Синтез новых ДНК-биосенсоров для определения митохондриального гена стерильности пыльцы подсолнечника

Усатов Александр Вячеславович; Маркин Николай Викторович; Устенко Алексей Александрович; Лотник Виктория Сергеевна; Панич Анатолий Евгеньевич

А.В. Усатов, Н.В. Маркин, А.А. Устенко, В.С. Лотник, А.Е. Панич Южный федеральный университет, Ростов-на-Дону

Подсолнечник (Helianthus annuus L.) является основной масличной культурой России и входит в пятерку главных масличных культур мира. На территории Российской Федерации на его долю приходится около 80 % площади посевов всех масличных культур и до 90 % производимого растительного масла (Келигов, 2009; Повстяной, 2009). Одна из основных целей селекции подсолнечника состоит в увеличении урожая семян. Основу современного промышленного производства семян подсолнечника составляют гетерозисные межлинейные гибриды, создаваемые при скрещивании линий, носителей цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС) типа РЕТ1, на основе однолетнего дикорастущего вида H. petiolaris, с формами, имеющими ядерные доминантные гены восстановления фертильности пыльцы Rf1 и Rf2 (Serieys, 1999; Гаврилова, Рожкова, 2005). При этом ген Rf2 присутствует практически у всех инбредных линий, включая линии-закрепители стерильности, тогда как для восстановления фертильности ген Rf1 должен быть получен только от линии-восстановителя. Ядерные гены Rf, контролируют реакцию полиаденилирования atpA-orfH522 транскрипта, что индуцирует его разрушение РНКазой II и в конечном итоге приводит к восстановлению фертильности пыльцы (Gagliardi et al., 1999). Учитывая актуальность проблемы быстрой идентификации в генотипе подсолнечника генов восстановления фертильности пыльцы и митохондриального гена мужской стерильности пыльцы для интенсификации селекции подсолнечника на гетерозис необходимы новые высокоинформативные ДНК-маркеры специфично определяющие такие признаки. Целью данной работы является разработка и синтез высокоспецифичных олигонуклеотидов (праймеров и зонда) маркирующих митохондриальный ген orf522 ЦМС РЕТ1 подсолнечника и апробация протокола ПЦР в режиме реального времени (Real-Time ПЦР).

Материал и методы:

Для идентификации митохондриального гена orf522 ЦМС РЕТ1 подсолнечника, синтезировали специфичные праймеры и зонд. (таблица 1)

Таблица 1

Характеристика праймеров и зонда, использованных в Real-Time ПЦР-анализе геномной ДНК растений подсолнечника для определения гена orf522

Последовательность нуклеотидов 5'-3' Температу ра отжига, 0 С Насыщенность GC-пар, % Длина

Праймер 1 (forward) TGAGTTTACTCCGGCAACTCGTTC 58,7 50 24

Праймер 2 (reverse) T GCTCTTGAAT GGCAGT GGT GAT G 59,5 50 24

Зонд: ACAGATCACGCCCTAT AAAGGCCGAA 61,4 50 26

Праймеры (олигонуклеотиды) целевого фрагмента митохондриального гена orf522 и флуоресцентный зонд синтезирован в рамках проекта ЦКП «Высокие технологии» госконтракт № 16.552.11.7024 (2011-2012г) на ДНК-синтезаторе ASM-800 (Биоссет, г. Новосибирск, Россия) в направлении от 3'- к 5'-концу методом твёрдофазного синтеза в соответствии со стандартными протоколами фирмы-производителя. Автоматический ДНК-синтезатор ASM-800 эксплуатировался при следующих условиях:

- температура окружающего воздуха 17-30о С

- относительная влажность 10-90 %

В качестве рабочего газа использовался газообразный гелий с содержанием:

- объемной доли гелия не менее 99,99 %;

- объемной доли кислорода не более 0,003 %;

- объемной доли водяных паров не более 0,003 %.

Синтез проводили амидофосфитным методом с использованием стандартных коммерческих реагентов в условиях модифицированных нами программ реакционных циклов. Для реакционных циклов с введением З'-тиофосфорильных звеньев вместо стандартного окислителя, содержащего йод и воду, применяли свежеприготовленный 0,05 М раствор 3Н-1,2-бензодитиол-3-он-1,1-диоксида (Glen Research, США) в ацетонитриле. Деблокирование и расщепление связи олигомера с носителем осуществляли с использованием стандартных процедур. Полученные препараты олигомеров анализировали методами ВЭЖХ, MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry), УФ-спектрофотометрией и электрофорезом в ПААГ. Синтезированные олигонуклеотиды хранили в виде водного раствора при -20о С до использования.

Оценку работы праймеров и зонда проводили в энзиматической реакции амплификации в режиме реального времени. В качестве образцов служила тотальная ДНК выделенная методом сорбции на силикагеле из первого листа растений подсолнечника

линий ЦМС РЕТ1 (ЭД 169, ЭД 236, IS1544) восстановителей фертильности пыльцы (Rt991, ХФ4917, ВД114) и гибридов полученных на их основе.

