Синтез полимерных суспензий с ионами металлов на поверхности частиц для иммунохимических исследований Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия А, 2004, том 46, № 9, с. 1471-1478

СИНТЕЗ,

- ХИМИЧЕСКИЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ

УДК 541.64:546(3+4)

СИНТЕЗ ПОЛИМЕРНЫХ СУСПЕНЗИЙ С ИОНАМИ МЕТАЛЛОВ

НА ПОВЕРХНОСТИ ЧАСТИЦ ДЛЯ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

© 2004 г. Н. И. Прокопов, Д. Н. Вовк, И. А. Грицкова

Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова

117571 Москва, пр. Вернадского, 86 Поступила в редакцию 21.01.2004 г. Принята в печать 12.05.2004 г.

Изучена гетерофазная сополимеризация стирола и металлосодержащих мономеров и показана возможность получения полимерных микросфер, содержащих на поверхности ионы металлов. Методом электронно-зондового анализа определена концентрация ионов металлов на поверхности частиц и установлена зависимость концентрации ионов металла на поверхности полимерных микросфер от способа проведения полимеризации. Создана высокоспецифичная и чувствительная диагностическая тест-система на сальмонеллез.

ВВЕДЕНИЕ

В последнее время полимерные суспензии с узким распределением частиц по размерам широко используют в качестве носителей биолигандов (антигенов или антител) при создании высокочувствительных и обладающих необходимой избирательностью диагностических тест-систем [1]. Применяют несколько типов связывания биомолекул с полимерными частицами: физическая адсорбция, ковалентное связывание с функциональными группами на поверхности микросфер, присоединение к микросферам, предварительно покрытым слоем белка (например, Protein А или Streptavidin).

Каждый из указанных методов имеет преимущества и недостатки. Простота и гибкость метода физической адсорбции сделали его наиболее распространенным. Однако в дальнейшем использование этого метода было ограничено малой воспроизводимостью результатов, обусловленной, по мнению авторов работы [2], десорбцией в водную фазу белка, физически адсорбированного на гидрофобной поверхности частиц даже при небольшом изменении условий (рН, ионной силы раствора, температуры и т.д.). Это существенно снижает чувствительность и приводит к неспецифическим реакциям с другими биологическими объектами.

E-mail: prokopov@mitht.ru (Прокопов Николай Иванович).

Свободными от перечисленных выше недостатков оказались полимерные суспензии, содержащие частицы с функциональными группами на поверхности, способные к ковалентному связыванию биолигандов. Такие полимерные суспензии синтезируют сополимеризацией стирола, акриловой и метакриловой кислот, акриламида, ви-нилпиридина и т.д. Полимерные микросферы, полученные таким образом, имеют следующие преимущества по сравнению с гидрофобными, не содержащими на поверхности реакционноспособ-ных функциональных групп.

1. Отсутствие неспецифической адсорбции биолигандов вследствие гидрофильности поверхности частиц.

2. Отсутствие десорбции белковых молекул с поверхности частиц.

3. Возможность ковалентного связывания биолигандов, плохо сорбирующихся на поверхность гидрофобных частиц.

4. Возможность оптимальной ориентации биолигандов на поверхности частиц, обеспечивающей сохранение их биологической активности.

Величина адсорбции биолигандов, чувствительность, селективность и специфичность создаваемого диагностикума зависят как от природы функциональных групп и структуры поверхности полимерной частицы, так и от природы и струк-

туры самого биолиганда. Поэтому невозможно создать универсальный полимерный носитель, на поверхность которого иммобилизуются биоли-ганды различной природы. Следовательно, практически для каждого конкретного биолиганда требуется своя "оптимальная" полимерная суспензия с определенными функциональными группами, размером, распределением частиц по размерам, структурой и степенью гидрофильности поверхности. Эти свойства полимерных микросфер зависят от метода синтеза полимерной суспензии. Поэтому актуальны все исследования, направленные на создание способов регулирования свойств межфазной поверхности, определяющих возможности использования полимерных микросфер в качестве носителей биолигандов.

