CC BY
14
УДК. 547.518+547.86
СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ NOS-ИНГИБИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ N-АЦИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ 2-АМИНО-5,6-ДИГИДРО-4Я-1,Э-ТИАЗИНА
Т.П. Трофимова, О.Н. Зефирова, А.А. Мандругин, В.М. Федосеев, Д.И. Перегуд*, М.В. Онуфриев**, Н.В. Гуляева**, С.Я. Проскуряков***
(кафедрарадиохимии, кафедра физической химии; e-mail: olgaz@org.chem.msu.ru)
В работе описан синтез и результаты тестирования in vitro и in vivo 2-^ацетиламино-, 2-^бензоиламино-, 2^-гексаноиламино- и 2-^(1-адамантаноил)амино-5,6-дигидро-4Д-1,3-тиазинов на проявление NOS-ингибирующей активности.
2-Амино-5,6-дигидро-4#-1,3-тиазин (1) является известным ингибитором фермента NO-синтазы (NOS) [1, 2] и обладает антигипотензивной активностью в экспериментах in vivo [3]. С целью увеличения продолжительности антигипотензивного действия этого соединения нами было предложено синтезировать его более липофильные аналоги, которые могли бы выступать в качестве пролекарств1. В данной работе синтезированы и протестированы in vitro и in vivo четыре N-ацильных производных тиазина 1 со структурно разнообразными заместителями, а именно: 2-К-ацетиламино-, 2-К-бензоиламино-, 2-Ы-гекса-ноиламино- и 2-К-(1-адамантаноил)амино-5,6-дигидро-4#-1,3-тиазины (2а-г, схема 1). Отметим, что выбор заместителей определялся не только их липофильны-
ми характеристиками, но и возможным влиянием на скорость гидролиза амидной связи in vivo.
Для синтеза соединений 2а-г была реализована схема 1. На первом этапе получали базовое соединение 1 из гидробромида 3-бромпропиламина и тиомо-чевины через циклизацию дигидробромида S-амино-пропилизотиомочевины [4]. Затем проводили реакцию ацилирования уксусным ангидридом (для 2а, схема 2) или хлорангидридами соответствующих кислот (для 2б-г)2. Состав и структура полученных веществ подтверждены на основании данных элементного анализа, ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. На следующем этапе нами были проведены эксперименты по приблизительной оценке ингибирующей активности соединений 2а-г по отношению к двум изофор-
С х е м а 1
N-HBr
А.
nh2
N-HBr (HCl) 2a R= -CH3 JJ^ о 26 R= -Ph
S^ ^NH—C^ 2в R= -циклогексил 4r 2г R= -адамантил
2а-г
Br
SH
"NH2'HBr +
С х e м а 2
i-PrOH s^ 't, H2O 1 ацилирование ^^ 2г
hb^H2N
hn NH2
-NHßr NH2'HBr
* Федеральное государственное учреждение Национальный научный центр наркологии Росздрава.
** Институт Высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук.
*** Государственное учреждение Медицинский радиологический научный центр Российской академии медицинских наук.
'Пролекарство - соединение, которое претерпевает биотрансформацию перед тем, как произвести фармакологический эффект (до биотрансформации такое соединение обычно неактивно или малоактивно).
2 Для получения соединения 2г хлорангидридом адамантанкарбоновой кислоты ацилировали основание 2-амино-5,6- дигидро-4Я-1,3-тиазина.
мам КО-синтазы - индуцибельной /N08 и нейрональ-ной ^N08 (рис. 1). Тестирование проводили /п уНто радиометрическим методом с использованием [3Н]-Ь-аргинина (природного субстрата КО-синтазы). Полученные результаты свидетельствуют о том, что синтезированные соединения 2а-г ингибируют КО-синтазу в заметно меньшей степени по сравнению с базовым соединением 1 (рис. 1, 2).
На заключительном этапе исследования для соединений 2а-г были проведены испытания физиологической активности в экспериментах на лабораторных животных. Изначально оценивали влияние синтезированных соединений на выработку оксида азота (N0) в печени мышей. Тестирование ех у/уо показало, что соединения 2а и 26 обладают примерно таким же ингибирующим эффектом на выработку оксида азота в печени мышей, как и базовый тиазин (1) [(доза, необходимая для ингибирования продукции N0 на 50% (ИД50), составляет около 3 мкмоль/кг]. N0^^ гибирующая активность ех у/уо ацильных производных 2в и 2г оказалась существенно более низкой (на
один-два порядка), чем у базового тиазина. Исследование антигипотензивной активности соединений 2а,6, проведенное /п у/уо на крысах, в том числе и на модели септического шока, показало, что антигипотензивный эффект 2а приблизительно в два раза более длителен по сравнению с таковым для тиазина 1.
