CC BY
314 Mandels M., Weber W. The production of cellulose. Advances in Chemistry Series. 1996. Vol. 112. P. 395-434.
15 Borovikov V.P. Populyarnoe vvedenie v sovremennyj analiz dannyh v sisteme STATISTICA 10. M.: Stat Soft, 2013. 268 s.
МРНТИ: 62.09.39
О Н. ШЕМШУРА*, А.И. БАЙДАЛИНОВ, Ж.Б. СУЛЕЙМЕНОВА, Г.Т. ДЖАКИБАЕВА,
Г.Б. БАЙМАХАНОВА, Г А. МОМБЕКОВА ТОО «Научно-производственный центр микробиологии и вирусологии», Алматы,
Казахстан
*
e-mail: [email protected]
ШТАММ CHRYSEOBACTERIUM RHIZOPLANAE1М-ОСНОВА БИОПРЕПАРАТА ПРОТИВ ФУЗАРИОЗНОЙ ГНИЛИ VIGNA RADIATA И ОЦЕНКА ЕГО
БИОБЕЗОПАСНОСТИ
doi: 10.53729/MV-AS.2022.02.07
Аннотация
В статье приведены результаты исследования фунгицидной активности штамма Chryseobacterium rhizoplanae 1М и его метаболитов, ацетоина и 2,3-бутанедиола, в отношении возбудителей фузариоза маша (Vigna radiata). Установлено, что диаметр зон подавления роста F. oxysporum, F. equiseti и F. tricincium штаммом C. rhizoplanae 1М составил 22,3±2,0; 25±0,36 и 27,3±2,5 мм, соответственно. Снижение роста патогенов под действием его метаболитов, ацетоина и 2,3-бутанедиола, было наибольшим при концентрации 500 мг/мл. Диаметр зон подавления роста F. oxysporum, F. equiseti и F. tricincium в варианте с ацетоином с концентрацией 500 мг/л составил 19,0; 11,7 и 13,7 мм, соответственно. Диаметр зон подавления роста F. oxysporum, F. equiseti и F.tricincium в варианте с 2,3-бутанедиолом с концентрацией 500 мг/л составил 14,3; 21,0 и 11,3 мм, соответственно.
Оценка факторов патогенности (токсичности) и аллергенности штамма Chryseobacterium rhizoplanae 1М показала его безопасность, а установленная ранее ростостимулирующая активность штамма и его метаболитов в отношении проростков маша свидетельствует о перспективности его применения в качестве основы для создания полифункционального биопрепарата, обладающего комплексным противогрибковым и стимулирующим действием.
Ключевые слова: Vigna radiata, фузариоз, Chryseobacterium rhizoplanae, биопрепарат, биобезопасность.
Маш (Vigna radiata), как и другие зернобобовые культуры, имеет большое агротехническое значение, как предшественник для многих сельскохозяйственных культур, обогащая почву биологическим азотом. В бобах маша содержится полный комплекс полезных веществ: жиры и углеводы, витамины и минеральные вещества, клетчатка, пищевые волокна. Значительные потери посевам маша наносят различные болезни, из которых наиболее широко распространенной и опасной является фузариоз [15]. У растений, пораженных фузариозом, начинается загнивание корней — появляются участки красновато-бурого оттенка, покрытые белым или бело-розовым налетом. Затем поражаются сосуды, обеспечивающие ткани необходимой влагой. Происходит закупорка сосудов мицелием гриба, выброс токсических веществ, вследствие чего нарушается водный обмен и работа фотосинтеза.
Характерными признаками поражения фузариозом считаются пожелтение и опадание листьев, поникшие верхушки растений, потемневшие корни. У молодых
растений симптомы заражения проявляются не так выраженно, только замедлением роста и развития, тогда как на более поздних стадиях, усугубленных повышенной температурой окружающего воздуха и хроническим недостатком воды, фузариоз развивается стремительными темпами и гибель растений происходит за несколько дней.
В настоящее время использование агрохимикатов в сельском хозяйстве является основным способом контроля болезней растений, однако их применение имеет ряд недостатков: происходит формирование стойких рас возбудителей, ингибирование ризосферных микроорганизмов, опасность для здоровья человека и животных. В связи с этим, возникает необходимость замены их на нетоксичные и экологически безопасные биопрепараты на основе микроорганизмов, обладающих антагонистической активностью [6-9].
Ранее нами из корневых узелков маша (Vigna radiata), культивируемого в Туркестанском районе Казахстана, был выделен штамм Chryseobacterium rhizoplanae 1М, который стимулировал рост маша и синтезировал ряд соединений, обладающих ростостимулирующей активностью [10].
В связи с возможностью создания полифункционального биопрепарата, обладающего комплексным фунгицидным действием на фитопатогены и стимулирующим на растение, целью исследования явилось изучение антагонистической активности штамма C. rhizoplanae 1М и определение степени его безопасности для дальнейшей разработки на его основе биопрепарата.
