CC BY
39
УДК 581.1: 662.271.4: 631.812 - 408.2: 549.23: 577.122.3: 577.112.
Баранов В.1.*, Гавриляк М.Я.**, Телегус Я.В.*** ®
*Льв1вський нацюнальний утверситет ¡мет 1вана Франка, кафедра ф1зюлогп та екологп рослин, вул. Грушевського, 4, Львгв 79005, Украта, e-mail:
biofrafranko. lviv. ua
**Льв1вська комерцшна академ1я. вул.Самчука 9, Львгв, 79005, Украта, e-mail: academyalac.lviv.ua http://www.lac.lviv.ua ***1нститут бюлогп тварин НААН Украти. вул.Стуса 38, Льв1в,Украта
e-mail: inenbiolama.il. lviv. ua
СИНТЕЗ АМ1НОКИСЛОТ, Б1ЛКУ ТА АЗОТВМ1СНИХ СПОЛУК У РОСЛИН Р1ПАКУ ЗА УМОВ РОСТУ НА СУБСТРАТАХ ПОРОДНОГО
В1ДВАЛУ
Визначено вмкт выьних амтокислот, быку, тших азотвмкних сполук та сгрки в проростках ртаку за умов росту на грунтах породного вгдвалу вугыьних шахт. На основi результат1в припускаеться, що компоненти орнтинового циклу Кребса - Хензелайта i, зокрема сечовина, е запасним депо накопичення амiаку для синтезу амтокислот, амiдiв та быку за дп багатофакторного стресу, якими е умови росту на породному вiдвалi.
Ключовi слова: породний вiдвал вугыьних шахт, ртак, амтокислоти, сечовина, орнтиновий цикл, Ырка, важт метали
Вступ. Антропогеннопорушеш грунти техногенного походження займають значш площ^ зокрема це стосуеться породних вщв^в вугшьних шахт, яю у Львiвськiй област займають понад 270 га земл^ загальним об'емом бшьше 100 млн. м3. У грунтах вщв^в та сумiжних площ виявлено в багатьох мкцях перевищення ГДК важких мет^в. Наявшсть значно1 кшькосп Ырковмкного мшералу триту в породах, арка якого швидко окиснюеться до арчано1 кислоти, обумовлюе високу кислотшсть водних стоив. Це створюе негативш умови для росту рослин i впливае i на здоров'я населення, показовим е приклад смт. Сосшвки, де спостер^аеться гiпоплазiя зубiв та патологiя скелету у дггей [ 12,15]. 1снуе ряд державних постанов, програм, правила рекультиваци вiдвалiв, якими визначено залкнення i залуження площ вiдвалiв [13]. Класична рекультиващя iз зняттям грунту або покриттям вiдвалiв шаром грунту товщиною 25-50 см е еколопчно небеспечною, внаслiдок високого вмiсту важких металiв у грунтах та зараз економiчно неможлива - виходом з цього положення е ф^орекультиващя, яка за виконанням е значно дешевшою. 1снуе коло грунтоутворюючих рослин, однак асортимент рослин-накопичувачiв важких металiв обмежений, слабо вивчеш ланки метаболiзму, яю можуть бути показниками стiйкостi до ди багатофакторного стресу, яким е умови вiдвалiв. Азотний обмiн е одним з найбшьш важливих показниюв метаболiзму рослин, який чiтко вщгукуеться на дiю стресу, про штенсившсть якого можна судити по
® Баранов В.1., Гавриляк М.Я., Телегус Я.В., 2010
154
змшам суми i складу амшокислот, тому метою роботи було вивчення змш бшку, вшьних амшокислот, шших азотвмiсних сполук у проростюв рiпаку за умов росту на грунтах породного вщвалу вугшьних шахт.