Таким образом, наилучший результат из серии синтезированных веществ был достигнут для соединения 2а, которое действительно оказалось эффективным пролекарством тиазина 1. Учитывая, что определенная /п у/уо токсичность соединения 2а очень мала, 2-ацетиламино-5,6-дигидро-4Я-1,3-тиазин (2а) стал предметом патентной заявки в качестве потенциального антигипотензивного средства [5].
Экспериментальная часть
1 13
Спектры ЯМР Н и С регистрировали на спектрометрах «Вгикег WP-100SY» с рабочей частотой 100 МГц и «Вгикег СХР-200» с рабочей частотой 200 МГц с использованием ТМС в качестве внутреннего стандарта. Контроль протекания реакций прово-
Концентрация соединения 2в, мкМ Концентрация соединения 2г, мкМ
Рис. 1. Зависимости процента ингибирования активности изоформ NOS от концентрации тестируемых соединений 2а-г (методику
см. в экспериментальной части)
18 ВМУ, химия, № 5
j^^-N • НВг
1001 щ —
Ш
Ц "T^HIJIUPWWWWIJW«^ ............................ —.........Г........ .....-.............'"Т""..............................т>ИМ»1ЩРШ111и.ШШШ.УШ...1Ш!
ОД 1 10 100 1000
Концентрация соединения 1, мкМ
Рис. 2. Зависимости процента ингибирования активности изоформ NOS от концентрации базового тиазина 1
дили с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах Silufol UV-254, хроматографическая система бутанол-ацетон-муравъиная кислота (1:1:1). Масс-спектры регистрировали на квадруполь-ном масс-спектрометре "Shimadzu LCMS-2010 A " с ионизацией в электроспрее.
2-N-aцeтилaминo-5,6-дигидpo-4#-1,3-тиaзин гидробромид (2a). К 0,7 г (0,0036 моль) 2-аминоти-азина гидробромида добавили 5 мл (0,053 моль) уксусного ангидрида и нагревали при 90°С, перемешивая магнитной мешалкой в течение 10,5 ч. После охлаждения выпавший осадок отфильтровывали и промывали эфиром. Получено 0,72 г соединения 2a. Выход: 84%. Гпл = 192-194°С. (лит. [4] 179-180°С). Найдено, %: С 30.25, 30.32; H 4.39, 4.52; N 11.62, 11.86. q^BrNpS. Вычислено, %: C 30.14; H 4.64; N 11.71. Масс-спектр: 117 ^4H9N2S+), 159 (C6H12N2SO+). Спектр 13С (ДМСО-ё6-СС14 (1:4), 5, м.д.): 172,39 (С7); 166,42 (С2); 41,97 (С4); 26,80 (С6); 24,30 (С8), 19,22 (С5). Спектр ЯМР 1Н (ДМСО-ё6-СС14(1:4), , м.д., J, Гц): 2,15 (м., 2Н, СН2); 2,32 (с., 3Н, СН3); 3,40 (т., 2Н, J=5.6, Œ2S); 3,75 (т., 2Н, J=5.6, Œ2N); 12,10 (ш. с., 2Н, NH+N+H).
2-N-бeнзoилaминo-5,6-дигидpo-4#-1,3-тиaзин гидробромид (2б). К 0,3 г (0,0015 моль) 2-аминоти-азина гидробромида добавили 2 мл (0,017 моль) хло-рангидрида бензойной кислоты и нагревали при 140°С, перемешивая магнитной мешалкой в течение 1520 мин. После охлаждения выпавший осадок отфильтровывали и промывали эфиром. Получено 0,35 г соединения 2б. Выход: 76%. Гпл = 220-223°С (лит. [4] 218-220°С). Найдено %: С 43.62, 43.98; Н 4.46, 4.28; N 9.48, 9.32. ^H^Br^OS. Вычислено %: С 43.86;
Н 4.35; N 9.30. Спектр ЯМР (ДМСО-ё6-СС14 (1:4), 5, м.д. J, Гц,): 2,15 (м., 2Н, CH2); 3,35 (т., 2Н, J=5.6, CH2S); 3,80 (т., 2Н, J=5.6, CH2N); 7,78-8,45 (5H, м, Hap0M); 12,10 (ш. е., 2Н, NH+N+H).
