CC BY
77
Список литературы:
1. Уразаев В. Влагозащита печатных узлов. - М., 2006. - 344 с.
2. Ульрих Майер Вестус Полиуретаны. Покрытия, клеи и герметики. -М.: Пейнт-Медиа, 2009. - 400 с.
3. Карякина М.И. Испытание лакокрасочных материалов и покрытий.
- М.: Химия, 1988. - 272 с.
синтез 68ол-дтиа-октреотида
И АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННОГО ПРЕПАРАТА
© Очкин А.В.*, Андронов В.Г.*,
Брускин А.Б.*, Кодина Г.Е.*
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева,
г. Москва
Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна ФМБА России, г. Москва
Разработан метод мечения модифицированного ДТПА-Октреотида 6^а и анализа полученного препарата. Изучено влияние условий синтеза 68Оа-ДТПА-Октреотида на выход целевого продукта и определены оптимальные условия синтеза. На основании полученных данных успешно проведена серия синтезов 68Оа-ДТПА-Октреотида со стабильным выходом равным 92± 0,9 % (п = 8)).
Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) находит все более широкое применение. В этом методе используются, в первую очередь, «биоген-
11 13 15 18
ные» позитрон-излучающие радионуклиды: С, N О и К Так же мо-
жет быть использован и ряд «неорганических» позитронных излучателей: 55Со, 62Си, 64Си, 62ги, 680а, 75Вг, 76Вг, 82ЯЪ, 86У, 89гг, 94тТс, 1101п 1241, 134Ьа [1]. 6^а (Т1/2 = 68 мин), является одним из наиболее перспективных радионуклидов с позитронным типом распада. Он может быть использован для метки большого числа протеинов, пептидов и малых молекул.
Наибольший интерес к 6^а в последнее десятилетие связан с разработкой методов синтеза высокоспецифичных радиофармпрепаратов на его
* Профессор кафедры Химии высоких энергий и радиоэкологии Российского химико-технологического университета им. Д.И. Менделеева, доктор химических наук, профессор.
* Аспирант кафедры Химии высоких энергий и радиоэкологии Российского химико-технологического университета им. Д.И. Менделеева.
* Ведущий научный сотрудник отдела Радиационных технологий медицинского назначения ФГУ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России, кандидат химических наук.
* Заведующий отделом Радиационных технологий медицинского назначения ФГУ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России, кандидат химических наук, профессор.
основе. Большинство работ в этом направлении посвящено получению и исследованию меченых синтетических аналогов соматостатина. Опубликованы клинические данные, иллюстрирующие более высокие чувствительность и специфичность ПЭТ с препаратами 68Ga в диагностике нейроэндокринных опухолей по сравнению с 18Р-ФДГ (фтордезоксиглюкоза) и 1111п-октреотидом [2-6].
Аналог соматостатина - октреотид, меченный 68Ga может быть использован для визуализации нейроэндокринных и некоторых других опухолей методом ПЭТ. Основным преимуществом 68Ga по сравнению с другими позитрон-излучающими радионуклидами является возможность многократного элюирования генератора 68Ge/68Ga непосредственно в клинике.
Проведение реакции мечения модифицированного пептида с 68Ga предъявляет ряд требований к используемому раствору радионуклида. Для получения высокого выхода в реакции мечения исходные растворы радионуклидов должны иметь низкую кислотность (< 0,1 М) и, в идеальном случае, не должны содержать примесей других элементов и стабильных изотопов целевого радионуклида (которые будут конкурировать с радионуклидом в реакциях комплексообразования), а требуемое количество активности должно находиться в малом объеме раствора. Достаточно часто минимальные дозировки составляют 500-2000 МБк в объеме 50-100 мкл при удельной активности не менее 1000 МБк/мкг. При этом термин «удельная активность» в современной литературе трактуется как отношение активности радионуклида к общему весовому количеству любых веществ, присутствующих в растворе.
