Синтез полимерных суспензий для иммунохимических исследований Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия А, 1995, том 37, М 7, с. 1156 - 1159

СИНТЕЗ И

= ХИМИЧЕСКИЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ

УДК 541(64 + 182.42):542.952

СИНТЕЗ ПОЛИМЕРНЫХ СУСПЕНЗИЙ ДЛЯ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ1 © 1995 г. И. А. Грицкова, Н. И. Прокопов, В. Р. Черкасов

Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова

117571 Москва, пр. Вернадского, 86 Поступила в редакцию 15.09.94 г.

Предложен трехстадийный метод получения полимерных суспензий для иммунохимических исследований. На первой стадии безэмульгаторной полимеризацией синтезированы монодисперсные по-листирольные микросферы. На второй стадии, используя полученные микросферы в качестве затравки, синтезированы частицы со структурой "полистирольное ядро-полиизопреновая оболочка". На третьей стадии проведена контролируемая модификация поверхности частиц цистеином. Изучена зависимость концентрации аминогрупп от условий модификации (рН, температура и время проведения процесса, концентрация цисгеина), установлена корреляция между изменением концентрации функциональных групп и устойчивостью суспензии к электролитам. Показана возможность использования полученных суспензий в иммунодиагностике.

Полимерные микросферы, применяемые в медицине и биологии, должны иметь узкое распределение частиц по размерам (РЧР), воспроизводимые коллоидно-химические свойства, обладать высокой стабильностью при хранении и устойчивостью в физиологических растворах, а также иметь на своей поверхности функциональные группы, способные к ковалентному связыванию с биолигандами [1].

Большой интерес представляет использование для этих целей функциональных суспензий, частицы которых на своей поверхности содержат аминогруппы: такие группы имеют высокую реакционную способность и легко активируются доступными дифункциональными соединениями (например, такими как глутаровый альдегид).

Описанные в литературе методы синтеза функциональных суспензий с аминогруппами на поверхности микросфер [2, 3] сводятся либо к сложным многостадийным реакциям полимера-налогичных превращений, либо к полимеризации или сополимеризации дорогостоящих функциональных мономеров (например, аминостирола). В связи с этим исследования по созданию простого и эффективного метода получения таких суспензий продолжаются многими исследователями и представляют большой научный интерес. Весьма перспективным для этой цели является использование соединений, содержащих реакционноспо-собные аминогруппы, например, серосодержащих аминокислот.

1 Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта 94-03-08987).

В литературе [4] имеются сведения о том, что при сополимеризации изопрена со стиролом в присутствии серосодержащих аминокислот (цис-тина и цистеина) происходит непосредственное взаимодействие дисульфидной и сульфгидриль-ной групп аминокислот с частично поляризованными двойными связями сополимера. Однако полученные таким образом модифшщрованные со-полимерные суспензии не отвечали требованиям, предъявляемым к суспензиям, используемым в качестве носителей белка в реакции латексной агглютинации

Синтез функциональных суспензий с необхо димым комплексом свойств можно осуществить и другим методом (рис. 1). В этом случае процесс получения модифицированных суспензий разбивается на три относительно независимые стадии. На первой стадии осуществляется синтез затравочных полистирольных частиц заданного диаметра с узким РЧР. На второй стадии проводят затравочную полимеризацию изопрена, обеспечивающую высокую концентрацию полиизопре новых звеньев на поверхности частиц, и на третьей стадии проводят модификацию полученных изопрен-сгирольных полимерных суспензий цистеином.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Мономеры, воду, инициаторы очищали по ме тодикам [5]. Полимеризацию проводили в дилатометрах и автоклавах периодического действия, размеры латексных частиц измеряли методом электронной микроскопии на электронном микроскопе "Jet 6С" [6].

Концентрацию амино- и карбоксильных групп определяли кондуктометрическим методом на приборе "Мега-Е1\уго N5721" при температуре 25°С и частоте 3500 Гц [7].

Затравочные полистирольные микросферы получали методом безэмульгаторной гетеро-фазной полимеризации стирола в присутствии персульфата калия в качестве инициатора. Гистограмма распределения по размерам частиц синтезированной полисгирольной суспензии представлена на рис. 2а. Видно, что частицы имеют средний диаметр около 1 мкм и узкое РЧР (коэффициент вариации менее 4%).