Объекты и методы исследования
Объектом исследования служил штамм Chryseobacterium rhizoplanae 1М. Исследование антагонистической активности штамма в отношении фитопатогенов-возбудителей фузариоза проводили в лабораторных условиях методом диффузии в агар [11]. Штамм культивировался в течение 24 часов на круговой качалке 180 об/мин на жидкой питательной среде Мазе следующего состава (г/л): горох-100, сахароза -10, HPO4 - 1, MgSO4 - 0,03, агар - 20, вода дистиллированная -1. Титр получаемой бактериальной суспензии составляет 10 КОЕ/мл. В качестве тест-культур использовали Fusarium oxysporum, Fusarium equiseti и Fusarium tricincium, выделенные из пораженных семян маша сорта «Победа-54» Фитопатогенные грибы засевали сплошным газоном на твердую картофельно-глюкозную среду в чашки Петри. На свежезасеянном газоне фитопатогена в стерильных условиях делали лунки, в которые вносили бактериальную суспензию штамма C. rhizoplanae, или выделенные ранее из культуральной жидкости ацетоин и 2,3-бутанедиол в концентрациях 250 и 500 мг/л. В качестве контроля использовали питательную среду Мазе и 96% этанол. Чашки Петри помещали в термостат при 280С на 3-5 суток (время роста патогена). Об антагонистической активности штамма судили по отсутствию роста патогена вокруг лунки со штаммом C. rhizoplanae 1М или ацетоина и 2,3-бутанедиола.
Оценку безопасности штамма исследовали на лабораторных животных: нелинейных белых мышах, морских свинках, кроликах, полученных из питомника лабораторных животных с ветеринарными паспортами здоровья.
Исследование вирулентности штамма проводилось на 8 группах животных (по 8 белых мышей весом 16-18 г) в концентрациях от 103 до 1011 КОЕ/мл общепринятым методом [12] путем перорального и внутрибрюшинного введения различных концентраций суспензии бактерий. Контрольным животным вводили физиологический раствор. Животных содержали в одинаковых условиях, кормили одинаковым рационом. Наблюдения за их состоянием проводили в течение 15 суток.
Исследование аллергенного действия по сенсибилизирующему эффекту проводили на морских свинках в количестве 3 голов, которым на выстриженные участки кожного
покрова наносили путем аппликации исследуемую культуру в концентрациях от 10 до 106 КОЕ/мл. Контролем служил физиологический раствор. Учет реакции проводился через 24 часа в течение 7дней. Результат оценивали в баллах по следующей шкале:
0 - видимой реакции нет;
1 - бледно-розовая эритема по всему участку или по его периферии;
2 - ярко-розовая эритема по всему участку или по его периферии;
3 - красная эритема по всему участку;
4 - инфильтрация и отек кожи (утолщение кожной складки) при наличии или отсутствии эритемы;
5 - эритема, выраженная инфильтрация, очаговые изъязвления (некроз), возможны геморрагии, образование корочек.
Для исследования местно-раздражающего действия в опыте использовали трех кроликов весом 3-3,5 кг, которым в конъюнктивальную полость правого глаза закапывали исследуемое вещество в концентрации 1х109 КОЕ/мл. Левый глаз был контрольным, в него закапывали дистиллированную воду. Исследования проводили по бальной системе, исходя из суммарного балла по следующим критериям: гиперемия конъюнктивы и роговицы, отёк век, выделения. Учёт реакции проводился через 24 часа в течение 5 дней.
Заключение о классе опасности культуры C. rhizoplanae 1М делали согласно существующей классификации патогенности штаммов [13].
Все полученные экспериментальные данные статистически обработаны с использованием Программы «БТАТКИСА 10».
Результаты и обсуждение
Биологический метод считается экологически безопасным и является неотъемлемой частью интегрированной системы защиты растений. Штаммы микроорганизмов, подавляющие рост и развитие фитопатогенных грибов, являются основой для создания биопрепаратов. Нами проведено исследование антагонистической активности штамма C. rhizoplanae 1М в отношении возбудителей фузариоза маша, которое показало, что данный штамм подавляет развитие F. oxysporum, F. equiseti и F. tricincium, выделенных из пораженных семян маша. Диаметр зон подавления роста F. oxysporum, F. equiseti и F. tricincium штаммом C. rhizoplanae 1М составил 22,3±2,0; 25±0,36 и 27,3±2,5 мм, соответственно (таблица 1).
Таблица 1 - Антагонистическая активность штамма C.rhizoplanae 1М в отношении
возбудителей фузариозной гнили маша
Тест - микроорганизм Диаметр зон подавления роста тест-микроорганизма, мм
Fusarium oxysporum 22,3±2,0
Fusarium equiseti 25±0,36
Fusarium tricincium 27,3±2,5
Контроль - питательная среда Мазе 0
Ранее было установлено, что метаболитами штамма C.rhizoplanae 1М являются ацетоин и 2,3-бутанедиол, содержание которых в культуральной жидкости составляло 78,5±2,0% и 16,6±2,9%, соответственно [9]. Эти соединения протестированы на антагонистическую активность в отношении возбудителей фузариоза: F. oxysporum, F.equiseti и F. tricincium (таблица 2).