Объектами данной работы являются отечественный генератор 68Ge / 68Ga и октреотид, модифицированный ДТПА (ДО) (Фармсинтез, Россия).
Целью данной работы являлось мечение ДО 68Ga и анализ полученного препарата.
Материалы и методы
Генератор. В работе использовали изотопный генератор 68Ge / 68Ga на основе диоксида титана, модифицированного двуокисью циркония, разработанный ГНЦ Институт биофизики совместно с АОЗТ «Циклотрон» (Обнинск) [7, 8]. Активность 68 Gе в генераторе на момент поставки составляла 800 МБк. В качестве раствора для элюирования 68 Ga применяется 0,1 М соляная кислота.
Установка для кондиционирования элюата генератора 68Ge / 68Ga. В работе использовали прототип полуавтоматической установки для быстрой и надежной процедуры концентрирования и очистки от примесей элюата генератора 68Ge / 68Ga, обеспечивающий получение до 600 МБк 68Ga в 120 мкл 0,01 М HCl, с 20 кратной очисткой от материнского 68Ge, а так же 10100 кратной очисткой от химических примесей металлов [9]. Сбор продукта
кондиционирования осуществляли в микрофлакон, установленный в свинцовом защитном контейнере. Установка смонтирована в защитном боксе в непосредственной близости от генератора б^е / 68Ga. Все измерения активности образцов проводили на дозкалибраторе Robotron 20046 (ГДР).
Методика мечения пептида. В качестве модельного пептида для мече-ния был выбран коммерчески доступный ДО (Фармсинтез, Россия). В полимерный флакон содержащий 100-200 мкл кондиционированного элюата генератора 68Ge / 68Ga добавляли 100 мкл буферного раствора и 5 мкл водного раствора пептида (0,5 мг/мл), таким образом, в полученном растворе содержание препарата составляло 2,5 мкг; ~ 2 нМ пептида. Инкубация полученной смеси длилась в течение 30 мин при комнатной температуре.
Анализ реакционной смеси мини-колоночным методом. Мини-колонку (фирма Waters, кат. № WAT023501, 130 мг), содержащую силикагель с привитыми к его поверхности октадецильными группами С18, промывали вначале 20 мл метанола или этанола, а затем 20 мл воды. В подготовленную таким образом колонку помещали 5-10 мкл исследуемого раствора и
промывали колонку вначале 5 мл дистиллированной воды, а затем 10 мл метанола, собирая прошедшую через колонку жидкость. Активность этих жидкостей, а также самой колонки измеряли на дозкалибраторе Robotron 20046 (ГДР), выход реакции мечения рассчитывали по формуле:
% =-------Aщон----------------------------------х100 (i)
A + A + A
AH2O ~ AMeOH ~ Акол.
где АН2О - активность водной фракции;
АМеоН - активность метанольной фракции;
Анализ реакционной смеси методом ВЭЖХ. Анализ осуществлялся на хроматографе фирмы Analyst (США) в изократическом режиме на колонке С18 (Serva), растворитель ацтонитрил-вода-0,05М фосфатный буфер в соотношении 80:20:1 по объему. Детектирование - УФ при длине волны 220 нм. Элюат после колонки собирали по фракциям объемом 1 мл каждая. Активность фракций измеряли на дозкалибраторе Robotron 20046 (ГДР). Радиохимический выход рассчитывали по формуле:
% = -¡T- (2)
общ.
где Ап - активность во фракциях, содержащих меченный ДО;
Ас0Щ - сумма активностей всех фракций.
