etiological factor of scoliotic disease.
Key words: scoliosis, the growth plate, neural crest, protein expression, neurofilament, synapses, and chondrocytes.
Zaydman A.M. - doctor of medical sciences, professor, honored worker of science, chief researcher, head of the functional groups ofpathomorphology and theoretical studies in spine surgeries of the laboratory-experimental department, e-mail: [email protected] Sadovoy M.A. - doctor of medical sciences, professor, director
Strokova E.L. - researcher of the functional groups ofpathomorphology and theoretical studies in spine surgeries of the laboratory-experimental department
