CC BY
48УДК 616-03 DOI: 10.37279/2224-6444-2021-11-4-17-26
СИЛОХРОМ С-120 И ЕГО ПРОИЗВОДНЫЕ КАК ВОЗМОЖНЫЕ КОНТАКТНЫЕ АКТИВАТОРЫ КЛЕТОК КРОВИ ДЛЯ МАЛООБЪЕМНОЙ ГЕМОПЕРФУЗИИ
Киричук О. П.1,2, Юрьев Г. О.3, Буркова Н. В.1, Постнов В. Н.13, Романчук Е. В.2, Свиридов Э. Е.1, Киселева А. В.1, Литвиненко Е. В.1, Романова О. Б.1, Кузнецов С. И.1
'ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова Минздрава России, 197341, ул. Аккуратова 2, Санкт-Петербург, Россия
2ФГАОУ ВО Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого, 195251, ул. Политехническая 29, Санкт-Петербург, Россия
3ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет, институт химии, 198504, Петергоф, Университетский проспект 26, Санкт-Петербург, Россия
Для корреспонденции: Буркова Наталья Владимировна, доктор биологических наук, доцент, заведующий кафедрой физиологии, «Национальный медицинский исследовательский центр им. В. А. Алмазова» Минздрава России, е-mail: [email protected].
For correspondence: Natalia V. Burkova, MD, Head of the Department of Physiology, "V.A. Almazov National Medical Research Center", е-mail: [email protected].
Information about authors:
Kirichuk O. P., https://orcid.org/0000-0003-0933-9505 Yuryev G. O., https://orcid.org/0000-0003-3330-6324 Burkova N. V., https://orcid.org/0000-0002-0197-1146 Postnov V. N., https://orcid.org/0000-0001-6094-36607 Romanchuk E. V., https://orcid.org/0000-0002-8561-8736 Sviridov E. E., https://orcid.org/0000-0001-8962-2073 Kiseleva A. V., https://orcid.org/0000-0003-4874-4503 Litvinenko E. V., https://orcid.org/0000-0003-3464-0930 Romanova O. B., https://orcid.org/0000-0001-6803-4563 Kuznetsov S. I., http://orcid.org/0000-0002-8740-6956
РЕЗЮМЕ
Продолжается поиск новых гемоконтактных препаратов, обладающих гемосовместимостью и выраженным активационным воздействием на клеточные и гуморальные системы крови для возможного их использования в клинической практике при проведении малообъемной гемоперфузии (МОГ). Целью работы являлась оценка способности пяти гранулированных гемосорбентов разной химической структуры активировать клетки крови по скорости их адгезии к поверхности гранул, контактирующих с кровью in vitro.
Гемоконтактное взаимодействие проводили в стендовых условиях с использованием донорской крови в ротационном режиме. Пробы крови брали до начала эксперимента и через 5, 20, 40 и 60 минут. Выполнено по 10 экспериментов с каждым из 5 исследуемых сорбентов. Оценивали изменения в клеточных и субклеточных популяциях крови с помощью гематологического анализатора SySmex XT 1800i (26 параметров), что давало возможность косвенно судить об активации клеток крови.
Результаты исследования доказали, что показатели скорости адгезии могут быть индикаторами активации клеток крови при контакте с чужеродными поверхностями и служить критерием оценки активационных возможностей этих поверхностей при использовании метода МОГ. Карбосилохромфуллерен С60 (КСХФ) может быть рекомендован для дальнейших исследований при создании гемоконтактных препаратов, используемых в клинике.
Ключевые слова: малообъемная гемоперфузия, адгезия, контактная активация клеток крови, клеточные популяции крови, тромбоциты, лейкоциты.
SILOCHROME C-120 AND ITS DERIVATIVES AS POSSIBLE CONTACT ACTIVATORS OF BLOOD CELLS FOR LOW-VOLUME HEMOPERFUSION
Kirichuk O. P.12, Yuryev G. O.3, Burkova N. V.1, Postnov V. N.13, Romanchuk E. V.2, Sviridov E. E.1, Kiseleva A. V.1, Litvinenko E. V.1, Romanova O. B.1, Kuznetsov S. I.1
'Almazov National Medical Research Centre, St. Petersburg, Russia
2Peter the Great Saint Petersburg Polytechnic University, St. Petersburg, Russia
3St. Petersburg State University, Institute of Chemistry, St. Petersburg, Russia
SUMMARY
The search continues for new hemocontact drugs with hemocompatibility and a pronounced activation effect on the cellular and humoral blood systems for their possible use in clinical practice during low-volume hemoperfusion (LVH). The aim of work was to assess the ability of 5 granular hemosorbents of different chemical structure to activate
blood cells by the rate of their adhesion to the surface of granules in contact with blood in vitro.
Blood-contact interaction was carried out in bench conditions with the use of donated blood in rotary mode. Blood samples were taken before the experiment and after 5, 20, 40 and 60 min. 10 experiments were performed with each of the 5 studied sorbents. Changes in blood cell and subcellular populations were evaluated using the Sysmex XT 1800i hematological analyzer (26 parameters), which made it possible to indirectly judge the activation of blood cells.
The results of the study proved that the adhesion rate indicators can be indicators of the activation of blood cells upon contact with foreign surfaces and serve as a criterion for assessing the activation capabilities of these surfaces when using the LVH method. Carbosylochromfullerene C60 can be recommended for further research in the creation of blood-contact drugs used in the clinic.
Key words: low-volume hemoperfusion, adhesion, contact activation of blood, hemosorbent, blood cell populations, platelets, leukocyte.
