CC BY
23
УДК 577.338:577.123.36
СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ ИМИДАЗОЛА НА ПАРАМЕТРЫ РОСТА И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ГРИБОВ
РОДА CANDIDA
© 2004 О.Н.Нечаева,1 Н.А. Кленова^ П.П. Пурыгин? Е.А. Шубина?
Н.Ю.Хохлова5
Осуществлен синтез этилимидазол-1-илкарбоксимидата и этилбен-зимидазол-1- илкарбоксимидата и исследована их антигрибковая активность. Показано, что исследуемые соединения обладают фунгиостати-ческим действием по отношению к грибам рода Candida.
Введение
В настоящее время все большее значение приобретают заболевания, вызываемые условно-патогенными микроорганизмами. Это явление связано с возросшей силой воздействия факторов окружающей среды: химические загрязнения, радиация, нерациональное использование антибиотиков и гормональной терапии, что приводит к снижению иммунного ответа и неспецифической резистентности человека.
Одним из показателей увеличивающейся за последние годы несостоятельности иммунной защиты организма человека являются хронические и локальные кандидозы, вызываемые условно патогенными грибами из рода Candida [1].
Распространенность и опасность кандидозных инфекций обусловливает необходимость поиска новых, обладающих высокой эффективностью и без-
1 Нечаева Ольга Николаевна ([email protected]), кафедра органической химии Са-маpского госудаpственного унивеpситета, 443011, Россия, г. Самара, ул. Акад. Павлова, 1.
2Кленова Наталья Анатольевна, кафедра биохимии Самарского государственного университета, 443011, Россия, г. Самара, ул. Акад. Павлова, 1.
3Пурыгин Петр Петрович ([email protected]), кафедра органической химии Самарского государственного университета, 443011, Россия, г. Самара, ул. Акад. Павлова, 1.
4Шубина Елена, кафедра биохимии Самарского государственного университета, 443011, Россия, г. Самара, ул. Акад. Павлова, 1.
5 Хохлова Наталья Юрьевна, кафедра теплофизики и экологической физики Самарской государственной академии путей сообщения, 443066, Россия, г. Самара, 1-й Безымянный пер., 18.
опасных для человека препаратов. Известно, что этим требованиям отвечают препараты, созданные на основе имидазола [2-5]. Несмотря на наличие широкого спектра фунгицидных имидазольных препаратов и антибиотиков, действующих непосредственно на кандиды, поиск новых средств лечения грибковых инфекций является актуальным, так как дрожжеподобные грибки обладают способностью быстро вырабатывать резистентность по отношению к химическим соединениям [6, 7].
Целью настоящего исследования стал синтез и изучение антигрибковых свойств этилимидазол-1-илкарбоксимидата (1тС^Н)0Е1;) и этилбензимида-зол-1-илкарбоксимидата (В21тС^Н)0Е1).
1. Методика химического эксперимента
Этилимидазол-1-илкарбоксимидат. Очищенный путем возгонки в вакууме 1-цианимидазол (0.10 г, 0.11 ммоль) растворяли в абсолютном этаноле (10 мл), реакцию проводили при нагревании на водяной бане при температуре 62-64 °C в течение 2.5 ч. Избыток этанола упаривали на роторном испарителе при температуре 40 °C и давлении 20 мм рт. ст. Полученный осадок растворяли в абсолютном бензоле (2 мл), добавляли петролейный эфир (2 мл). Выпавший осадок отфильтровывали на фильтре Шотта, фильтрат упаривали. Этилимидазол-1-илкарбоксимидат получали в виде белых расплывающихся на воздухе кристаллов. Т. пл. 68-69 °C, спектральные характеристики соответствуют литературным данным [8].
Этилбензимидазол-1-илкарбоксимидат. 1-Цианобензимидазол (0.10 г, 0.07 ммоль) растворяли в абсолютном этаноле (10 мл), реакционную смесь нагревали на водяной бане при температуре 62-64 °C в течение 3 ч. Избыток этанола упаривали на роторном испарителе при температуре 40 °C и давлении 20 мм рт. ст. Полученный продукт очищали аналогично этилимидазол-1-илкарбоксимидату. Этилбензимидазол-1-илкарбоксимидат получали в виде белых расплывающихся на воздухе кристаллов. Т. пл. 79.5-80.5 °C спектральные характеристики соответствуют литературным данным [8].
2. Методика постановки микробиологического исследования
Объектом исследования служил штамм дрожжеподобных грибов рода Candida, представленный Самарской областной санэпидстанцией. Культура грибков поддерживалась на скошенной агаровой среде Сабуро при температуре 8 °C с периодическим пересевом один раз в месяц.