При проведении затравочной полимеризации изопрена необходимо исключить возможность образования новых полимер-мономерных частиц. Была изучена зависимость времени и степени набухания полистирольных частиц от концентрации изопрена и на основании этих данных были выбраны условия проведения второй стадии процесса: время набухания полисгирольной суспензии 10 - 12 ч при температуре 5 - 7°С и концентрации изопрена не более 10 мае. ч в расчете на полимер суспензии. Процесс полимеризации изопрена в набухших частицах инициировали окислительно-восстановительной системой гидроперекись изопропилциклогексилбензола-три-лон Б-ронгалит-сульфат железа(П) и проводили при 5 - 7°С в течение 5 - 7 ч.

Гистограммы распределения по размерам синтезированных сополимерных частиц представлены на рис. 26. Видно, что частицы увеличиваются по размерам при сохранении узкого РЧР. Проведенные электронно-микроскопич4еские исследования ультратонких срезов полимерных частиц, предварительно обработанных тетраоксидом осмия показали, что частицы имеют структуру типа ядро-оболочка.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Поскольку модификация полисгирольной суспензии цистеином является определяющей стадией с точки зрения необходимой для иммобилизации белка концентрации функциональных групп на поверхности частиц, было изучено влияние времени модификации суспензий, рН реакционной среды и концентрации аминокислоты в реакционной системе на концентрацию фунциональ-ных групп на поверхности частиц суспензии.

На рис. За и 36 представлены зависимости концентрации аминогрупп цистеина от температуры и времени проведения модификации, а также от рН реакционной среды. Видно, что оптимальными условиями проведения модификации можно считать рН среды 10.0 -10.5 при времени модификации около 2 ч и температуре 50°С. Гистограмма РЧР полученной модифицированной суспензии

1 стадия

СН = СН,

Затравочные латексные частицы

СН-1 = С ~ СН — СНо

I I 2

+ СН, -

Слой поляизопрена

-СН3_|_ Нв - СН2 - СН - СООН

Ш2 Цистеин

(Н)-СН3

Б - СН2 - СН - СООН 1ЧН,

Рис. 1. Схема синтеза функциональных полимерных суспензий.

1.0 2.0 ¿1, мкм

Рис. 2. Гистограммы распределения частиц полимерной суспензии по размерам: а - после стадии безэмульгаторной гетерофазной полимеризации; б - после стадии затравочной полимеризации с изопреном; в - после модификации цистеином.

1158

ГРИЦКОВА и др.

[NH2], мкмоль/г

Время, ч

[NH2], мкмоль/г

рН

Рис. 3. Зависимость концентрации аминогрупп на поверхности частиц от времени модификации (а), температура модификации: 50 (1), 40 (2) и 30°С (5); от рН реакционной среды (б) и от концентрации модифицирующего агента (цис-теина) (в).

(рис. 2в) показывает, что подобранные условия модификации суспензии позволяют сохранить узкое РЧР.

Как видно из рис. Зв концентрация аминокислотных групп на поверхности частиц суспензии с ростом концентрации модифицирующего агента (цистеина) стремится к некоторому предельному. значению (около 150 мкмоль/г), которое определяется, по-видимому, содержанием двойных связей в полиизопрене.

На рис. 4а представлены данные, отображающие характер изменения концентрации функциональных групп на поверхности частиц в процессе создания модифицированных сополимерных микросфер. Частицы полистирольной суспензии содержат на поверхности как сильнокислотные (сульфатные) группы, образовавшиеся вследствие инициирования полимеризации сульфатными ион-радикалами, так и слабокислотные карбоксильные группы. Образование последних может быть объяснено гидролизом сульфатных групп до гидроксильных с последующим их окислением по реакции Колтгоффа [3]. Высокая концентрация ионогенных групп обеспечивает и высокую стабильность суспензии к электролитам (рис. 46).