Разработана новая медицинская технология - малообъемная гемоперфузия (МОГ), основанная на принципе контактной твердофазной гемомодуляции, которая дала выраженный положительный эффект при включении ее в стандартные схемы лечения ряда тяжелых заболеваний конечностей [1]. Ключевым фактором, играющим решающую роль в достижении существенного лечебного эффекта при использовании МОГ, является гемоконтактный препарат (сорбент), обеспечивающий активацию клеток крови, в результате которой значительно меняется постконтактный спектр биологически активных соединений в крови, что оптимизирует процессы саногенеза в пораженных тканях. В работах, проведенных ранее, были исследованы гемоконтактные препараты по критериям гемо-совместимости и активационных возможностей. Получены данные, что сорбент Силохром С-120 обладает выраженными активационными свойствами для тромбоцитов и лейкоцитов, являющихся основными продуцентами биоактивных структур в крови, но проявляет выраженную гемолитическую активность для эритроцитов [2; 3]. Возникла необходимость в проведении химической модификации поверхности Силохрома С-120. При этом необходимо сохранить актива-ционный потенциал модифицированных гемо-контактных препаратов, значительно уменьшив их гемолитические свойства [4]. Данная работа посвящена исследованию и сравнению актива-ционных свойств Силохрома С-120 и его производных.
Целью исследования явилась оценка актива-ционных способностей гемосорбента Силохром С-120 и его модифицированных производных в процессе их динамического контакта с венозной кровью человека in vitro.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В стендовых условиях оценивали и сравнивали активационный потенциал Силохрома С-120 и четырех модификаций этого препарата для прилипающих клеток крови. В эксперименте использовали венозную кровь здоровых доноров, которую забирали из локтевой вены в вакуумную пробирку с гепарином лития в объеме
9,0 мл. Кровь получали на станции переливания крови ФГБУ «НМИЦ им. В. А. Алмазова» Минздрава России.
Заключение этического комитета ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» МЗ РФ (протокол №154 от 10.10.16г.: «Одобрить проведение исследований по протоколу проекта «Апробация сверхсшитого полистирола (марки MN) и сили-кагелей (Силохрома С-120 и КСК-2) в качестве гемоконтактных препаратов в стендовых условиях на базе Центра».
В работе были исследованы пять сорбентов (Силохром С-120 и четыре его модификации).
1. Силохром С-120 - гранулы белого цвета неправильной формы размером 0,3-0,5 мм. Удельная поверхность образца, определенная по низкотемпературной адсорбции азота методом BET составила 154 м2/г, размер пор, определенный методом BJH - 32 нм.
2. Аминированный Силохром С-120 с сорбированным трисмалонилфуллереном С60 (ТМФС) - гранулы того же размера с удельной поверхностью 140 м2/г и размером пор 32 нм. Аминированние Силохрома С-120 проводили жидкофазным методом, предварительно удалив физически связанную воду с поверхности кремнезема. Синтез композита аминированно-го аэросилогеля с трисмалонилфуллереном С60 осуществляли следующим образом: в насыщенный раствор (10 мл) трисмалонилфуллерена С60 помещали навеску (100 мг) аминированного аэросилогеля и проводили сорбцию в течение 8 часов при температуре 20оС и интенсивном перемешивании на шейкере. В результате процесса сорбции основные характеристики сорбента изменились незначительно, сохранилась глобулярная структура и высокая удельная поверхность.
3. Минерально-углеродный сорбент (Кар-босилохром) - гранулы того же размера с удельной поверхностью 104 м2/г и величиной предельного сорбционного объема 0,65 см3/г. Синтез проводился в реакторе проточного типа в режиме кипящего слоя, путем пиролиза про-паргилового спирта в токе азота, очищенного от кислорода, на кремнеземных матрицах при
температуре 800оС. Содержание углерода, определенное методом Прегля, составило 9 % масс.
4. Минерально-углеродный сорбент с сорбированным фуллереном С60 (Карбосилох-ром + Фуллерен, КСХФ). Удельная поверхность гранул - 96 м2/г, величина предельного сорбци-онного объема - 0,60 см3/г, диаметр пор - 24 нм. Навеску исходного сорбента (Карбосилохром), предварительно высушенную при 200оС помещали в раствор фуллерена С60 в о-ксилоле концентрации 1 г/л. Данную суспензию сорбента и раствора фуллерена С60 встряхивали на шей-кере в течение 5 часов. Содержание фуллерена С60 в образце после сорбции составило 4 мг/г.
5. Аминированный силохром с ковалент-но пришитым трисмалонилфуллереном С60 (ТМФС-К) - гранулы размером 0,3-0,5 мм с удельной поверхностью 140 м2/г и размером пор 32 нм. Для получения данного сорбента использовались аминированный аэросилогель, трисмалонилфуллерен С60 и водорстворимый карбодиимид ^-(3-диметиламинопропил-) ^этилкарбодиимид). Синтез проводили следующим образом: в раствор трисмалонилфул-лерена С60 (10 мл) помещали навеску (100 мг) аминированного аэросилогеля и 2 мл карбоди-имида, затем полученную смесь перемешивали на шейкере в течение 8 часов при температуре 20оС.
При проведении гемоконтактной процедуры было выполнено 50 экспериментов (по 10 с каждым из исследуемых сорбентов).
Гемоконтактные колонки для стендовых экспериментов готовили из одноразовых шприцов объемом 20 мл. В них загружали указанные выше сорбенты в объеме 1,8-2,0 мл, хранящиеся в 20% растворе этанола. Перед началом опытов колонки трижды промывали 10-кратным объемом стерильного физиологического раствора и еще три раза 10-кратным объемом того же раствора с гепарином (20 ед./мл). После промывки в шприц-колонку забирали гепаринизирован-ную донорскую кровь из вакуумной пробирки из расчета сорбент: кровь (1:4). Предварительно из этой же пробирки отбирали пробу крови «до контакта». Колонки с кровью помещали в горизонтальном положении на роторную мешалку. Эксперименты проводились в течение 60 мин при комнатной температуре в постоянном ротационном режиме. Для проведения исследований пробы крови забирали из колонки через 5, 20, 40 и 60 мин после начала контакта в объеме 1,8 -2,0 мл в пробирки с ЭДТА. Во всех пробах регистрировали показатели крови (26 параметров) с использованием гематологического анализатора SySmex ХТ 1800i (Япония). На основании полученных данных по изменениям в популяци-
ях и субпопуляциях клеток крови составляли и графически изображали скоростно-временные адгезивные профили (СВАП) для каждого из сорбентов, а также оценивали их активацион-ные возможности по скорости адгезии прилипающих клеток крови в различные временные интервалы [5]. После окончания эксперимента цельную кровь центрифугировали в течение 10 минут при скорости 3000 об/мин на лабораторной центрифуге Thermo Scientific SL 16 и отделяли плазму крови от форменных элементов. Плазму крови замораживали и хранили до проведения необходимых исследований.