Таблица 2 - Антагонистическая активность ацетоина и 2,3-бутанедиола в отношении возбудителей фузариозной гнили маша
Образец Концентрация, мг/л Диаметр зон подавления роста тест-микроорганизма, мм
Fusarium oxysporum Fusarium equiseti Fusarium tricincium
ацетоин 500 19,0±1,0 11,7±2,8 13,7±1,5
250 6,3±1,5 7,7±1,5 6,0±1,0
2,3-бутанедиол 500 14,3±3,7 21,0±3,6 11,3±2,3
250 6,7±2,8 13,3±2,8 7,3
Контроль 96% этанол 0 0 0
Контроль вода 0 0 0
Известно, что летучие соединения, такие как алканы, альдегиды, аммиак, сложные эфиры, кетоны, сульфиды и терпеноиды, продуцируемые некоторыми ризобактериями, проявляют противогрибковую активность в отношении фитопатогенов, в том числе против F. oxysporum и R. solani. В нашем исследовании наблюдалось снижение роста возбудителей фузариоза в присутствии ацетоина и 2,3-бутанедиола (таблица 2). При этом концентрация 500 мг/л обоих веществ оказалась более эффективной. Диаметр зон подавления роста F. oxysporum, F. equiseti и F. tricincium в варианте с ацетоином с концентрацией 500 мг/л составил 19,0, 11,7 и 13,7 мм, соответственно. Диаметр зон подавления роста F. oxysporum, F. equiseti и F.tricincium в варианте с 2,3-бутанедиолом с концентрацией 500 мг/л составил 14,3, 21,0 и 11,3 мм, соответственно.
Исходя из полученных данных, штамм C rhizoplanae 1М является перспективным в качестве основы для создания биопрепарата для стимуляции роста маша (Vigna radiate) и защиты от фузариоза. Для дальнейшей разработки и применения на основе штамма биопрепарата необходимо оценить его биобезопасность для окружающей среды. В связи с этим, нами проведена оценка факторов патогенности (токсичности) и аллергенности штамма. Исследование вирулентности штамма показало, что при внутрибрюшинном введении суспензии штамма C rhizoplanae 1 М в концентрациях от
3 7
10 до 10' КОЕ/мл животные были здоровы, наблюдался хороший аппетит, подвижность. При концентрации 10 и 1011 КОЕ/мл двое животных заболели. При пероральном введении штамма C rhizoplanae 1 М, через 2 суток отмечена заболеваемость одного животного в варианте с концентрацией 109 КОЕ/мл, и двоих животных - в варианте с концентрацией 1011 КОЕ/мл. У заболевших животных наблюдалось уменьшение аппетита и подвижности, взъерошенность меха. На 5 сутки животные выздоровели. На 15 сутки гибели переболевших животных не отмечено (таблица 3).
Таблица 3 - Результаты исследования острой токсичности культуры С. rhizoplane _при внутрибрюшинном и пероральном введении мышам
Кол-во животных Способ введения Концентрация С. Rhizoplane (КОЕ/мл) Заболело животных Летальность животных Кол-во выживших животных
1 2 3 4 5 6
8 В/брюш 103 0 0 8±0
8 В/брюш 105 0 0 8±0
Продолжение таблицы-3
1 2 3 4 5 6
8 В/брюш 107 0 0 8±0
8 В/брюш 109 2±0 0 8±0
8 В/брюш 1011 2±0 0 8±0
8 В/брюш Контроль Физ.р-р. 0 0 8±0
8 Перор. 103 0 0 8±0
8 Перор. 105 0 0 8±0
8 Перор. 107 0 0 8±0
8 Перор. 109 1±0 0 8±0
8 Перор. 1011 2±0 0 8±0
8 Перор. Контроль Физ.р-р. 0 0 8±0
Примечание: В/брюш - внутрибрюшинное введение; Перор. - пероральное введение; Физ.р-р. -физиологический раствор.
При исследовании аллергенного действия наблюдалась бледно-розовая эритема у испытуемых морских свинок по месту наложения на их кожу аппликацию штамма C. rhizoplanae 1М, при концентрации 106 КОЕ/мл, что свидетельствовало о слабом аллергенном действии, которое прошло на вторые сутки после наложения.
При введении исследуемой культуры в конъюнктиву глаза кроликов, у одного из трех наблюдалась слабая положительная реакция в виде инъекции сосудов склеры и роговицы, слизистых выделений в углах глаз. На вторые сутки наблюдений вышеназванные явления у животных полностью купировались, в последующие 5 суток отклонений от физиологической нормы не наблюдалось, соответственно, исследуемый штамм не обладает местно-раздражающим действием.