2-^циклогексениламино-5,6-дигидро-4#-1,3-тиазин гидробромид (2в). К 0,5 г (0,0025 моль) 2-аминотиазина гидробромида прибавили 4 мл (0,017 моль) хлорангидрида циклогекеанкарбоновой киелоты и нагревали при 170°С, перемешивая магнитной мешалкой 20-25 мин. Поеле охлаждения добавили 10 мл диэтилового эфира, выпавший оеадок отфильтровали и промыли эфиром. Получено 0,67 г ео-единения 2в. Выход: 86%. Тпл = 153-154°С. Найдено %: С 43.16, 43.32; Н 6.34л, 6.28; N 8.94, 9.18. C11H19BrN2OS. Вычиелено %: С 43.00; Н 6.23; N 9.12. Спектр ЯМР 1Н (ДМСО-ё6-СС14 (1:4), 5, м.д., J, Гц): 1,40 (м., 5Н, С6Н11); 1,85 (м., 3Н, С6Н11); 1,95 (м., 2Н, СН2); 2,20 (м., 2Н, СН2); 2,65 (м., Н, CH-СО); 3,35 (т., 2Н, J=6, CH2S); 3,70 (т., 2Н, J=6, CH2N); 12,10 (ш. е., 2Н, NH+N+H).
2-^(1-адамантаноил)амино-5,6-дигидро-4Я-1,3-тиазин гидрохлорид (2г). К раетвору 0,5 г (0,0025 моль) 2-аминотиазина гидробромида в 5 мл воды прибавляли при перемешивании 1 мл 10%-го раетвора NaOH. Через 5 мин приливали 10 мл CHC13 и перемешивали 1 ч. Органичеекий елой отделяли, еушили над MgSO4, затем упаривали раетворитель. К оетатку прибавили 0,33 мл триэтиламина и 0,48 г (0,017 моль) хлорангидрида адамантан-1-карбоновой киелоты. Перемешивали 1 ч, затем отфильтровали оеадок гидрохлорида триэтиламина и упарили на роторном иепарителе. Ое-таток раетворили в 3 мл изопропилового епирта и прибавили по каплям при перемешивании 5 мл конц. HCl. Выпавший оеадок отфильтровали, раетворили в ацетоне, повторно отфильтровали и упарили фильтрат. Получили 0,27 г еоединения 2г в виде белых криеталлов. Выход: 36%. Тпл = 243-245°С. Найдено %: С 57.38, 57.45; Н 9.07, 8.99; N 8.94, 9.18. ^H^Cl^OS. Вычиелено %: С 57.22; Н 7.36; N 8.90. Спектр ЯМР 1Н (ÄMra-d6-CC14 (1:4), 5, м.д., J, Гц): 2.20-1.75 (м., 15Н, каркаен.); 2,40 (м., 2Н, СН2); 2,65 (м., Н, CH-СО); 3,4 (т., 2Н, J=6.5, CH2S); 3,85 (т., 2Н, J=6.5, CH2N); 12,30 (ш. е., 2Н, NH+N+H).
Тестирование in vitro. Активноеть NO-еинтазы измеряли в двух препаратах: /NOS, выделенной из етимулированных липополиеахаридом макрофагов мыши производетва "Cayman chemical", США (22,43 Ед/мг; 4,97 мг/мл; 111,5 Ед/мл, каталожный номер 60862) и в раетворимой фракции гомогената мозжечка крые (NO-еинтазная активноеть, детектируемая
в данном образце, представлена преимущественно кальций-зависимой nNOS). Активность NOS определяли радиометрическим методом ("Wollac-1414", "Vinspe-ctral", Финляндия) по скорости накопления [ И]-Ь-цит-руллина в катализируемой NOS-реакции окисления [ И]-Ь-аргинина (0,37 Ки/ммоль) [6] в собственной экспериментальной модификации [7]. Результаты представлены (см. рис. 1, 2) в виде процента ингибирования (т.е. разности активностей между пробами без ингибиторов и содержащж ингибиторы, выраженной в про-цешж от активности в пpoбax без ингибиторов).