Статистический анализ полученных результатов проводили с использованием прикладных пакетов Statistica 7.0 for Windows и Excel 2013. Статистически значимые изменения показателей внутри групп оценивали с помощью t критерия Стьюдента для попарно связанных выборок и критерия Вилкоксона для парных сравнений, статистически значимые различия показателей между группами - с помощью t критерия Стью-дента для независимых выборок и U-критерия Манн-Уитни. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
При взаимодействии крови с твердофазными поверхностями происходит прилипание части клеток, которые обладают выраженным адгезивным аппаратом. К таким клеткам прежде всего относятся тромбоциты и лейкоциты. Чтобы количественно выразить степень взаимодействия прилипающих клеток крови с сорбентами, был предложен способ построения СВАП для любого твердофазного материала, контактирующего с кровью, а также способ расчета скорости адгезии клеток к гемоконтактным препаратам в любой промежуток времени контакта. Скорость адгезии клеток крови может быть как положительной, когда количество клеток, прилипающих к сорбенту, превышает количество клеточных элементов, переходящих обратно в жидкую фазу крови, так и отрицательной, если процесс десорбции клеток преобладает над их фиксацией. По СВАП и скорости адгезии клеток можно косвенно судить о степени активации клеток на данном гемоконтактном препарате и предполагать об интенсивности поступления в кровь биологически активных молекул, которые будут влиять на процессы саногенеза в очаге повреждения. Это позволит выбрать один из исследованных препаратов, обладающий наиболее выраженным эффектом при лечении заболеваний методом МОГ [5].
На рисунке 1 представлены результаты исследований СВАП гемоконтактных препаратов Си-
лохрома С-120 и его четырех химически модифицированных производных, построенных для тромбоцитов крови человека. Профиль ТМФС-К отличается от общей картины СВАП и характеризуется существенным снижением показателя адгезии тромбоцитов в интервале «0 - 5 мин» по сравнению с другими препаратами, а также появлением второй реперной точки «20 мин», когда процессы адгезии тромбоцитов на сорбенте еще преобладают над процессами их перехода в жидкую фазу. Другие исследованные сорбенты имеют идентичные СВАП - максимум адгезии клеток в пробах «5 мин» с последующем периодом развития десорбции до конца эксперимента, то есть превалирует уход клеток с препаратов в жидкую фазу крови.
40
60
Время, мим
Рис.1
Проводили сравнение препаратов по скорости адгезии клеток в разные временные интервалы контакта, т.е. по их способности активировать тромбоциты. Было отмечено, что активаци-онный потенциал всех сорбентов (за исключением ТМФС-К) реализуется в первые «5 мин» контакта. Наибольшие показатели скорости адгезии тромбоцитов зафиксированы на КСХФ -32, 4 ± 2,82 х 103 кл/мкл/мин. Показатели скорости адгезии на других 3 препаратах схожи: Силохром С-120 - 30,6 ± 1,62 х 103 кл/мкл/мин; КСХ - 29,9 ± 1,62 х 103 кл/мкл/мин; ТМСФ -30,3 ± 1,78 х 103 кл/мкл/мин. Отмечены различия показателей на сорбенте ТМФС-К - 21,7 ± 1,47 х 103 кл/мкл/мин (р<0,05). Максимальная скорость перехода тромбоцитов в жидкую фазу крови происходит на Силохроме С-120 и ее показатели существенно отличаются (р < 0,05) от показателей всех производных препаратов. Фиксированный на Силохроме С-120 углерод (КСХ) при контакте с кровью практически не меняет показатели скорости адгезии на нем тромбоцитов, но при этом на 30% снижается скорость десорбции клеток (р < 0,05). Введение в структуру препаратов трисмалонилфуллерена С60 сорб-ционным методом (препараты КСХФ и ТМФС) незначительно повышает скорость десорбции
тромбоцитов с этих препаратов. Ковалентная «пришивка» трисмалонилфуллерена С60 к матричному силикагелю (препарат ТМФС-К) при контакте с кровью вызывает существенное снижение как скорости адгезии, так и скорости десорбции клеток с сорбента и их возврат в жидкую фазу крови. Скорость десорбции тромбоцитов с ТМФС-К в 2,0 - 2,8 раза меньше по сравнению с другими препаратами. Таким образом, по скорости адгезии тромбоцитов все исследованные препараты можно расположить в следующем порядке: КСХФ (32,4 ± 2,82 х 103 кл/ мкл/мин) > Силохром С-120 (30,6 ± 1,62 х 103 кл/мкл/мин) > ТМФС (30,3 ± 1,78 х 103 кл/мкл/ мин) > КСХ (29,9 ± 1,62 х 103 кл/мкл/мин) > ТМФС-К (21,7 ± 1,47 х 103 кл/мкл/мин). При оценке скорости десорбции данный ряд сорбентов можно представить в следующем виде: Си-лохром С-120 (-2,02 ± 0,09 х 103 кл/мкл/мин) > ТМФС (-1,59 ± 0,11 х103 кл/мкл/мин) > КСХФ (-1,51 ± 0,13 х 103 кл/мкл/мин) > КСХ (-1,44 ± 0,06 х 103 кл/мкл/мин) > ТМФС-К (-0,71 ± 0,07 х 103 кл/мкл/мин).