Основываясь на существующей классификации определения факторов патогенности (токсичности) и аллергенности штаммов, культура C rhizoplanae 1М принадлежит к 4-классу опасности, и не является патогенной для теплокровных организмов.
Таким образом установлено, что штамм C rhizoplanae 1М, и его метаболиты, ацетоин и 2,3-бутанедиол, обладают фунгицидным действием в отношении возбудителей фузариоза маша (Vigna radiata). Диаметр зон подавления роста F. oxysporum, F. equiseti и F. tricincium штаммом C. rhizoplanae 1М составил 22,3±2,0, 25±0,36 и 27,3±2,5 мм, соответственно. Снижение роста патогенов под действием его метаболитов, ацетоина и 2,3-бутанедиола, было наибольшим при концентрации 500 мг/мл. Диаметр зон подавления роста F. oxysporum, F. equiseti и F. tricincium в варианте с ацетоином с концентрацией 500 мг/л составил 19,0, 11,7 и 13,7 мм, соответственно. Диаметр зон
подавления роста F. oxysporum, F. equiseti и F.tricincium в варианте с 2,3-бутанедиолом с концентрацией 500 мг/л составил 14,3, 21,0 и 11,3 мм, соответственно. Оценка факторов патогенности (токсичности) и аллергенности штамма показала его безопасность, а установленная ранее ростостимулирующая активность штамма и его метаболитов в отношении проростков маша свидетельствует о перспективности его применения в качестве основы для создания полифункционального биопрепарата, обладающего комплексным противогрибковым и стимулирующим действием.
Литература:
1 Oberai M., Khanna V. Mung bean rhizobacteria antagonist to Fusarium oxysporum and Rhizoctonia solani// Acta scientific microbiology. -2019. -Vol. 2, No. 8. - P. 82-90.
Sun S., Zhu L., Sun F., Duan C., Zhu Zh. Pathotype diversity of Fusarium oxysporum f. sp. mungcola causing wilt on mungbean (Vigna radiata)// Crop and Pasture Science. - 2020. - Vol.71, No.10. P. 873-883. https://doi.org/10.1071/CP20164
Naseri B. Bean production and fusarium root rot in diverse soil environments in Iran// J. Soil Sci. Plant Nutr. -2014. -Vol.14, No.1.
2 Eliane Divina de Toledo-Souza, Pedro Marques da Silveira, Adalberto Correa Cafe-Filho, Murillo Lobo Junio Fusarium wilt incidence and common bean yield according to the preceding crop and the soil tillage system// Pesq. agropec. bras., Brasilia -2012. - Vol.47, No.8 . - P.1031-1037.
3 5. Kalantari, S., Marefat, A., Naseri, B., Hemati, R. 2011. Biocontrol of bean Fusarium root rot using soil microbia in Zanjan province// The First Congress of Modern Agricultural Sciences and Technologies. Zanjan University, Zanjan, Iran. - 2011. -P. 240-243.
4 6. Whipps J. M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere// Journal of Experimental Botany. - 2001. - Vol. 52, Issue suppl 1. - P. 487-511.
5 7. Rodriguez-Navarro D., Oliver M., Contreras Al., Ruiz-Sainz J. Soybean interactions with soil microbes, agronomical and molecular aspects. Agronomy for Sustainable Development// Springer Verlag/EDP Sciences/INRA. - 2011. - No.31 (1). - Р.173-190.
6 8. Bernard R. Glick Plant Growth-Promoting Bacteria: Mechanisms and Applications// Hindawi Publishing Corporation Scientica. - 2012. - Article ID 963401. - 15 pages.
7 9. Akhtar m. S., Shakeel U., Siddiqui Z. A. Biocontrol of Fusarium wilt by Bacillus pumilus, Pseudomonas alcaligenes, and Rhizobium sp. on lentil// Turk J Biol . - 2010. - No. 4. - Р. 1-7
8 Shemshura O.N., Shemsheyeva Zh.N., Sadanov A.K., Alimzhanova M.B., Daugaliyeva S.T., Mombekova G.A., Rakhmetova Zh.K. Plant growth promotion by volatile organic compounds produced by Chryseobacterium rhizoplanae isolated from Vigna radiate// Eco. Env. & Cons.- 2019. - No. 25(2). -Р. 807-812.
9 Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S., Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review// J. Pharm. Anal. - 2016. - No.6. - P. 71-79. doi:10.1016/j.jpha.2015.11.005
10 Биргер М.О. «Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования» М.,1982.163-168 с.
11 Методические указания по экспериментальному обоснованию ПДК микроорганизмов-продуцентов и содержащих их готовых форм препаратов в объектах производственной и окружающей среды». - 1991 г. N 5789/1-91. - 20 с.