Тестировяние in vivo. Оценку выработки оксида азота в печени лабораторный животньк проводили ex vivo на белый неинбреднык мышax-caмкax (возраст 5 мес., 27-30 г, иcxoдный генотип - линия Swiss). За 4 ч до эвтаназии эфиром животным (и тестируемой и контрольной группам) инъецировали липoпoлиcaxapид E. coli (ЛПС) (1,5 мг/кг, 0,5 мл физиологического раствора на одну мышь). Через 3 ч после инъекции опытной группе животныи внутрибрюшинно вводили препараты la-г (контрольная группа получала физио-
логический раствор), через 1 ч извлекали пробы печени и замораживали в жидком азоте. Продукцию NO* определяли с помощью ЭПР-спектроскопии спиновой ловушки по методу А.Ф. Ванина [8, 9].
Изучение антигипотензивной активности проводили in vivo на группах крыс ("Wistar", самцы и самки, 200-310 г). Животных наркотизировали внут-рибрюшинным введением нембутала (55 мг/кг) и регистрировали фоновые показатели систолического и диастолического давления из устья левой сонной артерии, частоту сердечных сокращений и частоту дыхательных движений. Затем вводили препараты 2а,б в 0,9%-м водном растворе NaCl и продолжали регистрацию вышеуказанных параметров (до устойчивого и выраженного снижения артериального давления). Тестирование препаратов 2а,б проводили аналогично на экспериментальных животных с устойчивой гипотонией - модель септического шока, вызванного ЛПС (18 мг/кг раствора ЛПС вводили животному в яремную вену в течение 2-3 мин сразу после записи фоновых показателей).
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 05-04-48794а) и гранта НШ-2552.2006.3. Авторы выражают благодарность доценту МГУ Г.А. Бадуну и студентке V курса МГУ A.A. Левцовой за
синтез [3И]-Ь-аргинина.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. ГраникВ.Г., Григорьев Н.Б. // Оксид азота (NO). Новый путь к поиску лекарств. М., 2004.
2. Shah S.K., Grant S.K., Maccoss M., Shankaran K., Guthikonda R.N. International Patent WO 96/14842. 23.05.1996.
3. Проскуряков С.Я., Филимонова М.В., Верховский Ю.Г., Ко-ноплянников А.Г., Мандругин A.A., Федосеев В.М., Скворцов В.Г. // Бюлл. эксп. биол. и мед. 2004. 138. С. 446.
4. Schuberl A., Magosch K.H. // Ann. Chem. 1970. 742. P. 74.
5. Мандругин A.A., Проскуряков С.Я., Трофимова Т.П., Зефиров Н.С., Верховский Ю.Г., Зефирова О.Н., Федосеев В.М.
Заявка № 20071049993 (патент РФ на изобретение) от 09.02.2007.
6. BredtD.S., Snyder S.H. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. 86. P. 9030.
7. Онуфриев M.B., Семенова Т.П., Колаева С.Г., Моисеева Ю.В., Егорова Л.К., Гуляева H.B. // Нейрохимия. 2002. 19. С. 264.
8. Vanin A.F., Mordvintsev P.I., KleschevA.L. // Studia Biophys. 1984. 102. P. 135.
9. Коноплянников А.Г., Проскуряков С.Я., Штейн Л.В. и др. // Бюлл. эксп. биол. мед. 1999. 127. C. 648.
Поступила в редакцию 01.11.2007.
SYNTHESIS AND STUDY OF NOS-INHIBITING ACTIVITY OF N-ACYL-2-AMINO-5,6-DIHYDRO-4ff-1,3-THIAZINES
T.P. Trofimova, O.N. Zefirova, A.A. Mandrugin, V.M. Fedoseev, D.I. Peregud, M.V. Onufriev, N.V. Gulyaeva, S.Ya. Proskuryakov
(Division of Radiochemistry, Division of Physical Chemistry)
Synthesis and the results of in vivo and in vitro biological tests for NOS inhibiting activity of 2-N-acetylamino-, 2-N-benzoylamino-, 2-N-cyclohexylamino- and 2-N-(1-adamantoyl)amino-5,6-dihydro-4Ä-1,3-thiazines are presented in the paper.