Матер1ал i методи. Об'ектом дослiджень були грунт породного вщвалу центрально! збагачувально! фабрики(ЦЗФ в с.Сшець Сокальського району Львiвськоl областi та 30 добовi рослини рiпаку сорту Микитинецький, яю вирощувались на 2-х зразках грунту. Домшуючими грунтами вщвалу е два типа порiд червона(перегорша) та чорна (неперегорiла), якi розрiзняються за кислотнiстю та складом [1]. Рослини вирощували у пластикових ящиках на грунтах вщвалу товщиною 30 см в природшх умовах. Визначення вмiсту сiрки у грунтах i проростках проводили у золi, яку отримували спалюванням матерiалу у муфельнш печi при температурi 4500С. Вшст сiрки визначали за допомогою рентгешвського спектроскопу типа "E-link Microzond". В якост мiкрозондового приладу використовувався дисперсшний (Si(Li) детектор) мiкроаналiзатор-приставка до мкроскопа фiрми Link-analytical. [6,14]. Проби ршаку для аналiзу вiльних амiнокислот(АК) вщбирали, як i проби для визначення арки, на 30 добу. 1 г наважки розтирали в рщкому азои, заливали 5 мл хлороформу для екстракци пiгментiв i збовтували на холоду 12 годин. Хлороформ зливали i залишок висушували в тощ холодного пов^ря. Доливали 5 мл лтевого буферу рН 2,2 складу: LiOH x H2O - 5г, HCl 37% - 9мл, рщкий фенол - 1 мл, тiодiетанол - 20мл (запобiгае руйнуванню сiрковмiсних АК), вода - до 1л i настоювали на холодi 12 годин. Центрифугували при 8000 об/хв, осад вщкидали, а до супернатанту додавали 40 мг сульфосалщилово! кислоти для осадження бшюв, перемшували i залишали на холодi на годину. Центрифугували i визначали вмкт амiнокислот за допомогою амiнокислотного аналiзатора LC-6001 фiрми „Biotronik„ за програмою для фiзiологiчних рiдин [20]. Вмкт бiлку визначався за Бредфордом [11].
Результати та ix обговорення. Для визначення еколопчно! ситуаци на породному вiдвалi ЦЗФ в грунтах вщвалу був визначений вмкт сiрки, який е основним компонентом створення кислотност грунту вiдвалiв. Як виявилось вмют сiрки був бiльшим у чорнш породi, нiж у червонiй, що вiдображалось i на поступленнi li у рослини рiпаку - вмкт li у рослин на чорнш породi був бiльшим, нiж на червонш. Аналiз вмiсту бiлку показав його зростання у пагонах ршаку за росту на обох породах та в коренях на чорнш порода але зменшення його вмкту у коренях при рост на червонш порода При обрахунку суми i середнього вмiсту на всю рослину (пагш+коршь) вмiст бiлку зростав на чорнш i зменшувався на червонш. Збшьшення вмiсту бiлку могло вщбуватись за рахунок запуску синтезу ф^охелатишв, який iндукуеться практично зразу тсля проникнення важких металiв у кл^ину [16], пiдтвердженням можуть бути одночасш змiни вмiсту суми амшокислот у проростках ршаку на рiзних породах.
При визначенш вмiсту вшьних амшокислот сума !х зростала на червонiй породi i в бшьшш мiрi на чорнiй. Найбiльший вмкт у контрольних рослин мали фосфосерин, аспарагшова та глутамiнова кислоти, гщроксипролш,
155
пролш, глщин, дещо менший вмкт мали серiн, аланш, iншi амiнокислоти були у значно менших кiлькостях. Змiни вмiсту амшокислот у рослин на грунтах були рiзними i розрiзнялись за вщношенням амiнокислот до рiзних груп. Сума Ырковмкних амiнокислот (метiонiн, цистин, цистатюнш, таурiн, гомоцистин) зростала на 173.5 % на червонш породi i на 273.3% на чорнiй порода що спiвпадало iз зростанням вмкту сiрки у проростках на цих зразках порщ. Найбiльший прирiст серед Ырковмкних амiнокислот вiдбувався за рахунок приросту вмкту метiонiну i особливо гомоцистину, але зменшувався вмiст таурину.
Таблиця 1.