_ * " _ _ " _ _
О Н. ШЕМШУРА , А.И. БАИДАЛИНОВ, Ж.Б. СУЛЕИМЕНОВА, Г.Т. ДЖАКИБАЕВА,
Г.Б. БАИМАХАНОВА, ГА. МОМБЕКОВА
«Микробиология жэне вирусология Fылыми-eндiрiстiк орталыгы» ЖШС, Алматы,
^азакстан e-mail: [email protected]
VIGNA RADIATA-ЦФУЗАРИОЗДЫ Ш1Р1Г1НЕ ЦАРСЫ БИОПРЕПАРАТ НЕГ1З1 -CHRYSEOBACTERIUM RHIZOPLANAE1М ШТАММЫ ЖЭНЕ ОНЬЩ БИОЦАУ1ПС1ЗД1ГШЩ БАГАСЫ
TY^H
Макалада Chryseobacterium rhizoplanae 1М штаммыньщ фунгицидт1к белсендшгшщ нэтижелер1 жэне метаболиттер^ ацетоин мен 2,3-бутанедиолдыц маштыц (Vigna radiata) фузариоз ауруыныц коздырFышына катынасы келт1ршген. F. oxysporum, F. equiseti жэне F. tricincium патогендершщ есу диаметрлш зоналарын тежеу1 C. rhizoplanae 1М штаммымен 22,3±2,0; 25±0,36 жэне 27,3±2,5 мм катынасында аныкталды. Патогендердщ есушщ тежелу^ оныц метаболиттер1 ацетоин жэне 2,3-бутанедиолдыц 500 мг/мл концентрациясында айкын кервдг F. oxysporum, F. equiseti жэне F. tricincium есу диаметрлш тежелу^ ацетоиннщ 500 мг/л концентрация н^скасында 19,0; 11,7 жэне 13,7 мм к¥рады. F. oxysporum, F. equiseti жэне F. tricincium есу диаметрлш тежелу^ 2,3-бутанедиолдыц 500 мг/л концентрация н^скасында 14,3; 21,0 жэне 11,3 мм болды
БаFалау факторлары бойынша, Chryseobacterium rhizoplanae 1М штаммыныц патогендшш (уыттылыFы) жэне аллергендшш оныц каушшздтн, сонымен б1рге б^рын аныкталFандай штаммныц есу белсендшгш ынталандырушы жэне метаболиттершщ маш дакылына колдану тшмдшгш керсеткендей, болашакта зецсацыраук¥лактарFа карсы жэне ынталандырушы, кешенд1 полифункционалды биопрепарат жасауFа жарайтындыFын керсетп.
Кiлттi сездер: Vigna radiata, фузариоз, Chryseobacterium rhizoplanae, биопрепарат, биокаушаздш
IRSTI: 62.09.39
_ * _
O.N. SHEMSHURA , A.I. BAIDALINOV, ZH.B. SULEIMENOVA, G.T. DZHAKIBAEVA, G.B. BAIMAKHANOVA, G.A. MOMBEKOVA LLP "Research and Production Center for Microbiology and Virology", Almaty,
Kazakhstan
*
e-mail: [email protected]
THE STRAIN CHRYSEOBACTERIUM RHIZOPLANAE 1M - A BASIS OF A BIOLOGICAL PREPARATION AGAINST FUSARIUM ROT VIGNA RADIATA AND
ITS BIOSAFETY ASSESSMENT
doi: 10.53729/MV-AS.2022.02.07
Summary
The article presents the results of a study of the fungicidal activity of the Chryseobacterium rhizoplanae 1M strain and its metabolites acetoin and 2,3-butanediol against Fusarium mung bean (Vigna radiata) pathogens. It was found that the diameter of the growth inhibition zones for F. oxysporum, F. equiseti, and F. tricincium by C. rhizoplanae 1M was 22.3±2.0, 25±0.36, and 27.3±2.5 mm, respectively. The reduction in pathogen growth by its metabolites acetoin and 2,3-butanediol was
greatest at 500 mg/ml. The diameter of the zones of inhibition of growth of F. oxysporum, F. equiseti and F. tricincium in the variant with acetoin at a concentration of 500 mg/l was 19.0, 11.7 and 13.7 mm, respectively. The diameter of the growth inhibition zones of F. oxysporum, F. equiseti and F.tricincium in the variant with 2,3-butanediol at a concentration of 500 mg/l was 14.3, 21.0 and 11.3 mm, respectively.
Evaluation of the pathogenicity (toxicity) and allergenicity factors of the strain showed its safety, and the previously established growth-stimulating activity of the strain and its metabolites in relation to mung bean seedlings indicates its promising use as a basis for creating a polyfunctional biological product that has a complex effect on both mung bean pathogens and mung bean sprouts and stimulation of plant growth.
Key words: Vigna radiata, fusariosis, Chryseobacterium rhizoplanae, biological product, biosafety.
Mash (Vigna radiata), like other leguminous crops, is of great agrotechnical importance as a precursor for many crops, enriching the soil with biological nitrogen. Mung beans contain a full range of useful substances: fats and carbohydrates, vitamins and minerals, fiber, dietary fiber. Significant losses to mung bean crops are caused by various diseases, of which Fusarium is the most widespread and dangerous [1-5]. In plants affected by Fusarium, rotting of the roots begins - areas of a reddish-brown hue appear, covered with a white or white-pink bloom. Then the vessels are affected, providing the tissues with the necessary moisture.