Анализ реакционной смеси методом ТСХ. На пластинке длиной 100 мм на расстоянии 15 мм от края проводили линию старта и на расстоянии 5 мм от другого края проводили линию финиша. 2-4 мкл исследуемого раствора
наносили на линию старта и после высушивания на воздухе хроматографировали восходящим методом в различных системах. После достижения растворителем линии финиша пластинку вынимали, высушивали на воздухе, обклеивали липкой лентой и подвергали авторадиографированию на рентгеновской пленке в течение 0.5-2 час. В соответствии с результатами авторадиографии пластинку разрезали на части. Радиоактивность полученных частей измеряли на дозкалибраторе Robotron 20046 (ГДР), радиохимический выход реакции мечения рассчитывали по формуле:
% = Адо (3)
Адо + Аост (3)
где АдО - активность части хроматограммы, содержащей продукт мечения;
Аост - активность остальной части хроматограммы.
Результаты и обсуждение
Разрабатываемый метод анализа должен надежно разделять меченный ДО, а также две наиболее вероятные примеси: несвязанный радионуклид (в виде свободного иона или соединения с компонентами буферного раствора) и его комплекс с ДТПА, отщепившимся от ДО.
При разработке метода анализа были испытаны различные сорбенты (силикагель, окись алюминия, целлюлоза, целлюлоза F) на алюминиевой или пластиковой подложке и хроматографическая бумага Whatman №3 и Р. В качестве растворителя применялись смеси метанол / вода или ацетонитрил / вода в различных соотношениях, без или с добавлением ДТПА или Трилона Б (натриевой соли этилендиаминотетрауксусной кислоты). Некоторые результаты анализа приведены в табл. 1.
Наилучшие результаты были получены на пластинках целлюлозы на алюминиевой или пластиковой подложке (фирмы «Merck», кат. №№ 5552 и 5578), подвижная фаза - смесь ацетонитрил-вода в соотношении 1:1 (по объему). В этих условиях меченое соединение имеет Rf 0,95-1,0, комплекс 1111п-ДТПА 0,75-0,80 и несвязанный 111In 0,0-0,5 (в зависимости от рН и состава реакционной смеси). Использование пластинок на алюминиевой подложке для радиохроматографического анализа предпочтительно, т.к. слой носителя на них закреплен лучше и не осыпается в процессе разрезания пластинки. Использование целлюлозы F незначительно удлиняет время хроматографирования. Качество авторадиограммы несколько хуже, но количественные результаты практически тождественны. Добавление к растворителю комплексообразователя или замена воды буферным раствором не привели к существенному изменению разделения. При хроматографировании на бумаге, ни при каких условиях не удалось добиться надежного разделения компонентов реакционной смеси.
Таблица 1
Результаты анализа реакционной смеси в различных условиях
№ п/п Тип пластины Элюент (соотн.) Время анализа, мин Примечания
ш1п-ЭО ш1п-ЭТРЛ свободн. 1111п
1. силикагель на алюминии ацетонитрил-вода (7:3) 0,8-1,0 0,4-0,9 0,9-0,5 60 Нечеткое разделение
2. целлюлоза на алюминии метанол 0,6-1,0 0,3-0,7 0,0-0,03 55 -//-
3. силикагель на алюминии метанол-вода (1:1) 0,8-1,0 0,4-0,8 0,0-0,35 80 -//-
4. целлюлоза на алюминии ацетонитрил-вода (1:1) 0,9-1,0 0,6-0,8 0,0-0,5 30 Хорошее разделение
5. целлюлоза на алюминии ацетонитрил-вода (3:2) 0,9-1,0 0,5-0,8 0,0-0,6 30 Пятна «хво-стят»
6. целлюлоза на алюминии метанол-вода (7:3) 0,6-0,8 0,2-0,4 0,0-0,3 50 -//-
7. целлюлоза на алюминии ацетон-вода (3:2) 1,0-0,9 0,5-0,6 0,0-0,3 40 -//-
8. целлюлоза F на алюминии ацетонитрил-вода (1:1) 0,9-1,0 0,6-0,8 0,0-0,6 40 Хорошее разделение
9. целлюлоза на алюминии ацетонитрил-вода (1:1) 0,9-1,0 0,6-0,8 0,0-0,5 30 с добавл. Трилона Б
Достоверность предложенного метода была подтверждена при сравнительном анализе одних и тех же образцов методами ТСХ (предложен нами), микроколоночным (стандартный метод анализа производителя препарата OctreoScan), и радио-ВЭЖХ (наиболее точный метод). Сравнительные результаты анализа одной из реакционных смесей 3-мя различными методами приведены в табл. 2.