Одним из перспективных направлений в данной области является синтез полимерных микросфер, содержащих на поверхности ионы металлов [3-6], которые способны к связыванию биолигандов за счет комплексообразования.

Цель настоящей работы - получение металло-содержащих полимерных суспензий, пригодных для иммунохимических исследований. Такие полимерные суспензии получали двумя способами -безэмульгаторной и затравочной сополимериза-цией стирола и металлосодержащих мономеров. В качестве затравочных частиц использовали предварительно синтезированные микросферы полистирольной суспензии.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Мономеры, воду, инициаторы очищали по методикам [7]. Металлосодержащие мономеры синтезировали как в работе [8]. Полимерные суспензии получали в стеклянном реакторе, снабженным теплообменной рубашкой, двухрядной стеклянной пропеллерной мешалкой и системой для продувки инертного газа (азота или аргона) [9]. Концентрацию ионов металлов на поверхности полимерных микросфер определяли методом электронно-зондового анализа с использованием растрового электронного микроскопа JSM-35 (Япония) и рентгеновского спектрометра LINK-860 с Si/Li- детектором.

Микрофотографии полимерных дисперсий получали с помощью электронного сканирующего микроскопа S-570 "Hitachi". Средний размер час-

тиц полимерных дисперсий, распределение по диаметрам и ^-потенциалам определяли методами электронной сканирующей микроскопии и фотон-корреляционной спектроскопии на приборах "Malvern" и "Autosizer".

Содержание остаточного стирола в полученных латексах оценивали по методике [10] с использованием спектрофотометра "Unicam SP 500".

Очистку полимерных суспензий, определение содержания полимера в суспензии и устойчивости полимерных суспензий к электролитам, получение тест-систем и их испытание проводили по методикам [9, 10].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования были начаты с получения полимерных микросфер, содержащих на поверхности ионы металлов, способные образовывать координационные связи с биолигандами различной природы.

Были предложены три способа синтеза полимерных суспензий.

1. Безэмульгаторной сополимеризацией при единовременном введении всех компонентов рецепта.

2. Безэмульгаторной сополимеризацией стирола при введении металлосодержащих мономеров на разных степенях конверсии стирола.

3. Затравочной сополимеризацией стирола и металлосодержащих мономеров на предварительно синтезированных методом безэмульгаторной полимеризации полистирольных микросферах.

В качестве металлосодержащих соединений использовали метакрилаты лития, калия, натрия, а также переходных металлов (цинка, меди и кобальта). Указанные металлосодержащие мономеры нашли самое широкое применение для получения металлополимеров благодаря доступности реагентов и особенным свойствам образующихся продуктов полимеризации. В "чистом" виде ионная связь в приведенных выше металлосодержащих мономерах образуется лишь в солях щелочных металлов (Li, К, Na). В мономерах на основе переходных металлов (Zn, Си, Со) связь металла с

карбоксилатной группой является координацион-но-ионной:

Конверсия, 100

сн3о

I II

н2с=с—с.

где М1 = Ы, К или Ыа.

СН30

о-мг

о

СН3

I " II II I

Н2С=С—С. 2+ Г—с=сн2 2 ^о-мг-о

где М12+ = Ъа или Си.

<гНз

Н2С=С—С. М1 1С—С=СН2 '

о"' "о

где М(:2+ = Со.

Отличительная черта металлосодержащих мономеров этого типа - легкость перехода между неионизованными и различными видами ионизованных состояний (ионные пары различной степени сольватации, свободные ионы).

Полимерные суспензии, получаемые гетеро-фазной полимеризацией в отсутствие эмульгатора, привлекают внимание исследователей тем, что полимерные микросферы имеют "чистую" поверхность. Опираясь на полученные ранее данные о коллоидно-химических свойствах полистирол ьных микросфер [11], была проведена сопо-лимеризация стирола с метакрилатами лития, калия, натрия, меди и цинка в отсутствие эмульгатора. Полимеризацию осуществляли при соотношениях фаз мономер: вода (по массе) = = 100 : 1000 и 100 : 450 в течение 24 ч при 70°С для получения частиц разного размера, что позволило использовать их для слайд-тестов и постановки экспресс-анализа реакции латекс-агглютинации в иммунохимических планшетах. Выбор оптимальной концентрации вводимого металлосодержа-щего мономера (0.4 мае. ч.) обусловлен тем, что при больших концентрациях наблюдается значительная потеря агрегативной устойчивости образующихся частиц.

