CC BY
105
ХИМИЯ
УДК 547.995.12
СИНТЕЗ АМИДОКСИМА ХИТОЗАНА © 2007 г. Е.Н. Федосеева, ЛА. Смирнова, О.Н. Смирнова
Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского [email protected]
Поступила в редакцию 25.05.2007
Синтезированы амидоксимы хитозана различной молекулярной массы полимераналогичными превращениями полиглюкозамина в реакции с акрилонитрилом и последующим взаимодействием продукта с гидроксиламином. Выявлено влияние молекулярной массы на степень замещения функциональных групп хитозана в реакциях нуклеофильного присоединения. Химический состав продуктов синтеза подтверждён методами потенциометрического титрования, ИК-спектроскопии, анализом на содержание азота по Кьельдалю. Выявлена высокая бактерицидность амидоксима хитозана на примере ряда бактерий.
Известно, что полиоксимы - это класс соединений с широким спектром свойств: от высокой реакционной способности до ценных в практическом отношении характеристик [1]. Химическая активность оксимной группы проявляется в полимераналогичных превращениях полиоксимов [2], в ингибировании радикальной полимеризации виниловых мономеров в присутствии акролеиноксима [3]. Способность полимерных оксимов к образованию комплексов с металлами [4] используется при создании сорбентов избирательного действия и высокопрочных мембран [5], а оксиматы металлов, в свою очередь, эффективны как катализаторы [6]. Полимерные амидоксимы, в частности по-лиакролеинамидоксим, отличаются высокой бактерицидной активностью [1].
Синтез полиоксимов осуществляется либо ионной полимеризацией оксимсодержащих мономеров, либо через полимераналогичные превращения - оксимированием карбонилсодержащих полимеров [1]. Однако набор исходных реагентов ограничен, поэтому актуальным является поиск новых источников и методов синтеза полиоксимов. Представляется перспективным получение полиамидоксима на базе природного полисахарида хитозана. Полимерная цепь хитозана состоит из Р-1,4 связанных звеньев 2-дезокси-2-амино^-глюкопиранозы и 2-де-зокси-2-ацетамидо^-глюкопиранозы в соотношении, определяемом степенью деацетили-рования. Функциональные группы хитозана
обладают высокой реакционной способностью, что открывает возможность получения полиок-сима полимераналогичными превращениями с их участием. Синтез оксима хитозана может преследовать двоякую цель. Во-первых, получение полимера, реакционная способность функциональных групп которого позволит проводить дальнейшее модифицирование, в частности реализовать привитую сополимериза-цию. Во-вторых, использование самого амидок-сима хитозана в областях, где традиционно применяются полиоксимы - в качестве ком-плексообразователя, более эффективного, чем исходный хитозан, а также биодеградируемого бактерицидного препарата. Хитозан гипоаллер-генен, легко подвергается деградации в природе под действием специфических ферментов, продукты деградации не загрязняют природу, то есть утилизация хитозана не наносит ущерба окружающей среде. Известно, что сами хитоза-ны различной молекулярной массы являются биологически активными веществами [7-11]. Однако, как отмечают авторы [7], их микробиологическая активность ниже, чем у известных синтетических бактерицидов. Поскольку биоактивность хитозана связывают с наличием в его составе аминогрупп, следует ожидать ее повышения при введении оксимной группы в звено макромолекулы.
Цель настоящей работы - синтез полиами-доксимов на основе хитозанов с различной молекулярной массой в двухстадийном про-
цессе: через получение цианэтилхитозана по реакции с акрилонитрилом и взаимодействием его с солянокислым гидроксиламином по реакции Михаэля.
Экспериментальная часть
Использовали хитозан производства НПО «Биопрогресс» (Московская обл.) с молекулярной массой М = 8.0x10 без предварительной очистки (степень деацетилирования 82%, сухой остаток после прокаливания 0.3%, нерастворимая фракция - не более 0.25%). Низкомолекулярный хитозан получали по методике, описанной в работе [12]. В качестве растворителя использовали растворы уксусной кислоты 1.5-
6 мас.% в дистиллированной воде (СН3СООН квалификации ч. д. а.). Акрилонитрил (АН) предварительно сушили в течение 4 часов едким натром и перегоняли при атмосферном давлении на установке с головкой полной конденсации, собирая фракцию с Ткип=351.5 К (содержание основного вещества 99.4%). Солянокислый гидроксиламин квалификации ч. д. а., метиловый спирт квалификации х. ч., едкий натр квалификации х. ч. использовали без дополнительной очистки.