Таблица 2
Результаты анализа одного образца 1111п-ДО различными методами
Компонент Метод
ТСХ Мини-колонки ВЭЖХ
Продукт ш1п-ДО 87.6 84.7 82.5
Іп-ДТПА 11.4 13.9 8.9
Свободный ІП 1.0 1.4 8.6*
Примечание: *сумма остальных пиков
Как видно из представленных данных, все методы практически одинаково (в пределах точности радиометрии) определяют радиохимическую чистоту продукта. Наблюдаемые расхождения в оценке соотношения примесей обусловлены различиями в методике проведения анализов.
Использование метода ВЭЖХ для анализа реакционной смеси позволяет получить лучшее разрешение, чем при использовании методов ТСХ и
картриджей, однако ВЭЖХ является наиболее дорогим из использованных методов. Кроме того, в анализе методом ВЭЖХ существует возможность неконтролируемого осаждения несвязанного индия на колонке и, как следствие, получение неверных данных. В этом случае также вероятна деструкция привитой фазы на поверхности носителя, что приводит к ускоренному выходу колонки из строя.
На основании полученных результатов для анализа реакционных смесей, содержащих 68ва-ДО, была выбрана ТСХ-система:
- носитель - целлюлоза на алюминиевой (№5552) или пластиковой подложке;
- подвижная фаза - ацетонитрил-вода 1:1 по объему
- при этом размер пластины был уменьшен до 70 мм, что позволило сократить время анализа до 15 мин.
Изучение влияния условий синтеза 68Ga-ДО на выход целевого продукта. В литературе данные о взаимодействии ДО с галлием не встречаются. В качестве эталона (модели) при изучении возможности введения 6^а в молекулу ДО и разработки метода контроля радиохимической чистоты меченых образцов использовали аналогичный препарат 1111п. Это соединение в комплексе с 1111п широко известно в ядерной медицине как OctreoScan™. Период полураспада 1111п (2,83 сут) обеспечивает возможность длительных экспериментов, а состав и технология приготовления были к моменту выполнения настоящей работы хорошо известны.
Прямой перенос условий получения 1111п-ДО не привел к положительному результату в случае 6^а (см. рис. 1). Из литературных данных известно, что для получения высоких выходов (> 90 %) в реакциях синтеза биоконъюгатов с 6^а как правило требуется нагревание реакционной смеси, что усложняет процесс приготовления препарата и приводит к большим временным затратам.
Рис. 1. Зависимость реакции мечения ДТПА-октреотида 1111п и 68ва от pH в цитратном (а) и ацетатном (б) буферных растворах
Поэтому был исследован широкий круг возможных буферных сред, выбор которых был сделан по следующим критериям:
- возможность внутривенного введения пациенту;
- нелетучесть в условиях приготовления лиофилизата;
- слабые комплексообразующие свойства;
- высокий выход мечения (не ниже 90 %) при проведении реакции при комнатной температуре и времени инкубирования не дольше 30-ти минут;
- высокий выход мечения при физиологических значениях рН и мо-лярности раствора.
В экспериментах были использованы буферные системы - ацетат, фосфат, тартрат, глицин, аргинин, никотинамид, аминокапроновая, аскорбиновая кислоты и др.
В ряде опытов мечение проводилось при повышенной температуре. Выход реакции мечения увеличивается незначительно, при этом возрастает возможность термической деструкции пептида.
В отдельных экспериментах удалось получить выход реакции мече-ния, близкий к 90 % в присутствии ацетата, фосфата, глицина, никотина-мида и аминокапроновой кислоты. Однако эти результаты имели случайный характер и, как правило, регулярно не воспроизводились.