Анализ полученных кинетических кривых полимеризации (рис. 1) показал, что скорость сопо-лимеризации стирола с метакрилатами данных металлов значительно ниже скорости гомополи-меризации стирола. Характер кривых конверсия-время по сравнению с гомополимеризацией сти-

Рис. 1. Конверсия стирола в процессе его без-эмульгаторной полимеризации в присутствии метакрилатов Zn, 1л, К и Ыа. Номера кривых соответствуют 8Ь-Ка-1 (/), БЬ-К-1 (2), 8Ь-1л-1 (3), БЬ-4 (4), (5) и БЬ-гп-! (6).

рола существенно не изменился и при введении в систему метакрилата цинка. Следует отметить, что наблюдается некоторое увеличение скорости полимеризации стирола в присутствии метакрилата цинка, что, вероятно, связано с непосредственным участием металла в элементарных актах сополимеризации. Изучение констант со-полимеризации стирола и метакрилатов переходных металлов [8] показало, что константа сополимеризации стирола во всех случаях выше, чем металлосодержащих мономеров, и наблюдается тенденция к статистическому распределению звеньев в сополимерной цепи. Сополимери-зация стирола со всеми металлосодержащими мономерами проходит до конверсии менее 80%.

Методом рентгеновской электронной спектроскопии не удалось зафиксировать ионы металлов на поверхности синтезированных микросфер. Это можно объяснить тем, что металлосодержа-щие мономеры при таком способе введения в по-лимеризационную систему вступают в реакцию на начальном этапе, сополимеризуясь с основным мономером, и в результате ионы металлов оказываются внутри полимерной частицы.

Для локализации ионов металлов на поверхности частиц полимерных суспензий, был предложен иной способ синтеза - введение металлосодержащих мономеров в реакционную систему

Таблица 1. Рецептуры безэмульгаторной полимеризации при введении метакрилата цинка на различных степенях конверсии стирола

Суспензия Метакрилат цинка, мае. ч. Стирол, мае. ч. Вода, мае. ч. Персульфат калия, % на водную фазу Т\уееп 40*, мае. ч.

8Ь2п-(1,2,3,6) 0.40 100 1000 0.20 1.0

0.15 100 1000 0.20 1.0

БЬ-гп-б 0.80 100 1000 0.20 1.0

БЬ2п-7 0.50 100 1000 0.20 1.0

БЬ-гп-Б 1.00 100 1000 0.20 1.0

2.00 100 1000 0.20 1.0

БЬ-гп-ю 0.40 100 450 0.20 1.0

* Неионогенное ПАВ, оксиэтилированный сорбитанмонопальмитат (степень оксиэтилирования 20).

Таблица 2. Коллоидно-химические свойства цинксодержащих полимерных суспензий

Суспензия Метакрилат цинка, мае. % Время полимеризации, ч Диаметр частиц, мкм Коэффициент вариации, % Устойчивость к электролитам (ЫаС1), моль/л Агрегаты, % от числа свободных частиц Устойчивость в фосфатном буферном растворе (рН 7.2) Метакрилат металла на поверхности частиц, мае. % Площадь поверхности, приходящаяся на одну молекулу метакрилата металла, А2/г