Вмкт б1лку та арки у 30 добових проросткт р1паку
Вар1ант/кол1р грунту Вм1ст арки у прор у мг/100 г си] остках ршаку эо! маси
М ±т t % до контролю (торфу)
Торф 74.48±3.27 100
Чорний 127.21±18.57 2.79 170.8
Червоний 78.58±9.25 0.41 105.5
Вм1ст арки у субст ратах в1двалу(
Чорний 748.2 ± 1.8
Чероний 565.5 ± 2.9
Вм1ст б1лку ( мг/100г сиро! маси)
П а г 1 н К о р 1 н ь Паг1н+кор1нь (сума/середне)
Контроль(торф) 74,77±0,56 73,31±0,37 148.08 / 74.04
Чорна порода 80,45±0,49 75,57±0,78 156.02 / 78.01
Червона порода 86,09±0,43 51,93±0,49 138.02 / 69.01
Таурин хоча е побiчним продуктом метаболiзму сiрки, але як сильний анюн вiн може регулювати проникшсть мембран, електролiтний баланс в кл^иш, а наявнiсть обмшно! сульфогрупи говорить про його здатшсть до сульфонування рiзних органiчних компонентiв [19,22]. Зменшення таурину у проростках обумовлено збшьшенням концентраци сiрки, причому бiльший И вмют у проростках на чорнш породi викликае сильнiше зниження вмкту таурину, що показано i в дослщах на бавовнику [17]. Зростання суми цього класу АК може бути адаптивною реакщею на збшьшення вмiсту сiрки у тканинах рослин. У породах великий вмкт важких металiв (ВМ), а амiнокислоти, заввдяки негативним зарядам SH-груп, можуть зв'язувати важю метали [16] i збшьшення вмкту амiнокислот може бути вщповщдю також i на поступлення металiв у клiтину. Вмiст пролiну за стресових умов зростае [3,7,10], так як вш е компонентом захисно! системи за рахунок регуляци окисно-вщновних процесiв [18].
156
Таблиця 3.
Вмпст вшьних аминокислот та шших ншгщрннпознтнвннх сполук
у _ 30 добових рослин рiпаку сорту Микитинецький
Амшокислота Концентращя ам1нокислот ( в ткМ /1й ) / % до контролю
Контроль Червона порода Чорна порода
1 Фосфосерин 0.501 0.828 / 165.3 0.780 / 155.7
2 Таурш 0.067 0.055 / 82.1 0.049 / 73.1
3 Аспарапнова к-та 2.049 7.800 / 380.7 7.989 / 385.5
4 Пдроксипролш 7.096 28.027 / 394.9 31.863 / 449.0
5 Треонш 0.376 0.722 / 192.0 1.064 / 282.98
6 Серин 0.954 1.154 / 120.9 1.534 / 160.8
7 Глютамшова к-та 4.205 7.930 / 188.6 7.036 / 167.3
8 б-амшоадишнова кислота 0.126 0.446 / 353.9 0.365 / 289.7
9 Пролш 5.126 13.790 / 269.0 13.668 / 266.6
10 Глщин 1.623 1.756 / 110.7 1.966 / 121.1
11 Аланш 0.884 1.235 / 139.7 1.545 / 174.8
12 Цитрулш 0.056 0.028 / 50.0 0.024 / 42.9
13 Валш 0.352 0.953 / 270.7 1.067 / 303.1
14 Цистин 0.110 0.122 / 110.9 0.741 / 673.6
15 Метюнш 0.094 0.263 / 279.8 0.179 / 190.4
16 Цистатюнш 0.102 0.185 / 181.4 0.083 / 81.4
17 1золейцин 0.153 0.367 / 239.9 0.457 / 298.7
18 Лейцин 0.439 0.940 / 214.1 0.486 / 110.7
19 Тирозин 0.224 0.240 / 107.1 0.133 / 59.4
20 Феншаланш 0.127 0.169 / 133.1 0.168 / 132.3
21 Гомоцистин 0.012 0.043 / 358.3 0.110 / 916.7
22 г-ам1номасляна кислота 0.515 1.465 / 284.5 1.63 7 /317.9
23 Орштин 0.041 0.034 / 82.9 0.055 / 134.2
24 Л1зин 0.440 0.931 / 211.6 0.759 / 172.5
25 Пстидин 0.099 0.458 / 462.6 0.571 / 576.8
26 Арпнш 0.212 0.415 / 195.8 0.760 / 358.5