Протокол проведения Real-Time ПЦР представлен на рисунке.

ПРОТОКОЛ ИЗМЕРЕНИЙ

14 Hilly Street Mortlake NSW 2157 Australia T *61 29756 1520 F + 61 2 97S6156J W www.corbettllfesdence com

Отчёт

______________________________Информация об тесте

Название Теста Multiplex

Начало Теста 26.09.2011 13:35:02

Тест Закончен 26.09.2011 14:47:28

Тест. выполнен программой версии Rotor-Gene 1.8.11

Уровень сигнала Green 5,

Уровень сигнала Yellow 5,

Уровень сигнала Orange 5,

Уровень сигнала Red 5,

Количеств. Информация

Левый порог 1,000

Станд. кривая импортирована Нет

Станд. кривая (1) N/A

Станд. кривая (2) N/A

Начать нормализацию с цикла 1

Noise Slope Correction Нет

Порог No Template Control 0%

Порог Эффективности Реакции Отключен

Метод нормализации Динамич. фон нормализация

Цифровой Фильтр Легкий

Страница образцов orf522

Импортированные Установки анализа

Профиль

Цикл Точка Цикла

Удерж. темп-ры 95°c, 5 мин. 0 сек.

Cycling (35 повторов) Step 1 T 58°c, Удерж. темп-ры 30 сек., Детекция в Циклирование A([Green] [1][1], [Yellow] [2] [2])

(Т? corbett

V v—_ RESEARCH

АЯучИЛ rfcorbwt We

Step 2 T 95°c, Удерж. темп-ры 15 сек., Детекция в Циклирование B([Green] [1][1], [Orange] [3] [3],[Red] [4] [7],[Yellow] [2] [2])

Raw Data For Cycling A.Yellow

I I I I I

5 10 15 20 25 30 35

__________________________________________Цикл_________________________________________________________

5 10 15 20 25 30 35

________________________________________Цикл_____________________________________________________

Имя Тип

ЭД 169 Образец ЦМС РЕТ1

ЭД 236 Образец ЦМС РЕТ1

IS1544 Образец ЦМС РЕТ1

RT991 Образец восстановитель фертильности

XF4917 Образец восстановитель фертильности

VD114 Образец восстановитель фертильности

ЭД 169xJ-8/RT991 Образец гибрид

ЭД 236xJ-8/XF4917 Образец гибрид

IS1544xVD114 Образец гибрид

1 | H2Odd Контроль

Этот Отчёт сгенерирован Rotor-Gene Real-Time Analysis программой Rotor-Gene 6000 Series Software 1.8 (Build 11)

Endorsed

1 ' Iм; ’ ISO 9001:2000 (Reg. № QEC21313)

алсмм!

В условиях Real-Time ПЦР, маркер гена orf522 определен, как и ожидалось, у всех исследованных линий и гибридов подсолнечника, что обусловлено единой цитоплазмой в происхождении этих линий, несущих мутацию в митохондриальном геноме. Полученные результаты демонстрируют 100% идентификационную возможность Real-Time ПЦР с разработанными высокоспецифичными праймерами и флуоресцентным зондом.

Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки, грант ФЦП «Проведение центром коллективного пользования научным оборудованием «Высокие технологии» Южного федерального университета поисковых научно-исследовательских работ в области создания экологически чистых технологий получения новых активных нано- и микроструктурированных материалов для использования в современной сенсорике», госконтракт № 16.552.11.7024.

Список литературы

1. Гаврилова В. А. Доноры восстановления фертильности пыльцы линий ЦМС подсолнечника для гетерозисной селекции / В.А. Гаврилова, В.Т. Рожкова // Идентифицированный генофонд растений и селекция / Под ред. Б.В. Ригина, Е.И. Гаевской. - Санкт-Петербург. - 2005. - С. 377-389.

2. Келигов И. А. Влияние сроков и норм посева семян на урожайность подсолнечника в Приазовской зоне Ростовской области / И.А. Келигов // Дис... канд. с. -х. наук. - Персиановский, 2009. - 152 с.

3. Повстяной В. В. Удобрение подсолнечника в двух видах севооборотов на обыкновенном черноземе Западного Предкавказья / В.В. Повстяной // Дисс... канд. с. -х. наук. - Краснодар, 2009. - 174 с.

4. Gagliardi, D. Polyadenylation accelerates the degradation of the mitochondrial mRNA associated with cytoplasmic male sterility in sunflower / D. Gagliardi, C.J. Leaver // EMBO J. - 1999. - Vol. 18. - P. 3757-3766.

5. Serieys H. Identification, study, and utilization in breeding programs of new CMS sources / H. Serieys // Helia. - 1999. - Vol. 22. - P. 71-84.

Текст научной работы на тему «Синтез новых ДНК-биосенсоров для определения митохондриального гена стерильности пыльцы подсолнечника»