БЬ-ХпА 0.40 7 + 5 0.90 9.0 0.00 80 — - —

ЯЪ-Хп-! 0.40 7 + 15 0.54 7.3 0.00 0 - - -

Бь-гп-з 0.40 17 + 5 0.52 6.7 0.20 5 + - 0.040 22.5

8Ь-2п-4 0.15 17 + 5 0.53 8.1 0.25 0 + - -

8Ь-гп-5 0.80 17 + 5 0.60 6.3 0.25 0 + - -

Бь-гп-б 0.40 24 + 5 0.85 5.0 0.25 0 + 0.030 30.5

0.50 24 + 14 0.80 5.1 0.20 0 + - 0.030 32.4

8Ь-гп-8 1.00 24 + 14 0.80 3.2 0.20 0 - 0.055 17.4

БЬ-гп-9 2.00 24 + 14 0.83 3.1 0.15 0 - 0.060 15.4

при определенных степенях конверсии стирола в процессе безэмульгаторной полимеризации. Синтез полимерных суспензий осуществляли в отсутствие эмульгатора при соотношении фаз мономер : вода (по массе) = 100 : 1000 и 100 : 450. В табл. 1 представлены рецепты сополимеризации стирола с метакрилатом цинка.

Метакрилаты щелочных металлов вводили спустя 7 ч (8Ыл-1 и БЬ-К-1) либо 17 ч (81Лл-2 и 8Ь-К-2) с момента начала полимеризации на стадии конверсии стирола 32 либо 77% соответственно. Полимеризацию проводили при соотношении стирол : вода = 100 : 1000 мае. ч. в присутствии 0.4 мае. ч. соответствующего метакрилата (в расчете на стирол) и концентрации инициатора персульфата калия 0.2 мае. % (в расчете на водную фазу).

Метакрилаты цинка вводили при конверсии стирола 58% (БЬ-гп-!), 32% (8Ь-гп-2), 77% (БЬ-

ТпгЪАЯ), 83% (8Ьгп-6) и 63% (8Ь-2п-7,8,9) соответственно.

Из данных табл. 2 и 3 видно, что тип металла влияет на размер частиц: он возрастает в ряду ме-такрилат цинка-метакрилат лития-метакрилат калия. Следует также отметить изменение устойчивости к электролитам полученных цинксодержащих полистирольных суспензий: в буферных растворах 0.2-0.25 моль/л №С1 устойчивы суспензии, полученные при введении метакрилата цинка при конверсии стирола более 65%. Это, очевидно, соответствует большей концентрации металла на поверхности частиц, что также подтверждается данными электронно-зондового анализа (табл. 2).

Проведена оценка содержания остаточного стирола в полимерных суспензиях, содержащих различные металлосодержащие мономеры. Сле-

Таблица 3. Коллоидно-химические свойства литий- и калийсодержащих полимерных суспензий

Суспензия Метакрилат цинка, мае. ч. Время полимеризации, ч Диаметр частиц, мкм Коэффициент вариации, % Устойчивость к электролитам (ИаС1), моль/л

8Ь-Ы-1 0.4 7 + 15 0.57 5.3 0.25

8Ыл-2 0.4 17 + 5 0.54 7.3 0.20

8Ь-К-1 0.4 7 + 15 0.80 4.2 0.20

8Ь-К-2 0.4 17 + 5 0.88 8.7 0.20

Таблица 4. Рецептуры сополимеризации метакрилатов металлов со стиролом на затравочной полистирольной суспензии ББИ

Суспензия

ас

а з 2 «

се

а

<о

Я

ч о с

.. &

® 8Р 2

«) ' л

5 У 2

>> 2 я

и 2 В

и

я §

а

5

Н

О

о л

ев'

И

н

ее

•е- .

л сг о

N

я:«

ч л

4 се

о а

5 4> . 2

¡^ о

< О «3

Н У

11

в?

и я О. Д

« 5 С 3

н се х

0

•О- г

А . £ «

1 *

1*

И

г1 я

О я

и се 2

3*

с

<и <и £ Н

ББЬ-Си-б Б8Ь-Со-7

8БЬ-и-9 88Ь-К-10

100 100 100 100 100 100

20 20 20 100 100 100

2400 2400 2400 2400 2400 2400

2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4

2 х 10-4 2 х 10"4 2х 10 2 х Ю-4 2 х Ю-4 2 х 10"4

0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38

1.0 1.0 1.0

1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

дует отметить меньшую способность к очистке цинксодержащих суспензий по сравнению с литий- и калийсодержащими. Можно предположить, что плохое отмывание мономера из цинксодержащих суспензий происходит из-за повышенной сшивающей способности метакрилата цинка. Микрофотографии полученных полимерных суспензий и характеристики их свойств приведены на рис. 2. Видно, что эти полимерные суспензии обладают узким распределением частиц по размерам и по зарядам, а также устойчивостью в растворах электролитов, что позволяет использовать их в иммунохимических исследованиях.

