CC BY
52
Химия растительного сырья. 2010. №3. С. 37-42.
УДК 616.155.8: 615.001.6:57.081.4
СИНТЕЗ И АНТИАНЕМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НАНОРАЗМЕРНОГО БИОКОМПОЗИТА ФЕРРОАРАБИНОГАЛАКТАНА
© Г.П. Александрова1, И.М. Красникова2, Л.А. Грищенко1, С.А. Медведева2, Т.Д. Четверикова1
1 Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН, ул. Фаворского, 1, Иркутск, 664033 (Россия) e-mail: [email protected] 2Иркутский государственный медицинский университет, ул. Красного восстания, 1, Иркутск, 664003 (Россия)
Создан и охарактеризован физико-химическими методами агрегативно высокоустойчивый нанобиокомпозит - стимулятор кроветворения, представляющий собой нанодисперсные оксиды железа, инкапсулированные в биосовместимую биогенную матрицу арабиногалактана лиственницы сибирской (Larix sibirica). Изучено влияние нового железосодержащего нанобиокомпозита на систему эритроцитов при экспериментальной анемии. Показано, что ферроарабиногалактан обладает железостабилизирующим эффектом, его использование приводит к качественной коррекции дефицита железа и купированию проявлений анемии.
Ключевые слова: арабиногалакган, нанокомпозит, ферроарабиногалактан, железодефицитная анемия.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований №07-03-01009а.
Введение
Создание терапевтических препаратов нового поколения предполагает возможность комбинировать ле -карственные средства с молекулами полимеров-носителей, которые способны осуществлять их адресную доставку [1]. Биологическая потребность организмов в железе обусловлена его ролью в процессах кроветво-рения, дыхания и окислительно-восстановительных реакциях [2]. По данным ВОЗ, число людей с дефицитом железа во всем мире достигает 200 млн человек. В России около 10% женщин детородного возраста страдают данной патологией, а у 30% из них наблюдается скрытый дефицит железа [3]. Поскольку не всегда возможна ликвидация причины железодефицитных состояний, основное значение приобретает патогенетическая терапия железосодержащими препаратами [4, 5]. Современные лекарства, обеспечивающие коррекцию дефицита железа, не лишены недостатков. Они требуют длительного приема в избыточном количестве из-за их низкой усвояемости, что нередко сопровождается побочными явлениями [6-8]. Для устранения нежелательных последствий используют комплексы солей железа с углеводами, например, с мальтозой (фер-рум Лек), глюкозой (феррлицит) и др. Однако и при этом могут проявляться отрицательные эффекты, обусловленные оксидативным стрессом и лизосомотропным действием препаратов [9, 10]. Кроме того, при применении известных лекарственных препаратов не всегда происходит заполнение органов-депо железом, следовательно, сохраняется прелатентный или латентный дефицит железа.
Для повышения биодоступности и транспортировки в органы кроветворения соединений железа разработаны методы их иммобилизации на мембранотропную полимерную матрицу - природный полисахарид лиственницы сибирской (Larix sibirica) арабиногалакган [11]. На основе этой матрицы получены гибридные водорастворимые нанокомпозиты, представляющие собой инкапсулированные в макромолекулу арабиногалактана ферритовые структуры [12]. Биологические эффекты данного типа соединений неизвестны.
Цель работы - создание железосодержащего наноразмерного композита арабиногалактана и изучение его влияния на систему эритроцитов при экспериментальной железодефицитной анемии.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Экспериментальная часть
Нанобиокомпозит ферроарабиногалактан - железосодержащее производное арабиногалактана - был получен с использованием природного полисахарида арабиногалактана лиственницы сибирской (Larix sibirica), как описано ранее [12]. Содержание в нем железа, определенное методом атомно-абсорбционной спектроскопии, - 3,5%, выход целевого продукта был высоким и составил 94,9%.
Микрофотографии металлосодержащих наночастиц выполнены на трансмиссионном электронном микроскопе Leo 906E с ускоряющим напряжением 80 кв. Размер частиц и распределение размеров определены при статистической обработке микрофотографий. Микрофотографии нанобиокомпозита выполнены с использованием сканирующего электронного микроскопа SEM 525M фирмы PHILIPS.