Молекулярную массу образцов определяли методом вискозиметрии с использованием вискозиметра Уббелоде при температуре 21°С в растворе уксусной кислоты с концентрацией
0.33 моль/л в дистиллированной воде, содержащей также 0.3 моль/л КаС1. Средневязкостную молекулярную массу рассчитывали по
уравнению Марка - Хаувинка [п] = кЫ^ , где
к=3.41х10-5, а=1.01 [13].
Идентификацию состава промежуточного и конечного продукта проводили с использованием методов ИК-спектроскопии (ИК-спектрофото-метр UR-2), потенциометрического титрования (pH метр - pH 410 Аквилон), а также анализа на содержание азота по методу Кьельдаля [14].
Реакции проводили в трёхгорлой колбе, снабженной мешалкой и обратным холодильником. На первой стадии вносили расчетное количество АН в раствор хитозана. Реакционную систему выдерживали при 0°С в течение 2 часов. Концентрацию хитозана в растворе варьировали от 1 до 3 мас.%, концентрация АН не превышала предела растворимости его в воде
- 7.3 % при 293 К. По окончании цианэтилиро-вания отбирали пробу на анализ.
Оксимирование проводили, не выделяя промежуточного продукта из раствора. В 100 мл раствора цианэтилированного хитозана вносили
7 г солянокислого гидроксиламина, растворённого в 7 мл 4% NaOH и 3 мл воды. Процесс осуществляли при 75°С в течение 4 часов. Полимер по окончании реакции высаживали из раствора метанолом, сушили без нагревания до постоянной массы.
Полноту присоединения соответствующего реагента (АН или гидроксиламина) к хитозану на обеих стадиях характеризовали степенью замещения (СЗ) функциональных групп, то есть числом молей АН или гидроксиламина, присоединившихся к мономерному звену хитозана.
Исследование антибактериальной активности полиамидоксима хитозана проводили по стандартной методике [15]: бактерицидную активность определяли по величине диаметра зоны ингибирования роста микроорганизмов. В качестве тест-культур использовали бактерии Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus salivarius, Staphylococcus aureus.
Результаты и их обсуждение
Как отмечено в литературном обзоре, реакция оксимирования используется обычно применительно к карбонилсодержащим полимерам [1]. Однако известен способ превращения поли-акрилонитрила в полиакриламидоксим нуклеофильным присоединением к нитрильным группам гидроксиламина [16]. В настоящей работе с целью получения амидоксима хитозана было проведено цианэтилирование хитозанов различной молекулярной массы в реакции с акри-лонитрилом по методике [17] и оксимирование цианэтилхитозанов по методике [16]. Известно, что реакция Михаэля - это нуклеофильное присоединение соединений с подвижным атомом водорода к поляризованной двойной связи. При проведении реакции в слабокислых растворах (рН~5.5) нуклеофильными свойствами могут обладать гидроксильные группы хитозана, а также оставшиеся непротонированными аминогруппы. Следовательно, цианэтилирова-ние, а соответственно, и дальнейшее оксимирование могут идти по разным направлениям. В результате любого из реализуемых путей мономерное звено модифицированного хитозана приобретает еще одну аминогруппу, первичную или вторичную (схема 2).
Метод инфракрасной спектроскопии подтверждает образование на первой стадии цианэ-тилированного производного хитозана: в спектре продукта появляется новая полоса поглощения 2260 см-1, отсутствующая в исходном хито-зане (рис. 1, линии 1 и 2). Эта полоса соответст-
Схема 1 - реакция цианэтилирования:
о...
CH2= CH-CN
CH2OH
оЛ
H NH I
O- (CH2ÜJ CN
NH2
O
H OH H X —К H
H NH3+
CHrCHrCN
O
O
+
H
Схема 2 - реакция оксимирования:
+ NH2OH.HCI-
(CH2)2- CN
-HCl H
+ NH2OH.HCI
^(CH2)^ C— NH2 NH2 N-OH
ог:
о...
H NH3+
CH2OH
-HCl
Oh Г
H NH N— OH
І II
(CH2)^ C- nh2
O
O
■^4
Рис. 1. ИК-спектры исходного хитозана с М=1 X 10 1, его цианэтилированного производного - 2, ами-доксима хитозана - 3
2 ^ и V-
Рис. 2. Кривые потенциометрического титрования раствором NaOH 0.1 н. раствора HCl - 1, цианэтилированного производного хитозана - 2, хитозана с М=1 X 104 - 3
вует валентным колебаниям цианогруппы [18]. В спектре продукта второй стадии (рис. 1, линия 3) данная полоса полностью исчезает. Наблюдаемое изменение интенсивности пиков при 1600 и 1700 см-1 (абсолютная величина первого падает, а второго возрастает по сравнению со спектром исходного хитозана) мы связываем с увеличением содержания КН-групп. Отмечено также появление полосы поглощения при 1675 см-1, которую мы относили к валентным колебаниям группы С=К имеющим, согласно [18], характеристическое значение 1673 см-1.