Сумарний вм1ст амшокислот 25 . 988 70.36 / 270.7 75.09 /288.96
1нш1 азотовм1сш (ншпдринпозитивш) сполуки
Концентращя ( в ткМ /1д ) / % до контролю
Сечовина 45.941 31.66 / 64.9 29. 86 / 4 1 . 7
Ам1ак 1.125 2.82 / 250.7 3.55 / 315.7
Глютам1н Аспарапн Сума ам1д1в 3.061 0.236 3.297 5.53 / 180.6 1.12 / 474.5 6.64 / 201.5 7.64/ 249.8 1.51/641. 9. 1 5/277.7
Фосфоетанолам1н 0.162 0.12 / 74.07 0.12/71.6
Етанолам1н 2.112 3.589 / 169.9 3.1 /146.6
В рослинах рiпаку вмiст пролiну зростав бшьше нiж удвiчi на обох породах, ще в бiльшiй мiрi зростав вмiст гiдроксипролiну - до 394.9% на червонш породi i 449.0% на чорнiй породi. Пролш у рослин синтезуеться з глутамату або орштину [1,16], однак в проростках спостеркалось збiльшення глутамату на обох породах та орштину на чорнш породi i зменшення орштину лише на червонш порода Зростання вмкту оксипролiну, порiвнючи з пролшом, не виключено е реакцiею на стресовi умови росту, якi приводили до шпбування росту проросткiв на породах, так у Е.соН оксипролш не забеспечував рiст мутантiв, яю потребували пролiну, з iншого боку оксипролш
157
може перетворюватись у глутамшову кислоту, як це було показано на Pseudomonas [9].
Найбшьш щкавим е ствставлення вмкту компонент циклу сечовини та вмiсту вшьних амiнокислот. За ди стресових умов росту у рослин збшьшуеться вмкт майже всiх амiнокислот та обох амдав. Збiльшувався i вмiст амiаку, однак його вмiст можна вважати умовною величиною, оскiльки буфернi екстракти могли зв'язати його навт з пов^ря. Кiлькiсно вмiст амiаку визначити даним методом неможливо, але тенденщя змiн його зберiгаеться, оскiльки аналiзи проводились у однакових умовах. Основне ж зменшення вмiсту азотвмiсних сполук вщбувалось лише за рахунок компонент орнiтинового циклу Кребса-Хензелайта - сечовини, цитрулшу, орнiтину на червонiй порода хоча зменшуеться також таурин на обох породах. Вмют сечовини був майже вдвiчi бiльшим за вмют усiх амiнокислот i можна припустити, що за стресових умов синтез амшокислот шляхом прямого амшування може вщбуватись за рахунок амiаку, який утворився при розщепленш сечовини. Зменшення вмкту iнших компонентiв циклу -цитрулшу та орштину може опосередковано вказувати на iншi шляхи утворення амшокислот- орштин може перетворюватись у пролш, цитрулш через аргiнiнбурштинову кислоту у аргшш, вони в свою чергу у iншi амiнокислоти з подальшим утворенням амiдiв або бшюв [8,9]. Збiльшувався вмiст непротешогенних амшокислот - альфа-амшоадитново! та гама-амшомасляно! (ГАМК). Вмiст ГАМК може тдвищуватись за ди рiзних стресiв, сприяючи вiдновленню активностi мембран пiсля стреЫв [4]. ГАМК може здiйснювати запасання азоту у стресових умовах, якщо не утворюються амiнокислоти або амщи [21], але И вмiст до вмюту сечовини е малим, а вмют глутамату i глутамiну у дослда iстотно зростав. Таким чином сечовина та компоненти И циклу у стресових умовах служать запасним депо амiаку для синтезу амшокислот.