Исследования антианемической активности проведены на 24 белых беспородных крысах-самках с начальной массой 70 г. 9 из них служили контролем (контроль 1), остальные в течение четырех месяцев получали диетическое питание с низким уровнем железа (27 мг/кг). После этого были сделаны 3-кратные кровопускания с интервалом в 4 дня в объеме 1,5% от массы тела, каждый раз удалялось около 25-30% крови. Перед началом экспериментов, затем после каждого кровопускания, в пик анемии, в период лечения железосодержащими препаратами и по завершении введения лекарств определялись гематологические показатели, включая гемоглобин, цветовой показатель, число эритроцитов, изучались мазки крови. После последнего кровопускания у четырех крыс определено содержание железа в сыворотке крови и в органах-депо с целью подтверждения дефицита железа и объективной оценки степени гипосидероза данных органов. Оставшиеся животные были разделены на две группы: в течение месяца получавшие раствор феррогала в объеме 1 мл с содержанием железа 1 мг/кг (опытная группа) и не получавшие феррогал (группа контроля 2). Полученные цифровые значения обработаны статистически стандартными методами.
Обсуждениерезультатов
Ранее нами найден новый общий подход и оптимизированы условия получения наноразмерных многофункциональных биокомпозитов с регулируемой размерностью и дисперсностью, где в качестве стабилизирующей матрицы использован полисахарид лиственницы сибирской (Larix sibirica) - арабиногалакган, а в качестве наноразмерного ядра - оксиды железа (Fe2O3, Fe3O4) [12].
Ферроарабиногалактаны получаются по реакции взаимодействия солей железа с аммиаком в среде водного раствора полисахарида с высоким выходом, содержание железа в синтезированных образцах нанокомпозитов, в зависимости от условий получения, может изменяться в пределах 0,3-16,0%. Нами оптимизированы условия для направленного синтеза композитов с заданной ультрадисперсностью и однородной структурой. Структурная идентификация неорганической компоненты металлополисахаридных композитов выполнена методом рентгено-дифракционного анализа, при этом установлено, что ферриты арабиногалактана имеют двухфазную аморфно-кристаллическую структуру [13]. Один из железосодержащих препаратов, синтезированных на основе природного полисахарида арабиногалактана, с содержанием железа 3,5% назван «феррогал».
Методом просвечивающей (трансмиссионной) электронной микроскопии мы зафиксировали размеры сформированных в условиях эксперимента дисперсных частиц магнетита, которые варьируются от 2 до 10 нм. Наночастицы оксидов железа (магнетита) имеют строго определенную форму: они представлены в виде темных однородных округлых частиц (рис. 1), в которых электронная плотность выше, чем у окружающей их светлой области полимера, имеющего значительно более низкую электронную плотность. Средний размер наночастиц ферроарабиногалактана с содержанием железа 3,5% составляет 3,9 нм, они имеют мономодальное узкое распределение дисперсности: доля частиц с размерами в интервале 3-5 нм составляет 80%. Эти величины строго укладываются в границы наноразмерного состояния вещества, и нанокомпозиты соответствуют предъявляемым к ним требованиям быть меньше внутреннего диаметра кровеносных капилляров, что обеспечивает возможность проникновения субстанции практически к любым тканям совместно с кровотоком.
Методом сканирующей электронной микроскопии мы определили для исследованного нанобиокомпозита его размеры с окружающей полимерной оболочкой. Благодаря свойству ассоциатов макромолекул арабиногалактана существовать в виде неупорядоченного клубка, образовавшиеся гранулы композитов ферроарабиногалактана имеют форму, близкую к глобулярной (рис. 2). Отметим, что гранулы имеют неоднородную слоистую структуру, а морфология и тонкая структура гранулы ферроарабиногалактана становится видна при большем увеличении. Для гранул ферроарабиногалактана, образовавших свернутые структуры, по форме приближающиеся к округлым, напоминающим вид наночастиц оксидов железа (рис. 1), можно определить и размеры отдельных частиц, варьирующихся в интервале 10-40 мкм, средний размер составляет около 11,8 мкм.
