CC BY
2ОШ МАМЛЕКЕТТИК УНИВЕРСИТЕТИНИН ЖАРЧЫСЫ. АЙЫЛ ЧАРБА: АГРОНОМИЯ, ВЕТЕРИНАРИЯ ЖАНА ЗООТЕХНИЯ
ВЕСТНИК ОШСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО:
АГРОНОМИЯ, ВЕТЕРИНАРИЯ И ЗООТЕХНИЯ
JOURNAL OF OSH STATE UNIVERSITY. AGRICULTURE: AGRONOMY, VETERINARY AND
ZOOTECHNICS
e-ISSN: 1694-8696
№2(7)/2024, 111-122
ВЕТЕРИНАРИЯ
УДК: 579.842.14:616.9:636.1
DOI: 10.52754/16948696 2024 2(7) 12
ШТАММ БАКТЕРИЙ SALMONELLA ABORTUS EQUI ДЛЯ РАЗРАБОТКИ МЕР БОРЬБЫ
SALMONELLA ABORTUS EQUI БАКТЕРИЯСЫНЫН ШТАММЫ МЕНЕН КYРeШY
ЧАРАЛАРЫН ИШТЕП ЧЫГУУ
SALMONELLA ABORTUS EQUI BACTERIAL STRAIN FOR DEVELOPMENT OF
CONTROL MEASURES
Петрова Саргылана Гурьевна
Петрова Саргылана Гурьевна Petrova Sargylana Guryevna
к.в н., Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства имени М.Г. Сафронова, г. Якутск
в.и.к., М.Г. Сафронов атындагы Якутск айыл чарба илимий-изилдвв институту, Якутск шаары Candidate of Veterinary Sciences, Federal Research Center of the Yakut Scientific Research Institute of Agriculture named
after Safronov M.G., Yakutsk.
sargy [email protected]_
Неустроев Михаил Петрович
Неустроев Михаил Петрович Neustroev Mikhail Petrovich
доктор ветеринарных наук, профессор, Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства
имени М.Г. Сафронова, г. Якутск
ветеринария илимдеринин доктору, профессор, М.Г. Сафронов атындагы Якутск айыл чарба илимий-изилдвв
институту, Якутск шаары
Doctor of Veterinary Sciences, Professor, Head of the Laboratory of Veterinary Biotechnology, Federal Research Center of
the Yakut Scientific Research Institute of Agriculture named after Safronov M.G., Yakutsk. [email protected] ORCID: 0000-0003-0672-4109
преподаватель, Женишбеков Абдымалик Ибраимович
окутуучу, Женишбеков Абдымалик Ибраимович lecturer, Zhenishbekov Abdymalik Ibraimovich
Ошский государственный университет
Ош мамлекеттик университети
Osh State University malikj enishbekov67@gmail. com
ШТАММ БАКТЕРИЙ SALMONELLA ABORTUS EQUI ДЛЯ РАЗРАБОТКИ МЕР БОРЬБЫ
Аннотация
Выделение чистых культур бактерий Salmonella abortus equi из биологических материалов, его идентификация, изучение их свойств необходимо для постановки диагноза, разработки мер борьбы и средств профилактики. Культуральные свойства возбудителя изучали путем высева на жидкие и плотные питательные и дифференциально-диагностические среды (мясопептонный бульон, мясопептонный агар, агар Эндо, среду Олькеницкого). Биохимические свойства выделенных культур определяли по способности ферментировать углеводы на средах Гисса с маннитом, лактозой, мальтозой, сахарозой, глюкозой, дульцитом. Подвижность - путем посева на полужидкий агар. Морфологию культур определяли просмотром мазков, окрашенных по Граму при микроскопировании. Антигенную структуру культур сальмонелл определяли с использованием монорецепторных сальмонеллезных сывороток. Штамм бактерий Salmonella abortus equi БН-12 по культуральным, биохимическим и антигенным свойствам соответствует характерным признакам возбудителя сальмонеллезного аборта лошадей. Оценку вирулентности штамма бактерий проверяли на беспородных белых мышах (n= 20) массой тела 18-20 г. Вирулентную активность LD50 определяли методом Кербера. Генетическая идентификация проводилась методом определения нуклеотидной последовательности фрагмента гена 16s рРНК в ЦКП «Геномика» ИХБиФМ СО РАН и отделении биотехнологии ФГБУ «ВГНКИ». Методом ПЦР установлена 100 % идентичность анализируемых последовательностей образцов с нуклеотидной последовательностью гена 16s рРНК Salmonella enterica. Патогенен для белых мышей. Летальная доза составляет 400 млн микробных клеток в 1 мл. Результаты исследований позволили штамм бактерий Salmonella abortus equi БН-12 депонировать во «Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» ФГБУ «ВГНКИ» под номером ВКШМ-Б-01ПД. Из штамма бактерий Salmonella abortus equi БН-12 изготовлена инактивированная вакцина против сальмонеллезного аборта лошадей с иммуномодулятором. Иммунобиологический препарат утвержден Россельхознадзором с выдачей регистрационного удостоверения в 2019 г. Иммуногенность составила 80 %. Вакцина аналогов в России не имеет и успешно применяется в субъектах России и Казахстане. Штамм используется при разработке бактериофагов для диагностики и лечения больных сальмонеллезным абортом лошадей.