There is a blockage of vessels by the mycelium of the fungus, the release of toxic substances, as a result of which water exchange and photosynthesis are disrupted. Yellowing of leaves, falling off, drooping top of plants, darkened roots are considered characteristic signs of damage. In young plants, the symptoms of infection are not so pronounced, you can only notice a slowdown in growth and development. Whereas in the later stages, aggravated by elevated ambient temperature and a chronic lack of water, Fusarium develops at a rapid pace and the death of plants is a matter of several days.
Currently, the use of agrochemicals in agriculture is the main way to control plant diseases, but their use has several disadvantages: the formation of resistant races of pathogens, the inhibition of rhizosphere microorganisms, and the danger to human and animal health. In this regard, there is a need to replace them with non-toxic and environmentally friendly biological products based on microorganisms with antagonistic activity [6-9].
Previously, we isolated a strain of C. rhizoplanae 1M from the root knots of mung bean (Vigna radiata) cultivated in the Turkestan region of Kazakhstan, which stimulated the growth of mung bean and synthesized a number of compounds with growth-stimulating activity [10].
In connection with the possibility of creating a polyfunctional biological product that has a complex fungicidal effect on phytopathogens and stimulates the plant, the aim of the study was to study the antagonistic activity of the C. rhizoplanae 1M strain and determine the degree of its safety for further development of a biological product based on it.
Objects and methods of research
The objects of study were the C. rhizoplanae 1M strain. The study of the antagonistic activity of the C. rhizoplanae 1M strain against phytopathogens, causative agents of Fusarium, was carried out under laboratory conditions by the agar diffusion method [11]. The strain was cultivated for 24 hours on a circular shaker 180 rpm on a liquid nutrient medium Mase with the following composition (g/l): peas-100, sucrose -10, HPO4 - 1, MgSO4 - 0.03, agar - 20, distilled water -one. The titer of the resulting bacterial suspension is 108 CFU/ml. F. oxysporum, F. equiseti, F. tricincium, isolated from the affected seeds of Pobeda-54 mung bean variety, were used as test cultures. Phytopathogenic fungi were sown in a continuous lawn on a solid potato-glucose medium in Petri dishes. Wells were made on a freshly planted lawn of a phytopathogen under sterile conditions, into which a bacterial suspension of a C. rhizoplanae
strain was added, or acetoin and 2,3-butanediol previously isolated from the culture liquid at concentrations of 250 and 500 mg/l. Maze medium and 96% ethanol were used as controls. Petri dishes were placed in a thermostat at 280C for 3-5 days (pathogen growth time). The antagonistic activity of the strain was judged by the absence of pathogen growth around the well with the C. rhizoplanae 1Mstrain or acetoin and 2,3-butanediol.
The safety assessment of the strain was studied on laboratory animals: non-linear white mice, guinea pigs, rabbits obtained from a nursery of laboratory animals with veterinary health passports.
The study of the virulence of the strain was carried out on 8 groups of animals (8 white mice each weighing 16-18 g) at concentrations from 103 to 1011 CFU/ml by the conventional method [12] by oral and intraperitoneal administration of various concentrations of a bacterial suspension. Control animals were injected with saline. The animals were kept under the same conditions and fed the same diet. Their condition was monitored for 15 days.
The study of the allergenic effect on the sensitizing effect was carried out on guinea pigs in the amount of 3 heads, which were applied to the clipped areas of the skin by application of the studied culture in concentrations from 103 to 106 CFU/ml. Physiological saline served as control. Accounting for the reaction was carried out after 24 hours and within 7 days. The result was evaluated in points according to the following scale:
0 - no visible reaction;
1 - pale pink erythema throughout the area or along its periphery;
2 - bright pink erythema throughout the area or along its periphery;
3 - red erythema throughout the area;
4 - infiltration and edema of the skin (thickening of the skin fold) with or without erythema;
5 - erythema, severe infiltration, focal ulceration (necrosis), hemorrhages, crusting are possible.
To study the local irritating effect in the experiment, three rabbits weighing 3-3.5 kg were used, in which the test substance was instilled into the conjunctival cavity of the right eye at a concentration of 1x109 CFU/ml. The left eye was the control, distilled water was instilled into it. The studies were carried out according to a point system, based on the total score according to the following criteria: conjunctival and cornea hyperemia, eyelid edema, discharge. Accounting for the reaction was carried out after 24 hours and within 5 days.
The conclusion about the hazard class of the C.rhizoplanae 1M culture was made according to the existing classification of pathogenicity of strains [13].
All obtained experimental data were statistically processed using the STATISTIC A 10 Program.