Рис. 1. Микрофотография наночастиц оксида железа (трансмиссионный электронный микроскоп)
Рис. 2. Размер гранул в нанокомпозите ферроарабиногалактане (сканирующий электронный микроскоп)
Кроме того, изучены многообразные специфические физико-химические свойства полученных препара-тов, обусловленные высокодисперсным состоянием вещества, в частности, их гидродинамические свойства [14]. Первостепенно важной особенностью нашей матрицы представляется то, что она, являясь водорастворимым полисахаридом, придает гидрофильные свойства формирующимся во взаимосвязи с ним наночастицам. Несомненным преимуществом арабиногалактана является наличие у него мембранотропных свойств -способности связываться с асиалогликопротеиновыми рецепторами и проникать через мембраны клеточной стенки [15]. Эта способность арабиногалактана как полимерного носителя связанных с ним оксидов железа может обеспечить адресную доставку препарата в клетки печени с диагностической или лечебной целью.
Исходя из особенностей химического состава ферроарабиногалактана, мы предполагали, что нанораз-мерный оксид железа как материал нанокомпозитного ядра придаст препаратам дефицитвосполняющие свойства для организма, и тем самым он будет способен компенсировать дефицит железа при анемических состояниях. Были проведены исследования возможности улучшения гематологических, биохимических, морфологических показателей при экспериментальных железодефицитных анемиях путем применения фер-роарабиногалактана как стимулятора кроветворения.
Для констатации основных проявлений железодефицитной анемии были изучены количественные и качественные показатели красной крови, содержание железа в сыворотке крови и внутренних органах крыс, количество гемосидерина и морфологические особенности органов-депо железа. При комбинированной анемии, вызванной сочетанием безжелезистой диеты и кровопусканий, у лабораторных животных наблюдали значительную депрессию гематологических показателей и выраженный дефицит железа в депонирующих органах.
У животных, находившихся на диете, после трех кровопусканий наблюдалось снижение уровня гемоглобина на 59% (р<0,001), уменьшение числа эритроцитов на 31% (р<0,02), цветового показателя на 40% (р<0,001) (табл.); в мазках крови выявлены гипохромия, анизо-, пойкило- и микроцитоз. Концентрация сывороточного железа составила 22,1% от его уровня у интактных животных (р<0,001) (рис. 3а). Содержание железа в печени снизилось на 88% (р<0,001), в селезенке - на 81% (р<0,001) (рис. 36, в). При морфологическом исследовании в печени выявлены признаки белковой и жировой дистрофии, включения гемосидерина единичные, расположены в районе сосудов. В селезенке отмечено увеличение фолликул, отложение гемосидерина в виде зерен в основном по их периферии, обнаружено значительное количество распавшихся эритроцитов.
Через 15 дней после начала инъекций феррогала произошло повышение уровня гемоглобина, в сравнении с данными в пик анемии и контроля (р<0,01). Через месяц введения феррогала содержание гемоглобина не отличалось от такового у здоровых животных и превышало вдвое концентрацию гемоглобина в разгар развития анемического синдрома (табл.). На 34% возросло количество эритроцитов (р<0,01), восстановился цветовой показатель, исчезли качественные признаки железодефицитной анемии. Концентрация железа сыворотки крови на 160% (р<0,01) превысила уровень железа у нелеченых животных и составила 65% (р<0,01) от такового у интактных животных (рис. 3а). Содержание железа в печени и селезенке было равным 66% (р<0,01) от нормы (рис. 36, в). В то же время количество железа в гепатоцитах крыс, получавших феррогал, возросло на 103%, а в селезеночных макрофагах - на 184%, в сравнении с данными у анемизированных животных без лечения (р<0,001) (рис. 36, в). В целом компенса-
ция дефицита железа происходила быстрее и качественней, чем при длительном применении диетического питания. Морфологическая картина соответствовала положительной динамике течения патологического процесса. Фолликулы селезенки приобрели более компактный вид, близкий к норме, количество гемолизированных эритроцитов снизилось, количество гемосидерина приблизилось к норме. Печень при внешнем осмотре была полнокровной. Гистологическое исследование ее структуры существенных отклонений от нормы не выявило. Отмечено явное повышение содержание гемосидерина, хотя уровень его не достиг такового у интактных животных.