Ключевые слова: сальмонеллы, штамм, вирулентность, иммуногенность, депонирование.
SALMONELLA ABORTUS EQUI SALMONELLA ABORTUS EQUI BACTERIAL
БАКТЕРИЯСЫНЫН ШТАММЫМЕНЕНKYPOmY STRAIN FOR DEVELOPMENT OF CONTROL
ЧАРАЛАРЫН ИШТЕП ЧЫГУУ MEASURES
Аннотация
Биологиялык материалдардан Salmonella abortus equi бактерияларынын таза культураларын бвлYп алуу, аны идентификациялоо жана алардын касиеттерин изилдвв диагностикалоо, кYрвшYY жана алдын алуу чараларын иштеп чыгуу Y4YH зарыл. Козгучтун маданий касиеттери суюк жана катуу азыктандыруучу жана дифференциалдык диагностикалык чвйрвлвргв (эт-пептон сорпосу, эт-пептондук агар, Эндо агар, Олкеницкий чвйрвCY) каптоо жолу менен изилденген. Бвлунгвн культуралардын биохимиялык касиеттери гисс чвйрвCYндв углеводдорду маннитол, лактоза, мальтоза, сахароза, глюкоза жана дульцит менен ачытуу жвндвмдYYЛYГY менен аныкталган. Кыймылдуулугу - жарым суюк агарга каптоо аркылуу. Маданияттардын морфологиясы микроскопиянын астында Грам менен боёлгон мазектерди кврYY аркылуу аныкталган. Salmonella культураларынын антигендик TYЗYMY монорецептор Salmonella сывороткасы аркылуу аныкталган. Salmonella abortus equi BN-12 бактериялык штаммы маданий, биохимиялык жана антигендик касиеттери боюнча жылкылардагы сальмонелла абортунун козгогучунун мYнвздYY белгилерине туура келет. Бактериялык штаммдын вируленшуулу^ 18-20 г салмактагы ак чычкандарда (n= 20) бааланды. Генетикалык идентификация 16s рРНК генинин фрагментинин нуклеотиддик ырааттуулугун аныктоо жолу менен Россия Илимдер академиясынын Сибирдеги филиалынын Химиялык биология жана физика институтунун Геномикалык биргелешкен колдонуу борборунда жана Федералдык институттун Биотехнология департаментинде жYргYЗYлдY. Мамлекеттик бюджеттик мекеме "ВГНКИ". ПТР ыкмасы Salmonella enterica дын 16s рРНК генинин нуклеотиддик ырааттуулугу менен талданган YлгY тизмегинин 100% окшоштугун аныктады. Ак чычкандар YЧYн патогендYY. влтYPYY дозасы 1 мл 400 миллион микроб клеткасын тYЗвт. Изилдввнун натыйжалары Salmonella abortus equi BN-12 бактериялык штаммын ВКШМ- номери менен «ВГНКИ» федералдык мамлекеттик бюджеттик мекемесинин «Ветеринарияда жана мал чарбачылыгында колдонулуучу
микроорганизмдердин штаммдарынын БYткYл россиялык мамлекеттик коллекциясына» сактоого мYмкYндYк берди. B-01PD. Иммуномодулятору бар жылкыларда сальмонелла абортуна каршы инактивдештирилген вакцина Salmonella abortus equi BN-12 бактериялык штаммынан жасалган. Иммунобиологиялык дары Россельхознадзор тарабынан 2019-жылы каттоо кYбвлYГYн берYY менен бекитилген. ИммуногендYYЛYк 80% тYЗгвн. Вакцинанын Россияда аналогу жок жана Россия менен Казакстандын субъектилеринде ийгилигауу колдонулат. Штамм сальмонелла аборттору бар жылкыларды диагностикалоо жана дарылоо YЧYн бактериофагдарды иштеп чыгууда колдонулат..