Определение видовой принадлежности и патогенности штамма. Определение видовой принадлежности грибков рода Candida проводили путем микроскопирования прижизненных препаратов, окрашенных раствором
Люголя, используя микроскоп С-11, увеличение 15x90. Кроме того, видовую принадлежность подтверждали по способности использовать источники углерода и по отношению к молекулярному кислороду, высевая на среды Гисса, содержащие 2% лактозы, мальтозы, сахарозы, глюкозы, маннита.
Для определения патогенности (по гемолитической активности) проводили посев на кровяной агар и расчет зоны лизиса, а также посев на среду 199 для культуры тканей, так как патогенные кандиды характеризуются образованием на данной среде истинного мицелия, хламидоспор и ИВ-фак-тора (ростовых трубочек) [9].
Расчет параметров роста. В качестве среды культивирования использовали жидкую среду Сабуро, приготовленную путем добавления к 1% пеп-тонному бульону 4% глюкозы и антибиотика фурациллина в концентрации 100 мкг/мл. Выращивание проводили в 5 мл среды, содержащей азоловые производные в концентрации 200, 250 и 300 мкг/мл (растворитель — 60 % этиловый спирт). Взятые концентрации соответствовали применяемым терапевтическим дозам антигрибкового препарата клотримазола, относящегося к азоловым соединениям. Контрольные пробы содержали соответствующий опытным пробам объем растворителя. Объем добавленного растворителя составлял 40, 50, 60 мкл/мл.
Инкубацию проб проводили в термостате при температуре 37±1 °С в течение 12 часов. Скорость роста оценивали по изменению оптической плотности (ОП) через каждые 0.5 часа (к = 600 нм) в стерильной кювете (0.5 см) [10]. Параметры роста культуры рассчитывали по общепринятым методам [11, 12]. Прирост биомассы определяли как разность между максимальной и исходной плотностью клеточной суспензии. Удельную скорость роста рассчитывали по формуле:
^ = (1п Х« - 1п Хо/(« - «о),
где X« и Хо — плотности клеточной суспензии в моменты времени соответственно « и «о [12].
Время удвоения биомассы («^) определяли как:
«4 = 1п2/ц.
Величину лаг-периода (длительность начальной фазы роста) оценивали по формуле:
Т = « - (1п Хг - 1пХ0)/ц,
где Т — время продолжения лаг-периода, «— момент времени, в который суспензия достигает определенной плотности Хг [12].
Время выхода клеток в стационарную фазу определяли графически [11].
Определение общего микробного числа и морфологических изменений грибков рода Саи&с1а. Для определения числа живых клеток культуру кандид выращивали в жидкой среде Сабуро в течение трех суток в термостате при температуре 37±1 °С, 0.1 мл суспензии разводили в
100 мл дист. воды и 0.01 мл разведенной суспензии распределяли по поверхности агаризованной среды Сабуро [9]. Вновь проводили выращивание в тех же условиях в течение трех суток. Общее число живых клеток определяли по формуле:
N = n X 1000,
где n — число выросших грибковых колоний, а 1000 — кратность разведения клеточной суспензии.
Параллельно с определением общего числа живых клеток проводили визуальный и микроскопический контроль культуры кандид.
Статистическую обработку данных проводили используя критерий Стьюдента—Фишера. Данные считали достоверными при уровне значимости P < 0.05 [13].
3. Результаты микробиологического исследования
Определение видовой принадлежности и патогенности штамма рода Candida. Микроскопирование прижизненных препаратов показало, что клетки данного штамма имеют округлую или овально-вытянутую форму и располагаются в пространстве в виде скоплений с отходящими от них нитями псевдомицелия, что характерно для всех патогенных видов Candida. Наличие хламидоспор с плотной двойной оболочкой на концах нитей псевдомицелия позволило сделать предположение о том, что данный штамм относится к самому патогенному для человека виду Candida albicans [9].
Посев на среды Гисса показал способность данного штамма использовать глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу и маннит с образованием кислых продуктов брожения [14]. Патогенность грибков подтверждало наличие гемолитической активности, диаметр зоны лизиса составил 0.7 ± 0.2 см. Наличие RB-фактора (фактора Рейнольда—Брауна), выраженное в образовании нитей истинного мицелия и ростовых трубочек на среде 199 для культуры тканей, также свидетельствовало о принадлежности штамма грибков к виду Candida albicans [9].Сбраживание сахарозы указывало на принадлежность данного штамма к разновидности Candida albicans-Candida stellatoidea.