Содержание гемоглобина, эритроцитов и цветовой показатель у животных с комбинированной железодефицитной анемией при введении феррогала
Показатель / 2 месяца 4 месяца диеты и 3 Через 0,5 месяца после Через месяц после
группа диеты кровопускания введения феррогала введения феррогала
Гемоглобин, г/л
Контроль 1 145,2+4,0 148,5+4,8 147,4+5,6 135,6+3,2
Контроль 2 138,9+7,0 61,5+4,6 77,5+2,2 103,5+4,4
р<0,001 Р!<0,01 Рі<0,01
Опытная группа 138,9+7,0 61,5+4,6 104,2+3,6 138,8+5,2
(п=6) р<0,001 р2<0,01 р2<0,02
р3<0,01 Рз<0,01
Эритроциты, п *10 /л
Контроль 1 4,06+0,22 4,03+0,25 4,25+0,29 4,04+0,16
Контроль 2 4,08+0,075 2,81+0,15 3,025+0,3 3,52+0,12
р<0,02 р1<0,05 р1<0,05
Опытная группа 4,08+0,075 2,81+0,15 3,15+0,22 3,77+0,11
(п=6) р<0,02 Рз<0,001
Цветовой показатель
Контроль 1 1,0+0,01 1,1+0,01 1,04+0,08 1,0+0,012
Контроль 2 1,0+0,04 0,66+0,04 0,77+0,07 0,87+0,05
р<0,001 р1<0,05 р1<0,05
Опытная группа 1,0+0,04 0,66+0,04 1,0+0,08 1,09+0,02
(п=6) р<0,001 Рз<0,02 р2<0,05 Рз<0,001
Применение: р - между показателями группы контроля 1 и остальных групп после четырех месяцев диеты и трех кровопусканий; р1 - между показателями контрольных групп после лечения; р2 - между показателями опытной группы и группы контроля 2 после лечения; р3 - между показателями опытной группы после лечения и показателями в пик анемии.
а)
мкмоль/л
60.00 п
50.00 -
40.00 -
30.00 -
20.00 -10,00 -
0,00 —
б)
□ группа крыс в пик
анемии
□ контрольї
□ контроль2
Ш опытная группа
пик анемии
через месяц после введения феррогала
60-1 мкмоль/л 50 40 30 20 10 0
пик анемии
□ группа крыс в пик
ЯНРМИИ
□ контрольї
□ контроль2
И опытная группа
через месяц после введения феррогала
в)
60 -| мкмоль/л 50 -40 -30 -20 -10 -0
ЕЭ группа крыс в пик анемии
□ контроль1 В контроль2 Нопытная группа
пик анемии
через месяц после введения феррогала
Рис. 3. Концентрация сывороточного железа (а) у животных и количество железа в печени (б) и селезенке (в) у крыс при комбинированной железодефицитной анемии и введении феррогала
Следовательно, месячный курс введения феррогала при комбинированной железодефицитной анемии сопровождался постепенным возвращением к нормальным значениям уровня гемоглобина, числа эритроцитов, цветового показателя, качественных характеристик красных клеток крови и частичным восстановлением концентрации железа сыворотки крови и запасных его фондов. Достаточно быстрая компенсация уровня гемоглобина и числа эритроцитов свидетельствует о том, что феррогал оказывает воздействие на главное звено патогенеза железодефицитной анемии, обладая железостабилизирующим эффектом, и своевременное его использование приводит к качественной коррекции дефицита железа и купированию проявлений железодефицитных анемий. Мы полагаем, что возможны два механизма реализации действия феррогала при железодефицитной анемии. Первый путь - традиционный для всех железосодержащих препаратов [3], второй - обусловлен сродством арабиногалактановой матрицы феррогала к асиалогликопротеиновым рецепторам гепатоцитов, макрофагов, ретикулоцитов, что позволяет данному терапевтическому средству внедрять железо в эти клетки путем рецепторно-опосредованного эндоцитоза [15]. Предлагаемые железосодержащие наноразмерные биокомпозиты, полученные на основе природного полисахарида арабиногалактана, открывают простые пути к созданию материалов с необычным комплексом управляемых свойств.