Л1тература
1.Баранов В.1., Книш 1.Б. Хiмiко-мiнералогiчний склад порiд вiдвалу вугшьних шахт ЦЗФ "Львiвсистеменерго" та !х вплив на проростання насiння.Промислова боташка: стан та перспективи розвитку: Матерiали V мiжнар. наук. конф. Донецьк: 2007. - С. 36.
2.Гребинский С. Биохимия растений. Львов.: изд.Львовского ун-та, 1967. - 272 с.
3.Григорюк 1.П. Нижник Т.П., Войцешина Н.1., Мицько В.М. Вплив водного стресу i полiстимулiну на вмкт амiнокислот у листках, урожай та яккть бульб картоплi. Физиология и биохимия культурных растений. - 2005. -Т. 37. - № 4. - С. -349-355.
4.Землянухин А.А., Иванов Б.Ф., Ершова А.Н. Организация метаболизма гамма-аминомасляной кислоты в растениях. Успехи современной биологии. - 1979. - № 2. - С. 185-189.
5.Количественный злектронно-зондовый микроанализ: Пер. с англ./Под ред. В.Скотта, Г.Лава. - М.:Мир, 1986.-352 с.
158
6.Кузнецов В.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция. Физиология растений. - 1999. - 46, № 2 . - С. 321-336.
7.Лукнер М. Вторичный метаболизм у микроорганизмов, растений и животных. М.: Мир, 1979.548 с.
8.Майстер А. Биохимия аминокислот. М.: изд.иностр. литер-ры, 1961. -
530 с.
9.Моргун В.В., Майор П.С. Зимо i морозостшккть озимих злакових культур. Фiзiологiя рослин.Проблеми i перспективи розвитку. К.: Логос, Т.2. -С. 105-165.
10. МуЫенко М.М., Паршикова Т.В., Славний П.С. Спектрофотометричш методи в практищ фiзiологil, бiохiмil та екологи рослин.- К.: Фггосощоцентр, 2001. С. 49-50.
11. Нащональна доповiдь про стан навколишнього природного середовища в Укра1ш у 1996 рощ. Скорочений виклад. - К.: Вид-во Раевського, 1998.- 96 с.
12. Правила проведення бюлопчно! рекультиваци породних вiдвалiв вугшьних шахт Укра1ни. Видання офiцiйне. К.: Мшвуглепром Укра1ни, 2007. -30 с.
13. Растровая электронная микроскопия и рэнтгеновский микроанализ: в 2-х книгах. Книга 2. Пер. с англ./ Гоулдстейн Дж., Ньюбери Д., Эчлин П. и др.-М.: Мир, 1984.-348 с.
14. Трахтенберг И. Книга о ядах и отравлениях.Очерки токсикологии. К.:Наукова думка, 2000.-366 с.
15. Феник С.Й., Трофимяк Т.Б., Блюм Я.Б. Механизмы формирования устойчивости рстений к тяжелым металлам.Успехи современной биологии -1995. - № 2. - С. 261-274.
16. Шевякова Н.И. Метаболизм серы в растениях. М.: Наука, 1979. -С.106-107.
17. Hare P. D., Cress W.A. Metabolic implication of stress-induced prolin accumulation in plants. Plant Growth regul. - 1997. - 21. - P. 79-102.
18. Hoffman E.K., Hoffman E.K., Hendill K.B. The role of amino acids and taurine in isosmotic intracellular regulation in ehrlich ascites mousetumour cells. J.Corp.Physiology.-1976.- B108. - № 3. - P.279-286.
19. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки. М.: Мир, 1976. - С. 173-186.
20. Narayan V.S., Nair P.M. Metabolism, enzymology and possible roles of 4- aminobutirate in higher plants. Phytochemistry. - 1990. - № 2. - P. 367-375.
21. Sisley J.P., Wood P. I. Sulfonation - sulfation. Amer. Deistuff. Report. -1954.- 23. - № 8. - P.741-748.
Стаття надшшла до редакцИ 1.04.2010
159