Резкое падение концентрации ионогенных групп на поверхности частиц суспензии, полученной в результате затравочной полимеризации, происходит из-за частичного экранирования их слоем полиизопрена, образующегося на поверхности частицы. При этом наблюдается заметное падение устойчивости суспензии в растворах электролитов (до 0.05 моль/л).

Увеличение концентрации амино- и карбоксильных групп, наблюдающееся вследствие протекающей реакции аминокислоты с полимером при модификации суспензии цистеином, восстанавливает стабильность модифицированной суспензии к электролитам до прежнего значения (больше 0.20 моль/л).

Синтезированные таким образом полимерные суспензии с различной концентрацией функциональных групп на поверхности частиц характеризуются устойчивостью к электролитам (до 0.2 моль/л NaCl) и узким РЧР, что позволяет рекомендовать их к применению в иммунодиагностике.

В частности, эти суспензии были использованы в качестве носителей белков при создании диагностической тест-системы для контроля за загрязнением воздуха промышленной зоны на предприятиях, выпускающих кормовые добавки типа паприн. Было обнаружено, что оптимальными свойствами обладают частицы суспензии с концентрацией аминогрупп на поверхности в пределах 40 - 100 мкмоль/г. Изучение изменения чувствительности синтезированного диагностикума в процессе хранения показало, что в течение

[ФГ], мкмоль/г (а)

[NaCl], моль/л (б)

0.3-

-!—:-

1 стадия 2 стадия 3 стадия

Рис. 4. Диаграмма изменения концентрации функциональных групп [ФГ] на поверхности частиц суспензии (а) и устойчивости суспензии к растворам ЫаС1 (б) по стадиям синтеза.

более 12 месяцев хранения ухудшения чувстви-тельностй и стабильности не происходит.

Синтезированный таким образом диагности-кум имел чувствительность, сравнимую с применяемым в настоящее время эритроцитарным диа-гностикумом, а по ряду показателей (воспроизводимость свойств, стабильность к изменениям рН и ионной силы) превосходил его, что позволило рекомендовать его к широкому применению.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Zecha H. // Makromol. Chem., Macromol. Symp. 1990. V. 31. P. 169.

2. Грицкова И.А., Малюкова Е.Б., Крючков С.Б., Зубов В.П., Ботнарь М.С., Барба H.A., Гусев С.А. А. с. 1616927 СССР // Б.И. 1990. № 2. С. 12.

3. Bangs L.B. Uniform Latex Particles. Indianapolis: Sera-dyn Inc., 1984. P. 68.

4. Черкасов В.Р., Прокопов H.И. // Тез. докл. VI Все-союз. конф. молодых ученых и специалистов "Физ-химия-90". М.: НИИТЭХим, 1990. С. 101.

5. Грицкова И.А., Седакова JIM., Мурадян Д.С., Си-некаев Б.М., Павлов A.B., Праведников А.Н. // Докл. АН СССР. 1978. Т. 243. №2. С. 403.

6. Трегубенков С.И., Седакова Л.И., Скворцов В.Г., Грицкова И.А., Праведников А.Н. // Высокомолек. соед. Б. 1985. Т. 27. № 11. С. 873.

7. Черкасов В.Р. Дис.... канд. хим. наук. М.: МИТХТ, 1992.

Synthesis of Polymer Suspensions for Immunochemical Assays I. A. Gritskova, N. I. Prokopov, and V. R. Cherkasov

Lomonosov Academy of Fine Chemical Technology pr. Vernadskogo 86, Moscow, I ¡757J Russia

Abstract - A three-stage procedure for the preparation of polymer suspensions that may be used in immunochemical assays is described. The first stage involves the synthesis of monodisperse polystyrene microspheres by emulsifier-free polymerization. At the second stage, particles with a polystyrene core and polyiso-prene shell, for which the polystyrene microspheres obtained at the first stage serve as nuclei, are synthesized. At the third stage, controlled modification of the surface of the particles with cysteine is conducted. The surface content of amino groups was examined as a function of modification conditions (pH, temperature and duration of the process, concentration of cysteine) and correlation between the variation of the concentration of functional groups and stability of suspensions to electrolytes was established. Applicability of the synthesized suspensions in immunodiagnostics is demonstrated.