Проведенный электронно-зондовый анализ полимерных суспензий показал, что при данном методе синтеза полимерных микросфер осуществляется введение ионов металлов непосредственно на поверхность частиц, причем лучшими свойствами обладают суспензии, полученные в случае введения метакрилатов металлов при степенях конверсии стирола более 65-75%, когда формирование полимерно-мономерных частиц уже завершено и полимеризация протекает в приповерхностном слое.

При постановке реакции латекс-агглютинации в иммунохимических планшетах для обеспечения необходимой скорости осаждения частиц (не более 2 ч), размер используемых частиц должен составлять не менее 1.4-2.0 мкм. Кроме того, при увеличении размеров частиц наблюдается повышение чувствительности диагностикумов.

Такие частицы синтезировали затравочной полимеризацией металлосодержащих мономеров на полистирольных микросферах, полученных методом безэмульгаторной полимеризации [10]. Данный способ позволяет получать частицы, имеющие структуру "ядро-оболочка", точно регулировать их размер и сохраняет возможность получения частиц с узким распределением по размерам.

Затравочные полимеризации металлосодержащих мономеров проводили на полученной ранее полистирольной суспензии ББИ с использованием методики [10]. Рецепты синтеза затравочных суспензий с условным обозначением ББЬ-М! приведены в табл. 4.

ПРОКОПОВ и др. /, отн. ед. 15-

10

I, отн. ед.

(в)

-100

J.

40 30 20 10

500 1000

(е)

-100

(и)

-100

о

мВ

Рис. 2. Микрофотографии (а, г, ж), данные о распределении по размерам (б, д, з) и ^-потенциалам частиц (в, е, и) для металлосодержащих полимерных суспензий, полученных при введении метакрилатов цинка (а-в), лития (г-е), калия (ж-и). Конверсия стирола составляет 85 (а-е) и 77% (ж-и).

Затравочную полимеризацию осуществляли в две стадии. На первой стадии проводили набухание полистирольной суспензии в стироле с растворенным в нем инициатором в течение 12-14 ч при комнатной температуре. На второй стадии

осуществляли собственно затравочную полимеризацию в течение 24 ч при 60°С. Была получена серия полимерных суспензий с ионами различных металлов на поверхности. В табл. 5 приведены коллоидно-химические свойства этих суспензий.

500 1000

d, нм

Таблица 5. Коллоидно-химические свойства металлосодержащих полимерных частиц, полученных затравочной сополимеризацией стирола и метакрилатов металлов

Суспензия Метакрилат металла, мае. ч. Диаметр частиц, мкм Коэффициент вариации, % ^-потенциал, мВ Устойчивость к электролитам (ЫаС1), моль/л Агрегаты, % от числа свободных частиц

ББЬ-гп-! 0.20 1.47 6.3 -49.6 0.30 18

ББЬ-гп-г 0.27 1.47 7.0 -48.9 0.10 20

Бзь-гп-з 0.40 1.46 5.8 -45.5 0.15 23

0.80 1.48 5.5 -40.2 0.15 25

88Ь-гп-5 1.65 1.48 6.8 -37.3 0.15 25

88Ь-Си-6 1.64 1.45 7.0 -32.9 0.15 15

88Ь-Со-7 1.60 1.46 6.6 -22.7 0.15 10

88Ь-2п-8 0.40 1.45 5.2 - 0.25 16

88Ь-П-9 0.40 1.45 4.5 - 0.25 23

88Ь-К-10 0.40 1.45 6.1 - 0.20 21

Из представленных данных видно, что введение и с высокой концентрацией ионов металла на по-

ионов металла на поверхность частиц в начале за- верхности. травочной полимеризации не приводит к заметному улучшению их свойств, наблюдается падение На основе описанных выше полимерных сус-

потенциалов. При введении метакрилатов метал- пензий созданы диагностикумы на сальмонеллез.