Ачкыч свздвр: сальмонелла, штамм, вируленшуулук, иммуногенд^лук, депонирлвв
Abstract
The isolation of pure cultures of the bacteria Salmonella abortus equi from biological materials, its identification, and the study of their properties are necessary for making a diagnosis, developing control measures and preventive measures. The cultural properties of the pathogen were studied by plating on liquid and solid nutrient and differential diagnostic media (meat-peptone broth, meat-peptone agar, Endo agar, Olkenitsky's medium). The biochemical properties of the isolated cultures were determined by the ability to ferment carbohydrates on Hiss media with mannitol, lactose, maltose, sucrose, glucose, and dulcite. Motility - by plating on semi-liquid agar. The morphology of the cultures was determined by viewing Gram-stained smears under microscopy. The antigenic structure of Salmonella cultures was determined using monoreceptor Salmonella sera. The bacterial strain Salmonella abortus equi BN-12 corresponds in cultural, biochemical and antigenic properties to the characteristic features of the causative agent of salmonella abortion in horses.
The virulence of the bacterial strain was assessed on outbred white mice (n=20) weighing 18-20 g. Virulent activity LD50 was determined by the Kerber method. Genetic identification was carried out by determining the nucleotide sequence of a fragment of the 16s rRNA gene at the Genomics Shared Use Center of the Institute of Chemical Biology and Physics of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences and the Department of Biotechnology of the Federal State Budgetary Institution "VGNKI". The PCR method established 100 % identity of the analyzed sample sequences with the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene of Salmonella enterica. Pathogenic for white mice. The lethal dose is 400 million microbial cells in 1 ml. The research results allowed the bacterial strain Salmonella abortus equi BN-12 to be deposited in the "All-Russian State Collection of Strains of Microorganisms Used in Veterinary Medicine and Animal Husbandry" of the Federal State Budgetary Institution "VGNKI" under the number VKShM-B-01PD. An inactivated vaccine against salmonella abortion in horses with an immunomodulator was made from the bacterial strain Salmonella abortus equi BN-12. The immunobiological preparation was approved by Rosselkhoznadzor with the issuance of a registration certificate in 2019. The immunogenicity was 80 %. The vaccine has no analogues in Russia and is successfully used in the constituent entities of Russia and Kazakhstan. The strain is used in the development of bacteriophages for the diagnosis and treatment of horses with salmonella abortion.
Keywords: salmonella, strain, virulence, immunogenicity, deposition.
Введение
Сальмонеллезный аборт лошадей - инфекционная болезнь бактериального происхождения, проявляющаяся у кобыл абортами или рождением нежизнеспособного молодняка. У жеребят сопровождается диареей и воспалением суставов. Заболевание наносит существенный экономический ущерб коневодству страны [1]. Сальмонеллезный аборт лошадей широко распространен в коневодческих хозяйствах Республики Саха (Якутия), Новосибирской области, Красноярского и Алтайского краев, Республиках Хакасия и Алтай, Иркутской области. При вспышке этой болезни деловой выход жеребят снижается на 20-40 % из-за инфекционных абортов, в зависимости от эпизоотической ситуации. Основные источники инфекции - абортировавшие кобылы [2,3].
Возбудителем сальмонеллезного аборта лошадей является бактерия- подвижная грамотрицательная полиморфная палочка с закругленными краями. Бактерию можно выделить из паренхиматозных органов абортированных плодов (из крови сердца, печени, селезенки, желудка), плодовых оболочек плода, околоплодных вод, с полости матки абортировавших кобыл, обсемененных навоза, сена, и воды. Возбудитель сальмонеллезного аборта лошадей относится к роду Salmonella, виду Salmonella enterica, серовар Salmonella abortus equi.
Основным средством борьбы с сальмонеллезным абортом лошадей является специфичекая профилактика [4]. При изготовлении вакцины используются штаммы бактерий возбудителя сальмонеллезного аборта лошадей, от биологических свойств которых зависит иммуногенность и эффекттивность препарата [5, 6]. Возбудитель сальмонеллезного аборта используется при разработке диагностических препаратов и выделении, идентификации бактериофагов.
Цель исследований - изучение биологических свойств возбудителя сальмонеллезного аборта лошадей для разработки диагностических, лечебных и вакцинных препаратов.