40
60
Время, мин
Рис.2
На рисунке 2 представлена реакция лейкоцитов крови на ее контактное взаимодействие со всеми исследованными препаратами. Максимальный адгезивный эффект развивается в первые «5 мин» контакта. При этом появляется вторая реперная точка - «20 мин». В период «0 - 20 мин» на всех сорбентах процесс адгезии/сорбции преобладает над процессом десорбции. Начиная с «20 мин» и до конца эксперимента скорость адгезии регистрируется в отрицательном диапазоне, т. е. идет переход лейкоцитов с поверхности сорбентов в жидкую фазу крови. Сравнивая скорости адгезии лейкоцитов во временной интервал «0-5 мин» (первая реперная точка), можно отметить, что эти показатели скорости не различаются у всех сорбентов, кроме ТМФС-К. Силохром С-120 с ковалентно связанным трисмалонилфуллереном С60 обладает гораздо менее выраженными показателями скорости адгезии, чем другие исследуемые препараты, которые по уменьшению скорости адгезии в этот
период контакта можно расположить в следующем порядке: Силохром С-120 (501,0 ± 44,41 х 103 кл/мкл/мин) > КСХФ (497,5 ± 24,43 х 103 кл/мкл/мин) > ТМФС (487,6 ± 39,20 х 10 3 кл/ мкл/мин) > КСХ (441,0 ± 34,44 х 103 кл/мкл/ мин) > ТМФС-К (304,0 ± 20,57 х 103 кл/мкл/ мин). При этом скорость адгезии лейкоцитов на ТМФС-К ниже (р < 0,05), чем на других исследуемых препаратах. При рассмотрении показателей скорости адгезии в интервале «0 - 20 мин» (вторая реперная точка) можно отметить схожесть полученных результатов: Силохром С-120 - 134,4 ± 10,50 кл/мкл/мин; КСХ -146,5 ± 6,77 кл/мкл/мин; КСХФ - 137,8 ± 9,69 кл/мкл/мин; ТМФС - 149,2 ± 12,02 кл/мкл/мин; ТМФС-К - 94,1 ± 6,93 кл/мкл/мин). Скорость адгезии лейкоцитов на ТМФС-К существенно ниже по сравнению с другими препаратами (р < 0,05). В период «20 - 60 мин» в большей степени происходит уход лейкоцитов с сорбентов. Скорости отрицательной адгезии (десорбции) на всех препаратах колеблются от - 6,1 ± 2,15 кл/мкл/мин (КСХФ) до -22,9 ± 3,22 кл/мкл/мин (ТМФС). Можно отметить, что на трех сорбентах показатели скорости десорбции примерно одинаковы: Силохром С-120 - ( -13,4 ± 3,92 кл/ мкл/мин); КСХ - ( -14,2 ± 2,41 кл/мкл/мин); ТМФС-К - (-15,1 ± 2,68 кл/мкл/мин).
Анализ показателей адгезии лейкоцитарного пула показал, что наименьшей скоростью адгезии для общей популяции лейкоцитов обладает гемоконтактный препарат на основе Силохрома С-120 с ковалентно фиксированным на нем трис-малонилфуллереном С60. Фиксация модифицирующих агентов силикагеля методом сорбции мало изменяла активационные характеристики препаратов для клеток крови, что характерно как для тромбоцитов, так и для лейкоцитов.
Общую популяцию лейкоцитов условно делят на гранулоциты (нейтрофилы, базофилы, эозинофилы) и агранулоциты (лимфоциты и моноциты). Изучены СВАП и скорости адгезии клеток в разные временные интервалы контакта отдельно для каждой из субпопуляций.
На рисунке 3 представлены СВАП всех препаратов для гранулоцитов. Профили грануло-цитов идентичны профилям, характерным для общей популяции лейкоцитов, что вполне закономерно, так как основная масса лейкоцитов в их общей популяции представлена нейтрофиль-ными лейкоцитами. Максимум адгезии клеток наблюдали в первые «5 мин» контакта, 2-я ре-перная точка - «20 мин» и отрицательный показатель адгезии соответствовал периоду «20 - 60 мин» для всех препаратов. Как и в общей популяции лейкоцитов, в субпопуляции грануло-цитов можно отметить снижение скорости адге-
■ Силохром С-120
■ ТМФС
■ КСХ
■ КСХФ
_ ■ ТМФС-К
60
Рис.3
зии клеток на препарате ТМФС-К по сравнению со всеми другими сорбентами (р < 0,05). Этот показатель на данном препарате снижается в интервале контакта «0-20 мин» (р < 0,05). Во временном диапазоне «20 - 60 мин» регистрировали отрицательную адгезию (десорбцию) гранулоцитов. Как и в общей популяции лейкоцитов, для гранулоцитов наименьшая скорость десорбции характерна при контакте с КСХФ (-4,1 ± 1,39 кл/мкл/мин). Если для общей популяции лейкоцитов различия на всех сорбентах схожи, то для гранулоцитов скорость адгезии на КСХФ значимо ниже (р < 0,05) по сравнению с КСХ (-12,5 ± 1,73 кл/мкл/мин), ТМФС (-18,7 ± 2,36 кл/мкл/мин) и ТМФС-К (-10,3 ± 1,35 кл/ мкл/мин). Между исходной матрицей (Силохром С-120) и другими ее производными существенных различий в скорости адгезии гранулоцитов не выявлено.