Сравнение кривых титрования солянокислых растворов исходного хитозана и его цианэтило-вого производного с М=1х104 (рис. 2) показыва-
ет, что последний отличается двухступенчатой кривой титрования. Такой характер кривой свидетельствует о том, что аминогруппа хитозана вступает в реакцию с акрилонитрилом, а значения рК КН2- и образующихся в результате цианэтилирования КН-групп отличаются. Однако СЗ, рассчитанная по результатам титрования, меньше значения, полученного по содержанию азота в полимере (табл. 1). Это должно означать, что цианэтилирование идет по обоим возможным направлениям. Следовательно, конечный продукт - амидоксим хитозана - содержит мономерные звенья с О- и К-заместителями.
В таблице 1 представлены результаты определения содержания азота в продуктах обеих
Таблица 1
Результаты анализа продуктов реакции хитозана на содержание азота в них по методу Кьельдаля
Молекулярная масса образца X 10-3 Содержание элементарного азота в полимере, мас.%. Степень замещения
Цианэтилированный хитозан Амидоксим хитозана
7 12 15.4 0.70
10 12.5 15.8 0.83
14 12.8 16.3 0.90
19 13.1 16.9 1.00
144 14.5 - 1.6
изучаемых реакций. Исходя из этих данных, рассчитывали СЗ функциональных групп по следующим формулам:
% м = 100 х14(^ +1)
° 161 + 53 хЩА1 ’
% ы = 100 х14(Й^ + Й^сн +1)
0 161 + 53 х С& + 37 х ЙОн^н’
где %К - содержание азота, определяемое анализом по методу Кьельдаля для цианэтилхито-зана и для амидоксим хитозана соответственно. Данные таблицы показывают, что низкомолекулярные амидоксимы имеют СЗ функциональных групп в хитозане от 0.7 до 1. Для высокомолекулярного хитозана в тех же условиях достигается более высокая СЗ. Таким образом, доказано, что при использовании предлагаемого метода модифицирования каждое мономерное звено хитозана в среднем приобретает дополнительную аминогруппу, причём присоединение гидроксиламина к цианэтилхитозану происходит количественно.
Авторы отметили изменение реакционной способности хитозана в реакции цианэтилиро-вания при уменьшении его молекулярной массы, проявляющееся в снижении СЗ. Наблюдаемая закономерность, возможно, объясняется увеличением содержания протонированных аминогрупп, приходящихся на одну молекулу у хитозанов с меньшей молекулярной массой.
Микробиологическую активность хитозана связывают с наличием в его составе аминогрупп. Косвенно это подтверждается тем фактом, что хитозаны с разной степенью деацети-лирования обладают бактерицидностью в разной степени. Из литературных источников известно [1, 2], что оксимы, полученные на основе полиакролеина, также обладают бактерицидными свойствами вследствие наличия в макромолекуле аминогрупп. Мы полагали, что введение дополнительных аминогрупп в звено хитозана приведет к усилению его микробиологической активности. Амидоксим хитозана с молекулярной массой 1 х 104 исследовали в качестве бактерицидного вещества, изучая его биоактив-
ность по отношению к четырём наиболее распространенным бактериям: Echerichia coli (кишечная палочка), Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка), Streptococcus salivarius (стрептококки), Staphylococcus aureus (стафилококки). Результаты исследований представлены в таблице 2.
Таблица 2
Результаты исследований амидоксима хитозана (М=1 X 104) на бактерицидность
Вид бактерий Зона задержки роста, мм
Echerichia coli 16.0
Pseudomonas acruginosa 14.0
Streptococcus salivarius 13.0
Staphylococcus aureus 14.0
Из таблицы 2 видно, что амидоксим хитоза-на обладает высокой бактерицидностью по отношению к изученным видам бактерий. В специальных опытах было показано, что низкомолекулярный хитозан не обладает выраженной активностью к данным бактериям.
Реакционную способность оксимных групп доказывали, проводя реакцию восстановления золота из раствора золотохлористоводородной кислоты раствором амидоксим хитозана. При этом получили устойчивую дисперсию коллоидного золота. Следовательно, химическая модификация хитозана по предлагаемому методу открывает возможности практического использования его в качестве восстанавливающего агента, а также антибактериального средства нового поколения, созданного на основе природного полисахарида, имеющего низкую ал-лергизующую способность. Важно, что проблема с утилизацией амидоксима хитозана в природе легко решается: в работе [17] показано, что существует несколько видов микромицетов, способных разрушать данное вещество.