Материалы и методы
Использованы бактериологические, биохимические, серологические и молекулярно-генетические методы исследований. Культуральные свойства возбудителя изучали путем высева на жидкие и плотные питательные и дифференциально-диагностические среды (мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар, агар Эндо, среду Олькеницкого). Биохимические свойства выделенных культур определяли по способности ферментировать углеводы на средах Гисса с маннитом, лактозой, мальтозой, сахарозой, глюкозой, дульцитом. Подвижность - путем посева на полужидкий агар. Посевы инкубировали в термостате при температуре +370 С в течение 18-20 ч. Морфологию культур определяли просмотром мазков, окрашенных по Граму при микроскопировании. Антигенную структуру культур сальмонелл определяли с использованием монорецепторных сальмонеллезных сывороток.
Оценку вирулентности штамма бактерий проверяли на беспородных белых мышах (n= 20) массой тела 18-20 г. Вирулентную активность LD50 устанавливали методом Кербера.
Генетическая идентификация проводилась методом определения нуклеотидной последовательности фрагмента гена 16s рРНК в ЦКП «Геномика» ИХБиФМ СО РАН и отделении биотехнологии ФГБУ «ВГНКИ».
С полужидкого агара бактерии отбирались с помощью обработанного абсолютным спиртом пинцетом путем единичного касания бактериального слоя носиком с фильтром. Затем носик вставлялся в пипеточный дозатор и ресуспендировали в 200 мкл бидистиллированной воды Mili-Q_W, в заранее приготовленном стрипе. Суспензия клеток подвергалась в течение 15 мин УЗО при помощи УЗ-ванны на максимальной мощности.
ПЦР проводилась с использованием стандартных праймеров 16S рРНК 27F (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) и 1492R (GGTTACCTTGTTACGACTT) (~1450 н.п.) на ДНК-амплификаторе Verity (Applied Biosystems). Конечные концентрации компонентов ПЦР были следующие: 1,2 мМ MgCl2, 0,6 мМ dNTP, 5x Phusion GC Buffer (NEB), 0,014 U/мкл Phusion Hot start II Pol (NEB), 0,2 мкМ 16S_27F, 0,2 мкМ 16S_1492R. Схема ПЦР и условия термоциклирования представлены в таблице 1 и 2.
Таблица 1. Схема ПЦР Table 1. PCR scheme
Реактив С исходная С рабочая У=50д1
MgCl? 50 mM 1,2 mM 1,2 д1
dNTP mixture 25 mM 0,6 mM 0,6 д1
5x Phusion GC Buffer 5x x 10 д1
Phusion Hot start || Pol 2U/ Д1 0,014U/ д1 0,35д
16S 27F 10 ^M 0,2 д 1 д
16S 1492R 10 ^M 0,2 д 1 д
cells 1/50V
Таблица 2. Условия термоциклирования
Table 2. Thermal cycling conditions
98°С 98°С 62°С 72°С 72°С 4°С
1:00 0:10 0:15 0:45 5:00 œ
33-35 cycles
Полученные ампликоны анализировали гель-электрофорезом в 1% агарозе Е (Диаэм) после прокрашивания EtBr (Sigma-Aldrich). Очистку проводили набором MinElute PCR Purification Kit (Qiagen).
Полученный ПЦР продукт секвенировался по Сэнгеру с использованием тех же праймеров 16S_27F и 16S_1492R и BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) согласно протоколам производителя. Очистку от не включившегося BDT проводили с помощью Sephadex G-50 Fine (GE Healthcare) по протоколу. Капиллярный электрофорез выполнялся на ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA).
Из прямого и обратного нуклеотидных прочтений путем перекрывания 3'-участков формировался контиг с помощью CLC Main Workbench v22.0 (Qiagen). Поиск ближайшего гомолога проводили Blast [5] с использованием базы NCBI Reference Sequence Database для прокариот.
Результаты исследований и их обсуждение
От абортированных плодов были выделены 25 изолятов возбудителя сальмонеллезного аборта кобыл. Из них штамм бактерий Salmonella abortus equi БН-12 выделен из паренхиматозных органов абортированного плода кобылы из Хангаласского улуса, который является наиболее неблагополучным и стационарным пунктом по сальмонеллезному аборту.
Штамм хорошо растет на универсальных питательных средах в аэробных и факультативно-аэробных условиях.