При анализе СВАП агранулоцитов для всех препаратов можно отметить сходную реакцию клеток на их контактное взаимодействие с кровью. Максимальный эффект наблюдали в период «0 - 5 мин». 2-я реперная точка для всех сорбентов (кроме КСХ) была «20 мин» и отрицательные показатели адгезии отмечены в период «20 - 60 мин» (за исключением КСХ). При этом необходимо выделить некоторые особенности. Во-первых, в показатели скорости адгезии агра-нулоцитов в первые «5 мин» контакта в 1,9 -3,7 раза ниже, чем для гранулоцитов и общей
40
Время, мин
Рис.2
популяции лейкоцитов. Во-вторых, различия в скорости адгезии агранулоцитов на всех сорбентах менее выражены (Силохром С-120 - 98,6 ± 11,05 кл/мкл/мин; КСХ - 126,0 ± 7,58 кл/мкл/ мин; КСХФ - 120,2 ± 10,4 кл/мкл/мин; ТМФС -144,0 ± 14,94 кл/мкл/мин; ТМФС-К - 104,2 ± 4,98 кл/мкл/мин). Существенно различаются между собой показатели скорости адгезии только на сорбентах Силохром С-120 и ТМФС (р < 0,05). В-третьих, на препарате КСХ вторая ре-перная точка для агранулоцитов смещена в область «40 мин», т.е. до этого времени в гемокон-тактной системе преобладали процессы адгезии клеток над процессами десорбции. Такого эффекта не было зафиксировано ни на одном из гемоконтактных сорбентов ни для какого типа клеток крови. В интервале контакта «0-20 мин» также отмечено снижение скорости адгезии агранулоцитов по сравнению с гранулоцита-ми (Силохром С-120 - 31,7 ± 5,69 кл/мкл/мин; КСХ - 40,5 ± 4,17 кл/мкл/мин; КСХФ - 37,0 ± 2,50 кл/мкл/мин; ТМФС - 46,9 ± 4,28 кл/мкл/ мин; ТМФС-К - 34,5 ± 2,82 кл/мкл/мин). В этот промежуток времени существенных различий между показателями скорости адгезии аграну-лоцитов на всех исследованных сорбентах не выявлено. Показатели десорбции характерны в заключительный период контакта «20 - 60 мин» и для этой субпопуляции лейкоцитов, но они ниже, чем у гранулоцитов (Силохром С-120 -(-3,1 ± 0,62 кл/мкл/мин); КСХ - (-1,8 ± 0,81 кл/ мкл/мин); КСХФ - (-1,1 ± 0,52 кл/мкл/мин); ТМФС - (-4,3 ± 0,68 кл/мкл/мин); ТМФС-К -(-4,1 ± 0,70 кл/мкл/мин).
ОБСУЖДЕНИЕ
Все исследованные производные Силохрома С-120 обладают схожими показателями скорости адгезии клеток к гранулам препаратов за исключением ТМФС-К. Скорость адгезии, по которой косвенно можно судить об активационных свойствах препаратов, на ТМФС-К существенно ниже. Такая реакция клеток характерна как для тромбоцитов, так и для лейкоцитов в целом, а также для их субпопуляций. Обращает на себя внимание тот факт, что модификация поверхности матричного сорбента методом сорбции различных компонентов практически не влияет на адгезивные характеристики модифицированных препаратов. Ковалентная фиксация трисмало-нилфуллерена С60 к исходной матрице существенно снижает адгезивные свойства препарата для всех типов прилипающих клеток крови. Известно, что выраженность фиксации клеток крови на искусственных поверхностях зависит от их гидрофильности/гидрофобности [6], топографических характеристик поверхности (гладкие/
шероховатые) [7] и, вероятно, от химической структуры поверхности. Можно полагать, что адгезивные свойства для клеток крови на всех сорбентах (за исключением ТМФС-К) обеспечивает матричная структура силикагеля и его химические свойства. Модификация поверхности Силохрома С-120 сорбционным способом обеспечивает прочную фиксацию сорбируемых веществ, в основном внутри пор, размеры которых у данного препарата колеблются в районе 30 нм. В результате сорбционных процедур на всех модифицированных препаратах удельная поверхность образцов снижается, коррелируя с уменьшением размера пор. Прилипание клеток крови к гранулам препаратов не может обеспечить существенного контакта адгезивных структур клеточной мембраны с сорбированными веществами, так как, например, при распластывании тромбоцитов образующиеся фило- и ламеллопо-дии не способны проникнуть внутрь нанопор в силу своего размера. По некоторым данным размеры псевдоподий варьируют от 500 до 3000 нм в длину и от 50 до 300 нм в толщину, что гораздо больше диаметра пор всех исследованных препаратов [8]. Поэтому на всех препаратах (кроме ТМФС-К) основное взаимодействие клеточной мембраны происходит с однородными по химической природе функциональными группами и участками поверхности, что и обеспечивает практически одинаковые скорости адгезии клеток крови на исследованных сорбентах.
Несколько отличается по своим характеристикам препарат ТМФС-К. Аминирование Силохрома С-120 и последующая ковалентная фиксация трисмалонилфуллерена С60, очевидно, обеспечивает не только равномерное покрытие всей поверхности сорбента производным фуллерена С60, включая внутреннюю и внешнюю поверхность гранул, но и существенно меняет химическую природу поверхностного слоя. Следует отметить, что при ковалентной иммобилизации происходит жесткая фиксация молекул трисмалонилфуллерена С60, при этом возможно многоточечное связывание с поверхностью Силохрома, модифицированного 3-аминопропилсилильными группами. Можно предположить, что такая функционализация поверхности создает условия для контакта клеток не только с карбоксильными группами, но и с гидрофобным фуллереновым кором трисма-лонилфуллерена С60. При такой модификации уменьшается удельная поверхность гранул (с 154 м2/г до 140 м2/г), но, по сравнению с матрицей, размер пор при этом не меняется. Контакт клеток крови с твердофазным фуллереном С60 приводит к статистически значимому снижению скорости адгезии всех прилипающих клеток и,
следовательно, к уменьшению активационно-го потенциала препарата. Механизмы влияния фуллеренов на биообъекты достаточно широко обсуждаются в научной литературе. Многие работы связаны с изучением биосовместимости и токсических эффектов. Токсичность фуллеренов не была четко установлена [9], так же, как и их асбестоподобный эффект [10]. С одной стороны показано, что фуллерен обладает крайне низкой общей токсичностью (от 1200 до 2500 мг/кг) [11], с другой - выявлен токсический эффект для ряда клеточных культур [12; 13] и эритроцитов человека и крысы [14]. Полагают, что фуллере-ны (в частности, фуллерен С60) обладают мем-бранотропными свойствами и реализуют свое действие через интегральные белки мембраны, хотя они (фуллерены) и не являются жесткими деструктивными агентами в клетке [15]. Работы, посвященные влиянию фуллеренов на клетки, проводят, в основном, с использованием водорастворимых структур или их водными дисперсиями. Наиболее часто встречающийся объект исследований - эритроциты. Было показано, что под воздействием гидратированных углеродных наночастиц происходят морфологические и функциональные изменения эритроцитов, что приводит к агрегации самих клеток [16]. Также установлено, что производные фуллерена С60 проявляют антиоксидантную, мембранотроп-ную, иммунотропную, противовирусную, фотодинамическую активность и способны инакти-вировать ферменты [17].