Таким образом, в работе получены и охарактеризованы амидоксимы хитозана различной молекулярной массы двухстадийным методом -по реакции нуклеофильного присоединения хи-тозана к акрилонитрилу с последующим взаимодействием цианэтилового производного с гидроксиламином солянокислым (реакция Ми-
хаэля). Реакционная способность хитозанов зависит от их молекулярной массы. Амидоксим хитозана с молекулярной массой 1 х 104 обладает ярко выраженной бактерицидной активностью по отношению к наиболее распространенным видам бактерий.
Список литературы
1. Антоник Л.М., Хабибуллина А.Г. // Высоко-молекуляр. соединения. - 2004. - Т. 46, № 12. -С. 2172-2186.
2. Хабибуллина А.Г., Антоник Л.М., Вакульс-кая Т.И., Воронков М.Г. // Доклады Академии наук. -
2002. - Т. 385, № 5. - С. 641-643.
3. Tanaka M., Masuda M., Ota T. // Kobunshi Ron-bunshu. - 1979. - V. 36, № 12. - P. 821.
4. Хабибуллина А.Г., Антоник Л.М., Воронков М.Г. // Наука производству. - 2003. - № 6. -С. 62.
5. Kim S.J., Takizava T. // Makromol. Chem. -1975. - V. 176, № 4. - P. 1217.
6. Пешкова В.М., Савостина В.М., Иванова Е.К. Оксимы. - М.: Наука, 1977. - С. 54.
7. Zhang M., Tianwei T., Huizhu Y. and Changhui R. // Journal of Bioactive and Compatible Polymers. -
2003. - Vol. 18. September. - P. 391-400.
8. Ахметова И.Э. Физиологические особенности формирования защитных реакций пшеницы при действии хитоолигосахаридов: Автореферат дис. ... канд. биол. наук. - Уфа: Институт биохимии и генетики РАН, 2000. - 28 с.
9. Васюкова Н.И., Зиновьева С.В., Ильинская Л.И. и др. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2001. - Т. 37, № 1. - С. 115-122.
10. Nemtsev S.V., Varlamov V.P., Skryabin K.G. // Progress on chemistry and application of chitin and its derivatives / Ed. H. Struszczyk. - Poland: Lodz, 2002. -V. 8. - P. 125-132.
11. Surguchova N.A., Varitsev Yu.A., Chirkov S.N. // J. Russ. Phytopathol. Soc. - 2000. - V. 1, № 1. -P. 59-62.
12. Федосеева Е.Н., Смирнова Л.А., Сорокина М.А., Пастухов М.О. // Журн. прикладной химии.
- 2006. - Т. 79. - Вып. 5. - С. 857-861.
13. Погодина Н.В., Павлов Г.М., Мельников А.В. и др. // Высокомолекуляр. соединения. - 1982. -Т. 28, № 2. - С. 232-239.
14. Баландина В.А., Гурвич Д.Б., Клещева М.С. и др. Анализ полимеризационных пластмасс. Практическое руководство / Под ред. В.Д. Безуглого. - М.-Л.: Химия, 1965. - С. 389-391.
15. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. -М.: Медицина, 1982. - 464 с.
16. Серенсон У., Кемпбел Т. Препаративные методы химии полимеров. - М.: Издательство иностранной литературы, 1963. - С. 211-212.
17. Андриянова Н.А. Модификация хитозана ак-
рилонитрилом - блок- и привитая сополимеризация, полимераналогичные превращения: Автореферат
дис. ... канд. хим. наук. - Нижний Новгород: ННГУ им. Н.И. Лобачевского, 2005. - 28 с.
18. Беллами Л. Новые данные по ИК-спектрам сложных молекул / Под ред. Ю.А. Пентина. - М.: Мир, 1971.
SYNTHESIS OF CHITOSAN AMIDOXIME
E.N. Fedoseeva, L.A. Smirnova, O.N. Smirnova
We synthesize chitosan amidoximes of various molecular weight by polymer-like transformation of polyglucoseamine in reaction with acrylonitrile and then with hydroxylamine. The effect of the molecular weight on the degree of substitution of chitosan functional groups in the reactions of nucleophylic addition is revealed. Chemical structure of synthesis products is verified by potentiometric titration, IR spectroscopy, and Kieldal analysis of nitrogen content. By using several types of bacteria, strong bartericidal action of chitosan amidoxime is demonstrated.