Оптимальная температура роста +37о С, при рН - 7,2-7,4. По биохимическим свойствам не разлагает лактозу, сахарозу, рафинозу, ксилозу, салицин, инулин, адонит, инозит. Ферментирует с выделением кислоты и газа глюкозу, маннит, дульцит, рамнозу, галактозу. Штамм не свертывает молоко, желатин не разжижает. Ферментативные свойства культуры не постоянны, могут изменяться под действием различных условий в процессе хранения [7].
На МПА образует сероватые округлые колонии (рис. 1), в МПБ дает равномерное помутнение, на полужидком агаре имеет диффузный рост, на среде Эндо растут в виде круглых бесцветных или слегка розоватых прозрачных или полупрозрачных колоний (рис. 2). Дает положительную реакцию с метилротом и отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра. На стекле дает положительную реакцию агглютинизации (РА) с монорецепторными сальмонеллезными сыворотками 04. Патогенен для белых мышей. Летальная доза составляет 400 млн микробных клеток в 1 мл. При микроскопии видны подвижные короткие грамотрицательные палочки (рис. 3).
МПА среде Эндо Fig. 1 -Fig. 2 -Endo
Рис. 1 - Рост на Рис. 2 - Рост на
Growth by MPA Growth on the
Рис. 3 - Грамотрицательные короткие палочки (окраска по Граму) Fig. 3 - Gram-negative short sticks (Gram coloring)
Определение нуклеотидной последовательности фрагмента гена 16S рРНК трех бактериальных штаммов проводилось при помощи программы Blast с сравнительным анализом нуклеотидных последовательностей исследуемых образцов с последовательностями микроорганизмов, представленных в базах данных GenBank+EMBL+
DDBJ+PDB. Для каждого образца была проведена ПЦР и получены ампликоны, соответствующие гену 16S рРНК.
Все фрагменты очищены от компонентов ПЦР с помощью сорбции на магнитных частицах Протокол АтРигеХР с количеством х0,8. Концентрации очищенных ампликонов в таблице 3.
Таблица 3. Концентрация ампликонов Table 3. Concentration of amplicons
Sem pl ID User ID Date Tim e ng/u l A26 0 A28 0 260/2 80 260/2 30 Consta nt Cure or Pos. Curs or abs 340 raw Measurem ent Type
BN1 2 Defau lt 22/07/ 29 18:1 5 46.7 2 0.93 4 0.53 4 1.75 1.85 50.00 230 0.50 6 0.04 3 Measure
A/S Defau lt 22/07/ 29 18:1 5 47.9 2 0.95 8 0.49 0 1.96 2.50 50.00 230 0.38 3 0.02 7 Measure
SAE Defau lt 22/07/ 29 18:1 5 19.1 0 0.98 2 0.51 7 1.90 2.04 50.00 230 0.48 1 0.02 4 Measure
Секвенированы методом Сэнгера по 300 fmol ампликона с обеих сторон, используя те же праймеры, что и для амлификации. Реакции очищены хроматографическими колонками 1ml с Sephadex G-50. Секвенограммы сшивали в программе CLC Main Workbench 8.
В результате были получены следующие контиги последовательностей (рис. 4):
1. Сшитый контиг фрагмента гена 16S рРНК Salmonella abortus equi БН-12
GGCGTAGGAGGYAGCTWGCTGCTTCGCTGACGAGWGGCGGACGGGTGAGTAAT GTCTGGGAAACTGSCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTGGCTAATACCGCA TAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAG ATGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTC TGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGC AGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATG AAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATA ACCGCAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCC GCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAA ACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGC GTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGC TCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTA AACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAA GTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGC CCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGG TCTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACA GGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA GCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCA GTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGG
GCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCG
GACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTYGACTCCATGAAGTC
GGAATCGYTAGTAATYRWGGATCWRAATRCCAACGTAGAMTACGTTSTMMCAACGTA
RTWCACGTCCTMCCAACGCAMCCAWGTMGTAACAACTAAYCAAGTMGTWACAASGT
AATCAAGTCGTAACA
Consensus 1 CCCGCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCGTGGTAGTCCAC
BN-12_27F.A04 iCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCGTGGT AGTCCAG
BN-12_1492R.B04 CCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAG
Рис. 4. Секвенограмма Fig. 4. Sequenogram
2. Сшитый контиг фрагмента гена 16S рРНК Salmonella abortus equi А/S AGCTTGCTGCTTCGCTGACGAGWGGYGGACGGGTGRGTAATGTCTGGGAAACT GSCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAG ACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCT TGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGAC CAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAA TATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTC GGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATT GACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGG AGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAA GTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTTG AGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGA GGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAG CGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACT TGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTG GGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGG TGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCAC AGAAGAATCCAGAGATGGATTTGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGC TGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAT
CCTTTGTTGCCAGCGATTAGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGA GGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGC TACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGT GCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTYGACTCCATGAAGTCGGAATCG
3. Сшитый контиг фрагмента гена 16S рРНК Salmonella abortus equi Sae
CAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCT GGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTGGCTAATACCGCATAA CGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATG GGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGA GAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC AGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAG AAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACC GCAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGC GGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACT GGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTA GAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCA GGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAA CGATGTCTACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGT AGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCC GCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTC TTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGG TGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGC GCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGT GATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGC TACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGA CCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTYGACTCCATGAAGTCGG AATCGYTAGTAAT
В результате получены следующие контиги последовательностей, которые представлены в таблице 4.