При изучении влияния немодифицированно-го фуллерена С60 на функциональную активность лимфоцитов человека показано увеличение жесткости мембраны лимфоцитов, что подтверждалось уменьшением фазы набухания этих клеток на 4 мин и снижением относительного мембранного резерва в гипотонической среде в 1,4 раза, то есть по показателям осморегуляции. Данный эффект может иметь негативные последствия для нормальных клеток крови, так как ограничивает физиологические возможности лимфоцитов при развитии иммунологических реакций: миграции клеток, кооперативного взаимодействия, презентации антигена, развития фагоцитарных процессов и т.д. Однако, данный эффект может оказаться и позитивным при воздействии фуллеренов С60 на неопластические клетки, что будет существенно ограничивать их функциональную активность и развитие лимфо-пролиферативных процессов в целом [18]. Культивирование моноцитов крови человека in vitro на носителях из биополимера полигидроксиал-каноата при введении в культуральную среду на-ноалмазов и фуллеренов не влияло на жизнеспособность клеток в краткосрочной культуре, но
приводило к изменению морфофункциональных характеристик моноцитов. Существенно менялось соотношение морфологических классов моноцитов в присутствии наночастиц. Оно зависело от класса вводимых частиц, их концентрации и наличия белковой «короны» на частицах. Так, фуллерен в концентрации 25 мг/мл вызывал появление нового морфологического класса клеток - адгезированных плоских клеток с гладкими краями, к которому относилось 80% клеток популяции. Присутствие белковой короны на фуллерене нивелировало данный класс клеток до нуля и стал доминировать класс сферических клеток с микроворсинками [19]. Также было изучено влияние фуллерена С60 на функциональную активность клеток крови, обладающих фагоцитарными свойствами. Взаимодействие фуллерена С60 в дозах 0,01 и 0,1 мкМ/л оказывало, в основном, негативное влияние на активность клеток. Наряду с угнетением ряда функций (активности миелопероксидазы, уровня индуцированной хемилюминесцен-ции) выявлено подавление экспрессии молекул CD54, отвечающих за адгезию клеток. Молекула CD54 (ICAM-1) является лигандом интегрино-вого рецептора FLA-1. Взаимодействие этих молекул обеспечивает клеточно-клеточные связи. Таким образом, проникновение фуллерена С60 в клетку воздействует на различные механизмы реализации функции фагоцитов, снижая в том числе и адгезивные свойства клеток. Может ли аналогичным действием обладать молекула фуллерена С60, фиксированная на твердофазной подложке? Скорее всего - нет, так как она не может проникнуть в клетку. Однако, в наших экспериментах мы наблюдали снижение скорости адгезии на ТМФС-К как для лейкоцитов, так и для тромбоцитов. Очевидно, что существует механизм контактного блокирования процесса адгезии фиксированными молекулами фулле-рена С60. Аналогичный эффект наблюдали при использовании в экспериментах поверхности из ПВХ, модифицированной фуллереном, в которых оценивали осмотическую резистентность эритроцитов человека в различных вариантах. Было показано, что часовая инкубация твердофазного фуллерена с компонентами крови не оказывает существенного влияния на функциональные свойства мембран. Продолжительная инкубация (48 часов) снижает функциональные свойства эритроцитов [20]. Механизм действия может быть связан с активацией свободноради-кального окисления и энергозависимых мембранных процессов. Показано, что фуллерен способен влиять на биохимические и физические параметры на клеточном, мембранном и субклеточном уровнях [21].
ВЫВОДЫ
1. Адгезивный потенциал тромбоцитов реализуется на всех производных Силохрома С-120 (за исключением ТМФС-К) в первые «5 мин» контакта крови с сорбентами. ТМФС-К показал наиболее низкую скорость адгезии на нем тромбоцитов и более длительный период фиксации этих клеток к поверхности гранул («20 мин»). Показатели скорости перехода лейкоцитов с поверхности сорбентов в жидкую фазу крови (десорбции) на всех препаратах имели сходные величины, за исключением ТМФС-К.
2. Для общей популяции лейкоцитов СВАП всех препаратов практически одинаковы. Максимальная скорость адгезии отмечена в первые «5 мин», период преобладания прилипания лейкоцитов к гранулам сорбентов длился до «20 мин», затем отмечали превалирование десорбции клеток с препаратов над их фиксацией. Наименьший показатель скорости адгезии лейкоцитов зафиксирован на ТМФС-К (р < 0,05).
3. По форме СВАП и скорости адгезии реакция гранулоцитов на контакт с сорбентами соответствует показателям для общей популяции лейкоцитов.
4. Реакция агранулоцитов на контактное взаимодействие крови с препаратами сходна по форме СВАП для всех сорбентов, за исключением КСХ. Период преобладания фиксации на нем клеток длился «40 мин». Скорости адгезии для аграну-лоцитов на всех препаратах существенно ниже, чем для гранулоцитов.
5. По своим адгезивным характеристикам для клеток крови Силохром С-120 и все его модифицированные производные могут быть использованы в качестве контактных активаторов тромбоцитов и лейкоцитов при проведении МОГ. Учитывая предыдущие исследования по оценке гемолитических характеристик данных препаратов [4], для дальнейшего исследования в плане его практического применения в клинике может быть рекомендован только один препарат -карбосилохромфуллерен С60 (КСХФ), обладающий наименьшей и адекватной гемолитической активностью из всех исследованных сорбентов.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.
ЛИТЕРАТУРА
1. Буркова Н. В., Кузнецов С. И., Тюка-вин А. И. Контактная твердофазная гемомоду-ляция. Бюллетень ФЦСКЭ им. В.А. Алмазова. 2013;6:28-34.
2. Кузнецов С. И., Киричук О. П., Буркова Н. В., Даванков В.А., Постнов В. Н., Литвинен-ко Е.В. Реакция клеточных элементов крови на контакт с гранулированными сверхсшитым полистиролом и кремнеземами. Трансляционная медицина. 2017;4(4):43-55. doi:10.18705/2311-4495-2017-4-4-43-55.