Влияние имидазольных производных на параметры роста исследуемого штамма кандид. Клетки-штаммы оказались чувствительными к воздействию исследуемых соединений, так как культивирование грибков в среде Сабуро с ImC(NH)OEt и BzImC(NH)OEt в концентрациях 200, 250 и 300 мкг/мл приводило к сдвигам ростовых показателей. Общая тенденция к ингибированию роста культуры кандид наблюдалась после 4,5 часов культивирования, причем почти не наблюдалась дозозависимость.
Существенное воздействие на рост кандид оказывал сам растворитель — 60% этиловый спирт, мы наблюдали достоверное уменьшение прироста био-
массы в пробах, содержащих 40, 50 и 60 мкл/мл этилового спирта на 21, 22 и 29% соответственно. Токсическое действие этанола на клетку проявляется прежде всего в нарушении энергетического обмена и непосредственном влиянии на структуру и физико-химические свойства клеточных мембран. При повышении концентрации спирта его молекулы, внедряясь в мембрану, необратимо разрушают ее архитектуру, вызывая диссоциацию липопроте-иновых комплексов и освобождая недоступные до этого активные центры протеинов (мембранных ферментов и молекул-переносчиков) [15].
Однако, несмотря на обнаруженное микостатическое действие этанола, добавление в среду 1% растворов 1тС^Н)0Е1 и BzImC(NH)OEt в 60% спирте достоверно снижало прирост биомассы по сравнению с пробами, содержащими только этанол (рис. 1). Нами было обнаружено, что ImC(NH)OEt достоверно уменьшает прирост биомассы в среднем на 16% (Р < 0.01), а действие BzImC(NH)OEt оказывается сильнее, он уменьшает прирост биомассы в среднем на 33% по отношению к пробам, содержащим только этиловый спирт.
Рис. 1. Влияние этилимидазол-1-илкарбоксимидата и этилбензимидазол-1-илкар-боксимидата в концентрациях 200, 250 и 300 мкг/мл на прирост биомассы (ед. ОП) за 12 часов культивирования: 1 — контроль; 2 — влияние 60% спирта (40, 50 и 60 мкл/мл); 3 — влияние этилимидазол-1-илкарбоксимидата; 4 — влияние этилбензимидазол-1-илкарбоксимидата
При изучении основных параметров роста нами было обнаружено постепенное снижение удельной скорости роста грибков, наиболее выраженное под действием BzImC(NH)OEt. Кроме того, наблюдалось увеличение времени удвоения биомассы (^). При инкубировании штамма с ImC(NH)OEt время удвоения биомассы растет в среднем на 14%, а с BzImC(NH)OEt —на 18% (Р < 0.05).
Воздействие азольных производных на показатели роста кандид также выражалось в увеличении периода адаптации (лаг-фаза) и уменьшении времени выхода в стационарную фазу ^-фаза) (рис. 2).
Рис. 2. Влияние этилимидазол-1-илкарбоксимидата и этилбензимидазол-1-илкар-боксимидата в концентрации 300 мкг/мл на длительность лаг-фазы (1) и время выхода культуры кандид в стационарную фазу (час); (2) 1 — контроль (60% этанол); 2 — этилимидазол-1-илкарбоксимидат; 3 — этилбензимида-зол- 1-илкарбоксимидат
При подсчете грибковых колоний нами не было выявлено достоверных отличий между числом колоний, выросших из контрольных клеток грибков, и между числом колоний, образованных клетками из опытных проб. Из этого можно сделать вывод, что исследуемые вещества обладают скорее фунгиостатическим, а не фунгицидным действием. Однако отмечается замедление роста колоний, уменьшение их диаметра, изменение формы, цвета колоний. Клетки, не обработанные веществами, образовывали характерные для С.а1Ыеапв колонии типа "капли майонеза" светло-желтого цвета [10]. Клетки, подвергнутые воздействию 1шС^Н)ОЕ1 и BzImC(NH)OEt, образовали колонии с серовато-желтым оттенком "разжиженной" консистенции. Культура С.а1Ыеапв под влиянием изученных азольных соединений диссоциировала на капсульные, или S-формы, и бескапсульные — И-формы, что свидетельствует о снижении патогенности штамма. Известно, что И-формы не патогенны. Контрольные пробы образовали только гладкие капсульные колонии S-формы.