Заключение
Таким образом, создан агрегативно высокоустойчивый нанобиокомпозит, представляющий собой нано-дисперсные оксиды железа, инкапсулированные в биосовместимую биогенную матрицу арабиногалактана лиственницы сибирской (Larix sibirica). Определены средние размеры и форма наночастиц оксида железа, варьирующиеся в интервале 3-5 нм. Нанобиокомпозит ферроарабиногалактан за счет синергизма свойств полисахаридной матрицы арабиногалактана и специфических биологических свойств железа способен проявлять ярко выраженную антианемическую активность. Достаточно быстрая компенсация уровня гемоглобина и числа эритроцитов у лабораторных животных с экспериментально вызванной анемией свидетельствует о том, что ферроарабиногалактан обладает железокомпенсирующим эффектом. Такие новые нанобиокомпозиты в настоящее время чрезвычайно востребованы в медицине и биологии для создания транспортных средств адресной доставки фармакофоров к органам человека и получения новых лекарственных препаратов - стимуляторов кроветворения.
Список литературы
1. Плате H.A., Васильев А.Е. Физиологически активные полимеры. М., 1986. 293 с.
2. Алексеев Г.А. Лечение анемий // Клиническая медицина. 1985. №7. С. 129-135.
3. Дворецкий Л.И. Лечение железодефицитной анемии // Российский медицинский журнал. 2000. Т. 6. №20.
С. 1312-1315.
4. Пушкарев В.П., Захаров Ю.М., Рассохин А.Г. Об изменении эритропоэза в эритробластических островках костного мозга крыс после однократной кровопотери // Физиологический журнал. 1991. Т. 77. №4. С. 16-22.
5. De Oliveira J.E., Ventura S., Souza A.M. Iron deficiency anemia in children: prevalence and prevention studies in
Ribeirao Preto, Brazil // Archive Latin-American Nutrition. 1997. V. 47. N2. Pp. 41-43.
6. Якимова Е.Г., Пименов Л.Т., Наумова M.B. Ноотропил и солкосерил - как средства метаболической коррекции железодефицитной анемии // Человек и лекарство. М., 1997. С. 185.
7. Хайров Х.С. Распространенность железодефицитной анемии у молодых женщин детородного возраста Республики Таджикистан // Вопросы питания. 1998. №3. С. 22-25.
8. Castro Pazos М., Fondevila A.R., Juncal Garcia B. Lopez. Costs of the treatment of iron-deficiency anemia // Attention Primaria. 1996. V. 17. N7. Pp. 480-482.
9. Короленко T.A. Биохимические аспекты лизосомотропизма. Новосибирск, 1983. 83 с.
10. Поспелова Т.Н., Агеева Т.А., Лосева М.И. Об отрицательных эффектах препарата феррум Лек // Гематология и трансфузиология. 1992. №9-10. С. 184-185.
11. Медведева С.А., Александрова Г.П. Стратегия модификации и биопотенциал природного полисахарида арабиногалактана // Панорама современной химии России. Синтез и модификация полимеров : c6. обзорных статей. М., 2003. С. 328-352.
12. Медведева С.А., Александрова Г.П., Грищенко Л.А., Тюкавкина H.A. Синтез железо(П, Ш)содержащих производных арабиногалактана // Журнал общей химии. 2002. №9. С. 1569-1573.
13. Феоктистова Л.П., Сапожников А.Н., Александрова Г.П., Медведева С.А., Грищенко Л.А. Рентгенографическое исследование железосодержащих производных арабиногалактана // Журнал прикладной химии. 2002. Т. 75. Вып. 12. С. 1945-1954.
14. Александрова Г.П., Грищенко Л.А., Медведева С.А. Реологические свойства наноразмерного биомагнетика ферроарабиногалактана // Сб. научных трудов 13-й международной Плесской конференции по нано дисперсным магнитным жидкостям. Плес, 2008. С. 280-285.
15. Pat. 5679323 USA. Hepatocyte-specific receptor-mediated endocytosis-type compositions / Menz E.T., Josephson L. 1997.
Поступило в редакцию 25 июня 2009 г.