Results and discussion
The biological method is considered environmentally friendly and is an integral part of an integrated plant protection system. Strains that limit the number of phytopathogenic fungi are the basis for the creation of biological products. We conducted a study of the antagonistic activity of the C. rhizoplanae 1M strain against Fusarium mung bean blight pathogens, which showed that this strain suppresses the development of F. oxysporum, F. equiseti, and F. tricincium isolated from affected mung bean seeds. The diameter of the growth inhibition zones for F. oxysporum, F. equiseti, and F. tricincium by strain C. rhizoplanae 1M was 22.3±2.0, 25±0.36, and 27.3±2.5 mm, respectively (table 1).
Table 1 - Antagonistic activity of the C. rhizoplanae 1M strain against pathogens of Fusarium rot of mung bean_
Test - microorganism Inhibition zone diameter test microorganism, mm
F. oxysporum 22,3±2,0
F. equiseti 25±0,36
F. tricincium 27,3±2,5
Control Maze medium 0
It was previously determined that the main compounds of the C. rhizoplanae 1M strain are acetoin and 2,3-butanediol, the content of which in the culture liquid was 78.5±2.0% and 16.6±2.9%, respectively [9]. These compounds were tested for antagonistic activity against Fusarium pathogens: F. oxysporum, F. equiseti and F. tricincium (table 2).
Table 2 - Antagonistic activity of acetoin and 2,3-butanediol against pathogens of Fusarium rot of mung bean
Sample Concentration, mg/l Diameter of the zone of inhibition growth of the test microorganism, mm
F. oxysporum F. equiseti F. tricincium
acetoin 500 19,0±1,0 11,7±2,8 13,7±1,5
250 6,3±1,5 7,7±1,5 6,0±1,0
2,3-butanediol 500 14,3±3,7 21,0±3,6 11,3±2,3
250 6,7±2,8 13,3±2,8 7,3
Control 96% ethanol 0 0 0
Control water 0 0 0
Volatile compounds such as alkanes, aldehydes, ammonia, esters, ketones, sulfides, and terpenoids produced by some rhizobacteria are known to exhibit antifungal activity against phytopathogens, including F. oxysporum and R. solani. In our study, a decrease in the growth of pathogens of fusvriasis was observed in the presence of acetoin and 2,3-butanediol (table 2). At the same time, the concentration of 500 mg/l of both substances was more effective. The diameter of the zones of inhibition of growth of F. oxysporum, F. equiseti and F. tricincium in the variant with acetoin at a concentration of 500 mg/l was 19.0, 11.7 and 13.7 mm, respectively. The diameter of the growth inhibition zones of F. oxysporum, F. equiseti and F. tricincium in the variant with 2,3-butanediol at a concentration of 500 mg/l was 14.3, 21.0 and 11.3 mm, respectively.
Based on the data obtained, the C rhizoplanae 1M strain is promising as a basis for creating a biological product to stimulate the growth of mung bean (Vigna radiate) and protect against Fusarium. For further development and application of a biopreparation based on a strain, it is necessary to assess its biosafety for the environment. In this regard, we assessed the factors of pathogenicity (toxicity) and allergenicity of the strain. The study of the virulence of the strain showed that with intraperitoneal administration of a suspension of the C rhizoplanae 1M strain
3 7
at concentrations from 10 to 10 CFU/ml, the animals were healthy. There was a good appetite, mobility. At concentrations of 109 and 1011 CFU/ml, two animals fell ill. Oral administration of the strain C rhizoplanae 1M, after 2 days, the incidence of one animal in the variant with a concentration of 109 CFU/ml, and two animals in the variant with a concentration of 10 CFU/ml was noted. Affected animals showed a decrease in appetite and mobility, and also had ruffled fur. On the 5th day the animals recovered. On the 15th day, the death of recovered animals was not observed (table 3).
Table 3 - Results of the study of acute toxicity of the culture of C. rhizoplane with intraperitoneal and oral administration to mice
Quantity of animals Method injections Concentration C. rhizoplane (CFU/ml) Sick animals Lethality of animals Quantity surviving a nimals
8 In/abdomen 103 0 0 8±0
8 In/abdomen 105 0 0 8±0
8 In/abdomen 107 0 0 8±0
8 In/abdomen 109 2±0 0 8±0
8 In/abdomen 1011 2±0 0 8±0
8 In/abdomen The control physical solution 0 0 8±0
8 orally 103 0 0 8±0
8 orally 105 0 0 8±0
8 orally 107 0 0 8±0
8 orally 109 1±0 0 8±0
8 orally 1011 2±0 0 8±0
8 orally The control physical solution 0 0 8±0
In the study of the allergenic effect, pale pink erythema was observed in the test guinea pigs at the site of application of the C rhizoplanae 1M strain to their skin, at a concentration of 106 CFU / ml, which indicated a weak allergenic effect, which disappeared on the second day after application. With the injection of the studied culture into the conjunctiva of the eye of rabbits, one of the three had a weak positive reaction in the form of an injection of the vessels of the sclera and cornea, mucous secretions in the corners of the eyes. On the second day of observations, the above phenomena in animals completely stopped, and for the next 5 days no deviations from the physiological norm were observed, respectively, the studied strain does not have a local irritating effect. Based on the existing classification of determining pathogenicity (toxicity) and allergenicity factors of strains, the culture of C rhizoplanae 1M belongs to the 4th hazard class, and is not pathogenic for warm-blooded organisms.