Основным механизмом фунгиостатического действия изученных соединений, возможно, является быстрое проникновение их в мембрану из-за достаточной гидрофобности, что нарушает работу мембраноассоциированных ферментов, особенно АТФ-аз. Это приводит к потере клеткой необходимого метаболического фонда: ионов, аминокислот, фосфатов. Наиболее гид-
рофобный этилбензимидазол-1-илкарбоксимидат оказывал достоверно большее фунгиостатическое действие.
На основании вышеизложенных данных можно рекомендовать дальнейшее изучение биологической активности вновь синтезируемых соединений на основе имидазола. Это способствует не только поиску новых, более эффективных препаратов, но и позволяет установить определенные закономерности по связи химического строения и биологической активности препаратов.
Литература
[1] РеброваР.Н., ЧистяковаИ.С., СеребренниковаИ.И. Грибы рода Candida у здоровых людей // Вестник дерматологии. 1990. №3. С. 62-65.
[2] Кошкин П.Н. Медицинская микология. Л.: Наука, 1962. С. 89-101.
[3] Новые фармакологические препараты / Под ред. Н.Д. Машковского, М.: Медицина, 1987. 56 с.
[4] МеджаянА.Л., Тер-Захарян Ю.З., Пароникян Р.М. и др. Антибактериальное и противоцистозное действие некоторых производных имидазо-ла // Биологические свойства природных соединений. Ереван, 1962. С. 52-54.
[5] ЧерепенкоТ.И., СапожниковаИ.Р. Фунгицидная активность производных бензимидазола // Физиологически активные вещества. Киев: На-укова думка, 1978. №10. С. 24-25.
[6] Антоньев А.А., Бульвахнер Л.А., ГлазковаЛ.К. и др. Грибы рода Candida. М.: Медицина, 1985. С. 35-41.
[7] Бриан Л.Е. Резистентность и чувствительность микроорганизмов к хи-миопрепаратам. М.: Медицина, 1982. 74 с.
[8] ПурыгинП.П., ПаньковС.В., БеляковаН.А. и др. Реакции 1-цианими-дазола и 1-цианобензимидазола с алифатическими спиртами // ЖОХ. 2002. Т. 72. Вып. 8. С. 1369-1371.
[9] ЛещенкоВ.М. Лабораторная диагностика грибковых заболеваний. М.: Медицина, 1982. 140 с.
[10] Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследованиям / Под ред. Н.О.Биргера. М.: Медицина, 1982. 311 с.
[11] Ждан-Пушкина С.М. Основы роста культур микроорганизмов. Л.: Изд-во ЛГУ, 1983. 94 с.
[12] ПаниковН.С. Кинетика роста микроорганизмов: общие закономерности. М.: Наука, 1982. 206 с.
[13] Фролов Ю.П. Математические методы в биологии. ЭВМ и программирование. Самара: Изд-во СамГУ, 1997. 120 с.
[14] Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии / Под ред. Л.Б.Борисова. М.: Медицина, 1979. 52 с.
[15] Островский Ю.М. Этанол и обмен веществ. Минск: Наука и техника, 1982. 64 с.
Поступила в редакцию 09/VII/2004; в окончательном варианте — 09/ VII/2004.
SYNTHESIS AND ANALYSIS OF IMIDAZOLE DERIVATIVES EFFECT ON PARAMETERS OF GROWTH AND MORPHOLOGICAL CHARACTERISTICS OF FUNGUSES OF A KIND OF CANDIDA
© 2004 O.N. Nechaevaf N.A.Klenovaf P.P. Puryginf E.A. Shubina?
N.Y.Khokhlova10
Ethylimidazol-1-ylcarboximidate and ethylbenzimidazol-1-ylcarbo-ximidate are synthesized and their antifungal activity is analysed. It is shown that the studied chemical compounds have fungiostatic activity in relation to funguses of a kind of Candida.
Paper received 09/VII/2004. Paper accepted 09/VII/2004.
6Nechaeva Olga Nikolaeva ([email protected]), Dept. of Organic Chemistry, Samara State University, Samara, 443011, Russia.
7Klenova Natal'ya Anatol'evna, Shubina Elena, Dept. of Biochemistry, Samara State University, Samara, 443011, Russia.
8Purygin Pyotr Petrovich ([email protected]), Dept. of Organic Chemistry, Samara State University, Samara, 443011, Russia.
9Shubina Elena, Dept. of Biochemistry, Samara State University, Samara, 443011, Russia.
10Khokhlova Natal'ya Yur'evna, Dept. of General and Theoretical Physics, Samara State Academy of Railway Communication, Samara, 443066, Russia.