Для последующих экспериментов с использование кондиционированных растворов 6^а были выбраны ацетатный и фосфатный буферный растворы (см. рис. 2).
Рис. 2. Зависимость выхода 68ва-ДО от pH ацетатного (а) и фосфатного (б) буферных растворов
Эксперимент был проведен с использованием как исходного, так и кондиционированного элюатов. При использовании кондиционированного элюата выход 68ва-ДО достиг значения 91,8 ± 0,9 % (п = 8) в ацетатном буферном растворе. В то время как при использовании некондициониро-ванного элюата выход 68ва-ДО отличался значительной невоспроизводи-мостью результатов и составил 52 ± 22 % (п = 20).
* * *
Разработан метод мечения модифицированного ДТПА-окгреотида 68Ga и анализа полученного препарата. Изучено влияние условий синтеза 6^а-ДО на выход целевого продукта и определены оптимальные условия синтеза.
Наилучшие результаты синтеза (выход продукта 91,8 ± 0,9 % (п = 8)) получены с использование кондиционированных растворов 68Ga в ацетатном буферном растворе. При этом объем реакционной смеси был снижен до минимально возможного.
Наилучшие аналитические результаты были получены методом ТСХ на пластинках целлюлозы на алюминиевой или пластиковой подложке, подвижная фаза - смесь ацетонитрил-вода в объемном соотношении 1:1.
Успешно проведено первичное биологическое тестирование получе-ных биоконъюгатов, меченных 68Ga, in vitro и in vivo.
Список литературы:
1. Дмитриев С.Н., Зайцева Н.Г., Очкин А.В. Радионуклиды для ядерной медицины и экологии. Ядерные данные, методы получения, применение в ядерной медицине и мониторинге окружающей среды: учеб. пособие. - Дубна: ОИЯИ, 2001. - С. 12.
2. Breeman A.P., de Jong M., de Blois E. et al. Radiolabelling DOTA-peptides with 68Ga // Eur.J. Nucl. Med. Mol. Imaging. - 2005. - V 32, № 4. - Р. 478-485.
3. Ambrosini V, Tomassetti P., Campana D. et al. 68Ga-DOTA-NOC and 18F-DOPA PET in the evaluation of patients with neuroendocrine tumours // Eur.J. Nucl. Med. Mol. Imaging. - 2007. - V 34, № 10, Suppl. 2. - Р. 192.
4. Singh A., Hart J.L., Knap T. et al. Clinical significance of adrenal uptake with 68Ga-DOTA-octreotate PET imaging // Ibid. - Р. 192.
5. Aloj L., Caraco C., Aurilio M. et al. 68Ga-DOTAtoc PET: Our experience with 120 Patient Studies // Ibid. - Р. 192.
6. Buchmann I., Engelbrecht S., Yenze M. et al.Comparison of (68Ga)-Dotatoc-PET and (111In) Dtpaoc (Octreoscan®)-Spect in Patients with Neuroendocrine Tumours // Ibid. - Р. 192.
7. Кодина ГЕ., Козлова М.Д., Малинин А.Б. и др. / Патент РФ № 2126271 «Радионуклидный генератор 68Ge/68Ga для получения физиологически приемлемого раствора», приоритет от 20.02.1999.
8. Razbash A.A., Sevastianov Yu. G., Tolstouhov Yu. V et al. Germanium-68 Problem Progress.-Proceedings of the Seventh Workshop on Targetry and Target Chemistry. Heidelberg, Germany, June 8-11, 1997, p.48-50.
9. Андронов В.Г., Брускин А.Б., Севастьянова А.С., Кодина Г.Е., Очкин А.В., Мясоедова Г.В. Сорбционное кондиционирование элюата генератора 68Ge/68Ga для медицинского применения с использованием волокнистых наполненных сорбентов Полиоргс // Радиохимия. - 2008. - Т. 50, № 5. - С. 464-468.