лов спустя 15 ч с момента начала полимеризации Показано, что эти диагностикумы специфичны,

получены суспензии, характеризующиеся высо- их чувствительность составляет 105 микробных

кой устойчивостью к электролитам, что, очевид- клеток/мл. Диагностикумы хранили при темпера-

но, обусловлено большей концентрацией ионов туре 4°с. Активность сохранялась на первона-

металлов на поверхности частиц и, как следствие, чалЬном уровне в течение 12 месяцев, что превы-способствует возрастанию электростатического и структурно-механического факторов устойчивости дисперсии полимера.

Микрофотография полимерной суспензии 88Ь-2п-8, полученная методом электронной микроскопии, отражена на рис. 3.

Методом электронно-зондового анализа определено содержание ионов металлов на поверхности частиц. Расчет на основе экспериментальных данных дал следующие результаты: концентрация ионов цинка на поверхности частиц равна 0.097 мае. % (32% от теоретически рассчитанного), площадь поверхности, приходящаяся на одну молекулу, составила -30 А2/группу.

Таким образом, метод затравочной сополиме-ризации стирола и металлосодержащих мономеров на предварительно синтезированных поли-стирольных микросферах позволяет получать частицы более крупного размера (порядка 1.5 мкм)

Рис. 3. Микрофотография частиц затравочной суспензии Б&Ь^п-в, полученная методом электронной микроскопии.

шает требуемое время хранения тест-систем в ~2 раза.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Прокопов Н.И., Грицкова И.А., Черкасов В.Р., Чалых А.Е. // Успехи химии. 1996. Т. 65. № 2. С. 178.

2. Hidalgo-Alvarez R-, Gonzalez G. // Heterogenious Chem. Rev. 1995. V. 2. № P. 249.

3. Кузнецова H.B., Кабанова Л.В., Гришин Д.С. // Коллоид, журн. 2002. Т. 64. № 2. С. 182.

4. Sreenivasan К. //J. App. Polym. Sei. 2001. V. 80. № 14. P. 2795.

5. Kawahashi N., Shino H. 11 J. Mater. Chem. 2000. № 10. P. 2294.

6. Кабанова Л.В., Кузнецова H.В., Александров ЮЛ. И Коллоид, журн. 1999. Т. 61. № 2. С. 211.

7. Грицкова И.А., Седакова Л.И., Мурадян Д.С., Си-некаев Б.М., Павлов A.B., Праведников А.Н. // Докл. АН СССР. 1978. Т. 243. № 2. С. 403.

8. Помогайло А.Д., Савостьянов B.C. Металлсодержащие мономеры и полимеры на их основе. М.: Химия, 1998.

9. Станишевский Я.М. Дис. ... канд. биол. наук. М.: РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2001.

10. Лобанов А.Н. Дис. ... канд. хим. наук. М.: МИТХТ им. М.В. Ломоносова, 2003.

11. Грицкова ИЛ., Прокопов Н.И., Лобанов А.Н., Станишевский Я.М., Ожеховски А. // Высокомо-лек. соед. А. 2002. Т. 44. № 11. С. 1887.

Synthesis of Polymer Suspensions Containing Metal Ions on Particle Surface for Immunoassay

N. I. Prokopov, D. N. Vovk, and I. A. Gritskova

Lomonosov State Academy of Fine Chemical Technology, pr. Vernadskogo 86, Moscow, 117571 Russia

Abstract—The heterophase copolymerization of styrene with metal-containing monomers was studied, and it was found that this process makes it possible to prepare polymer microspheres containing metal ions on their surface. Electron probe analysis was applied to measure the concentration of metal ions on the surface of particles and to determine its relation to the polymerization procedure. A highly specific and sensitive test system for salmonellosis diagnostics was developed.