3. Буркова Н. В., Киричук О. П., Романчук Е. В., Даванков В. А., Постнов В. Н., Кузнецов С. И. Изменения спектральных характеристик плазмы при контакте венозной крови человека с гранулированными сорбентами in vitro. Альманах клинической медицины. 2018; 46(8):772-777. doi:10.18786/2072-0505-2018-46-8-772-777.
4. Киричук О. П., Юрьев Г. О., Буркова Н. В., Постнов В. Н., Романчук Е. В., Кузнецов С. И. Сравнение спектральных характеристик плазмы после контакта венозной крови человека с Си-лохромом С-120 и его химически модифицированными производными в стендовых условиях. Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины. 2019;9(2):20-26.
5. Киричук О. П., Буркова Н. В., Романчук Е. В., Линвиненко Е. В., Киселева А. Д., Кузнецов С. И. Оценка активационных возможностей твердофазных поверхностей по скорости адгезии клеток крови. Трансляционная медицина. 2019;6(3):53-60. doi:10.18705/2311-4495-2019-6-3-53-60.
6. Chang S., Popowich Y., Greco R.S., Haimovich B. Neutrophil survival on biomaterials is determined by surface topography. J. Vasc. Surg. 2003; 37(5):1082-1090. doi:10.1067/ mva.2003.160.
7. Tomczok J., Sliwa-Tomczok W., Klein C. L., van Kooten T. G., Kirkpatrick C. J. Biomaterial - induced alterations of human neutrophils under fluid shear stress. Scanning electronical study in vitro. Biomaterials.1996;17(14):1359-1367. doi:10.1016/0142-9612(96)87275-9.
8. Golebiewska E. M, Alastair W. Poole Platelet secretion: From haemostasis to wound healing and beyond. Blood Rev. 2015;29(3):153-62. doi:10.1016/j.blre.2014.10.003.
9. Guang Jia, Haifang Wang, Lei Yan, Xiang Wang, Rongjuan Pei, Tao Yan, Yuliang Zhao, and Xinbiao Guo. Cytotoxicity of carbon nanomaterials: single-wall nanotube, multi-wall nanotube, and
fullerene. Environ Sci Technol. 2005;39(5):1378-1383. doi:10.1021/es048729l.
10. Takagi A., Hirose A., Nishimura T. Induction of mesothelioma in p53+/- mouse by intraperitoneal application of multi-wall carbon nanotube. J. Toxicol. Sci. 2008;33(1):105-116. doi:10.2131/ jts.33.105.
11. Каркищенко Н.Н. Нанобезопасность: новые подходы к оценке рисков и токсичности на-номатериалов. Биомедицина. 2009;(1):5-27.
12. Aleksandra Isakovic, Zoran Markovic, Biljana Todorovic-Markovic, Nadezda Nikolic, Sanja Vranjes-Djuric, Marija Mirkovic, Miroslav Dramicanin, Ljubica Harhaji, Nevena Raicevic, Zoran Nikolic Distinct cytotoxic mechanisms of pristine versus hydroxylated fullerene. Toxicol. Sci. 2006;91(1):173- 183. doi:10.1093/toxsci/kfj127
13. Christie M. Sayes, Andre M.Gobin, Kevin D. Ausman, Joe Mendeza Jennifer L.West, Vicki L.Colvin. Nano-C60 cytotoxicity is due to lipid peroxidation. Biomaterials. 2005; 26(36):7587-7595. doi:10.1016/j.biomaterials.2005.05.027
14. Соломадин И. Н., Мааров Н. В., Бенедиктова Н. И., Косенко Е. А., Каминский Ю. Г. Токсическое действие Ab25-35 и фуллерена С60 на эритроциты. Известия РАН. 2008; 4:507-512.
15. Скворцевич Е. Г., Романов Р. В., Стурлис О. В. Биологические эффекты наноструктур углерода. Вестник Санкт-Петербургского университета. 2009;(1):114-119.
16. Горюнов А. С., Борисова А. Г., Рожков С. П., Суханова Г. А., Рожкова Н. Н. Морфология и агрегация эритроцитов в нанодисперсиях углерода. Труды Карельского научного центра РАН. 2009;3:30-37.
17. Satoh M., Takayanagi I. Pharmacological Studies on Fullerene (C60), a Novel Carbon Allotrope, and Its Derivatives. Jurn. Pharmacol. Sci. 2006;100:513-518. doi:10.1254/jphs.CPJ06002X.
18. Скоркина М. Ю., Бучельников А. С., Ти-кунова Т. С., Кротова Е. Е. Влияние немодифи-цированного водного раствора фуллерена С60 на функциональную активность лимфоцитов в норме и при лимфопролиферативных процессах. Нанофизика. 2015 3:147-151.
19. Мензянова Н. Г., Николаева Е. Д., Винокурова Д. В., Шабанов А. В., Шершнева А. М. Влияние биоматериалов медицинского назначения на структурно-функциональные особенности моноцитов. Журнал Сибирского Федерального Университета. Биология 1. 2016; (9):33-42. doi:10.17516/1997-1389-2015-9-1-33-42.
20. Веснина Л. Э., Мамонтова Т. В., Микитюк М. В., Боброва Н. А., Куценко Л. А. Влияние фуллерена C60 на функциональную активность фагоцитарных клеток. Экспериментальная и
клиническая фармакология. 2011;74(6):26-29. doi:10.30906/0869-2092-2011-74-6-26-29.
21. Думпис М. А., Николаев Д. Н., Литасова Е. В., Ильин В. В., Брусина М. А., Пиотровский Л.Б. Биологическая активность фуллеренов -реалии и перспективы. Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2018;16(1):4-20. doi:10.17816/RCF1614-20.
REFERENCES
1. Burkova N. V. Kuznetsov S. I., Tyukavin A. I. Contact solid phase chemomodulation. Bulletin Almazov National Medical Research Centre. 2013; 6:28-34 (In Russ.).