Thus, it has been established that the C rhizoplanae 1M strain and its metabolites acetoin and 2,3-butanediol have a fungicidal effect against Fusarium mung bean (Vigna radiata) pathogens. The diameter of the growth inhibition zones for F. oxysporum, F. equiseti, and F. tricincium by strain C. rhizoplanae 1M was 22.3±2.0, 25±0.36, and 27.3±2.5 mm, respectively. The reduction in pathogen growth by its metabolites acetoin and 2,3-butanediol was greatest at 500 mg/mL. The diameter of the zones of inhibition of growth of F. oxysporum,
F. equiseti and F. tricincium in the variant with acetoin at a concentration of 500 mg/l was 19.0, 11.7 and 13.7 mm, respectively. The diameter of the growth inhibition zones of F. oxysporum, F. equiseti and F. tricincium in the variant with 2,3-butanediol at a concentration of 500 mg/l was 14.3, 21.0 and 11.3 mm, respectively. Evaluation of the pathogenicity (toxicity) and allergenicity factors of the strain showed its safety, and the previously established growth-stimulating activity of the strain and its metabolites in relation to mung bean seedlings indicates its promising use as a basis for creating a polyfunctional biological product that has a complex effect on both mung bean pathogens and mung bean sprouts and stimulation of plant growth.
References:
1 Oberai M., Khanna V. Mung bean rhizobacteria antagonist to Fusarium oxysporum and Rhizoctonia solani// Acta scientific microbiology. -2019. -Vol. 2, No. 8. - P. 82-90.
Sun S., Zhu L., Sun F., Duan C., Zhu Zh. Pathotype diversity of Fusarium oxysporum f. sp. mungcola causing wilt on mungbean (Vigna radiata)// Crop and Pasture Science. - 2020. - Vol.71, No.10. P. 873-883. https://doi.org/10.1071/CP20164
2 Naseri B. Bean production and fusarium root rot in diverse soil environments in Iran// J. Soil Sci. Plant Nutr. -2014. -Vol.14, No.1.
3 Eliane Divina de Toledo-Souza, Pedro Marques da Silveira, Adalberto Correa Cafe-Filho, Murillo Lobo Junio Fusarium wilt incidence and common bean yield according to the preceding crop and the soil tillage system// Pesq. agropec. bras., Brasilia -2012. - Vol.47, No.8 . - P.1031-1037.
4 Kalantari, S., Marefat, A., Naseri, B., Hemati, R. 2011. Biocontrol of bean Fusarium root rot using soil microbia in Zanjan province// The First Congress of Modern Agricultural Sciences and Technologies. Zanjan University, Zanjan, Iran. - 2011. -P. 240-243.
5 Whipps J. M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere// Journal of Experimental Botany. - 2001. - Vol. 52, Issue suppl1. - P. 487-511.
6 Rodriguez-Navarro D., Oliver M., Contreras Al., Ruiz-Sainz J. Soybean interactions with soil microbes, agronomical and molecular aspects. Agronomy for Sustainable Development// Springer Verlag/EDP Sciences/INRA. - 2011. - No.31 (1). - P.173-190.
7 Bernard R. Glick Plant Growth-Promoting Bacteria: Mechanisms and Applications// Hindawi Publishing Corporation Scientica. - 2012. - Article ID 963401. - 15 pages.
8 Akhtar m. S., Shakeel U., Siddiqui Z. A. Biocontrol of Fusarium wilt by Bacillus pumilus, Pseudomonas alcaligenes, and Rhizobium sp. on lentil// Turk J Biol . - 2010. - No. 4. - P. 1-7
9 Shemshura O.N., Shemsheyeva Zh.N., Sadanov A.K., Alimzhanova M.B., Daugaliyeva S.T., Mombekova G.A., Rakhmetova Zh.K. Plant growth promotion by volatile organic compounds produced by Chryseobacterium rhizoplanae isolated from Vigna radiate// Eco. Env. & Cons.- 2019. - No. 25(2). -P. 807-812.
10 Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S., Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review// J. Pharm. Anal. - 2016. - No.6. - P. 71-79. doi:10.1016/j.jpha.2015.11.005
11 Birger M.O. «Spravochnik po mikrobiologicheskim i virusologicheskim metodam issledovaniia» M.,1982.163-168 s.
12 Metodicheskie ukazaniia po eksperimental'nomu obosnovaniiu PDK mikroorganizmov-produtsentov i soderzhashchikh ikh gotovykh form preparatov v ob"ektakh proizvodstvennoi i okruzhaiushchei sredy». - 1991 g. N 5789/1-91. - 20 s.