2. Kuznetsov S. I., Kirichuk O. P., Burkova N. In. Davankov V. A., Postnov V. N., Litvinenko E. V. Reaction of blood cell elements to contact with granulated super-crosslinked polystyrene and silica. Translational medicine. 2017; 4(4):43-55 (In Russ.). doi:10.18705/2311-4495-2017-4-4-43-55
3. Burkova N. In. Kirichuk O. P., Romanchuk E. V., Davankov V. A., Postnov V. N., Kuznetsov S. I. Changes in the spectral characteristics of plasma in contact with human venous blood granulated sorbents invitro. Almanac of clinical medicine. 2018; 46(8):772-777 (In Russ.). doi:10.18786/2072-0505-2018-46-8-772-777.
4. Kirichuk O. P., Yuriev G. O., Burkova N. V., Postnov V. N., Romanchuk E. V., Kuznetsov S. I. Comparison of spectral characteristics of plasma after contact of human venous blood with Silochrom S-120 and its chemically modified derivatives under bench conditions. Crimea Journal of Experimental and Clinical Medicine. 2019;9(2):20-26 (In Russ.).
5. Kirichuk O. P., Burkova N. V., Romanchuk E. V., Linvinenko E. V., Kiseleva A. D., Kuznetsov S. I. Assessment of the activation capabilities of solid-phase surfaces by the rate of adhesion of blood cells. Translational medicine. 2019; 6 (3):53-60 (In Russ.). doi:10.18705/2311-4495-2019-6-3-53-60.
6. Chang S., Popowich Y., Greco R.S., Haimovich B. Neutrophil survival on biomaterials is determined by surface topography. J. Vasc. Surg. 2003;37(5):1082-1090. doi:10.1067/ mva.2003.160.
7. Tomczok J., Sliwa-Tomczok W., Klein C. L., van Kooten T. G., Kirkpatrick C. J. Biomaterial - induced alterations of human neutrophils under fluid shear stress. Scanning electronical study in vitro. Biomaterials. 1996;17(14):1359-1367. doi:10.1016/0142-9612(96)87275-9.
8. Golebiewska E. M., Alastair W. Poole Platelet secretion: From haemostasis to wound healing and beyond. Blood Rev. 2015; 29(3):153-62. doi:10.1016/j.blre.2014.10.003.
9. Guang Jia, Haifang Wang, Lei Yan, Xiang Wang, Rongjuan Pei, Tao Yan, Yuliang Zhao, and Xinbiao Guo Cytotoxicity of carbon nanomaterials: single-wall nanotube, multi-wall nanotube, and fullerene. Environ Sci Technol. 2005;39(5):1378-1383. doi:10.1021/es048729l.
10. Atsuya Takagi, Akihiko Hirose, Tetsuji Nishimura, Nobutaka Fukumori, Akio Ogata, Norio Ohashi, Satoshi Kitajima, Jun Kanno. Induction of mesothelioma in p53+/- mouse by intraperitoneal application of multi-wall carbon nanotube. J. Toxicol. Sci. 2008; 33(1):105-116. doi:10.2131/ jts.33.105.
11. Karkishchenko, N. N. Nanosafety: new approaches to the assessment of risks and toxicity of nanomaterials. Biomedicine. 2009;1:5-27 (In Russ).
12. Aleksandra Isakovic, Zoran Markovic, Biljana Todorovic-Markovic, Nadezda Nikolic, Sanja Vranjes-Djuric, Marija Mirkovic, Miroslav Dramicanin, Ljubica Harhaji, Nevena Raicevic, Zoran Nikolic. Distinct cytotoxic mechanisms of pristine versus hydroxylated fullerene. Toxicol. Sci. 2006;91(1):173-183. doi:10.1093/toxsci/kfj127
13. Christie M. Sayes, Andre M.Gobin, Kevin D. Ausman, Joe Mendeza Jennifer L.West, Vicki L.Colvin. Nano-C60 cytotoxicity is due to lipid peroxidation. Biomaterials. 2005; 26(36):7587-7595. doi:10.1016/j.biomaterials.2005.05.027
14. Salomatin I. N., Markov N. In. Venediktova N. E. A. Kosenko, Y. G. Kaminsky. Toxic effects and b from 25 to 35 and fullerene C60 on erythrocytes. News of wounds. 2008;4:507-512 (In Russ.).
15. Skvortsevich E. G., Romanov R. V., Sturlis O. V. Biological effects of carbon nanostructures. Bulletin of St. Petersburg University. 2009;1:114-119 (In Russ.).
16. Goryunov A. S., Borisova A. G., Rozhkov S. P., Sukhanova G. A., Rozhkova N. N. Morphology and aggregation of erythrocytes in carbon nanodispersions. Proceedings of the Karelian Scientific Center of the Russian Academy of Sciences. 2009;3:30-37 (In Russ.).
17. Satoh M., Takayanagi I. Pharmacological Studies on Fullerene (C60), a Novel Carbon Allotrope, and Its Derivatives. Jurn. Pharmacol. Sci. 2006; 100:513-518. doi:10.1254/jphs.CPJ06002X
18. Skorkina M. Yu., Buchelnikov A. S., Tikunova T. S., Krotova E. E. Influence of an unmodified aqueous solution of fullerene C60 on the functional activity of lymphocytes in normal conditions and in lymphoproliferative processes. Nanophysics. 2015;(3):147-151 (In Russ.).
19. Menzyanova N. G., Nikolaeva E. D., Vinokurova D. V., Shabanov A.V., Shershneva
A.M. The influence of medical biomaterials on the structural and functional features of monocytes. Journal of Siberian Federal University. Biology 1. 2016;(9):33-42 (In Russ). doi:10.17516/1997-1389-2015-9-1-33-42.
20. Vesnina L.E., Mamontova T.V., Mikityuk M.V., Kutsenko N.L., Kutsenko L.A., Bobrova N.A., Berkalo L.V., Kaidashev I.P. The effect of fullerene C60 on the functional activity of phagocytic cells. Experimental and Clinical Pharmacology. 2011;74(6):26-29 (In Russ.). doi:10.30906/0869-2092-2011-74-6-26-29
21. Dumpis M. A., Nikolaev D. N., Litasova E. V., Ilyin V. V., Brusina M. A., Piotrovsky L.
B. Biological activity of fullerenes - realities and prospects. Reviews on clinical pharmacology and drug therapy. 2018; 16(1):4-20 (In Russ.). doi:10.17816/RCF1614-20