Таблица 4. Бласт анализ контигов
Table 4. Blast analysis of contigues
№ образцов Наименование образца Ближайший гомолог
1 БН-12 Salmonella enterica
2 A/S Salmonella enterica
3 Sae Salmonella enterica
Следовательно, установлена 100 % идентичность анализируемых последовательностей образцов с нуклеотидной последовательностью гена 16S рРНК Salmonella enterica.
Комиссионные испытания штамма бактерий Salmonella abortus equi БН-12 в отделении биотехнологии ФГБУ «ВГНКИ» также показали 100% идентичность анализируемой последовательности образца с нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК Salmonella enterica (GenBank CP104638.1). Результаты исследований позволили штамм бактерий Salmonella abortus equi БН-12 депонировать во «Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» ФГБУ «ВГНКИ» под номером ВКШМ-Б-0ШД в ампулах в лиофилизированном под вакуумом виде, при температуре хранения +2-80 С (Справка о депонировании № 01ПД от 16.11.2022 г.).
Для определения вирулентности штамма бактерий Salmonella abortus equi БН-12 использовали 18-20-часовую культуру. Культуру после пересева на МПА доводили до концентрации 2 млрд микробных тел в 1 мл по оптическому стандарту мутности. Затем готовили разведения на стерильном физиологическом растворе (1 млрд, 500 млн, 400 млн, 300 млн и 200 млн микробных тел в 1 мл). Из каждой пробирки заражали по четыре белой мыши. Разведенную культуру в дозе 0,2 мл вводили подкожно в область спины, одновременно четырем мышам вводили 0,2 мл мясопептонного бульона и физиологического раствора в качестве контроля. Наблюдения вели в течение 15 дней.
Результаты опыта по определению летальной дозы (LD50) штамма бактерий Salmonella abortus equi БН-12 приведены в таблице 5. LD50 составила 400 млн микробных тел в 1 мл.
Таблица 5. Результаты определения вирулентности штамма бактерий Salmonella abortus equi БН-12 Table 5. The results of determining the virulence of the bacterial strain Salmonella abortus equi BN-12
Доза Экспериментальные данные
голов %
заболело и погибло не заболело заражения
1 млрд м.к. 4 0 100
500 млн м.к. 3 1 75,0
400 млн м.к 4 0 100
300 млн м.к. 3 1 75,0
200 млн м.к. 0 4 0
Контроль 0 4 0
Из штамма бактерий Salmonella abortus equi БН-12 изготовлена инактивированная вакцина против сальмонеллезного аборта лошадей с иммуномодулятором. Иммунобиологический препарат утвержден Россельхознадзором с выдачей регистрационного удостоверения в 2019 г. Для определения иммуногенной активности вакцину вводили 20 ти белым мышам массой тела 18-20 г подкожно в дозе 0,5 мл. Через 14 дней после иммунизации 20 вакцинированных и 20 контрольных мышей аналогичной массы заражали подкожно в области спины подтитрованной летальной дозой (LD50) штамма бактерий Salmonella abortus equi БН-12. В течение 10 дней наблюдения за животными из 20
голов иммунизированных мышей заболели и погибли две мыши, а в контрольной группе -18. Иммуногенность составила 80 %. Вакцина аналогов в России не имеет и успешно применяется в субъектах России и Казахстане.
В настоящее время нами разрабатываются бактериофаги для диагностики и лечения больных сальмонеллезным абортом лошадей. Штамм используется для идентификации бактериофагов, выделенных из объектов окружающей среды и больных лошадей.
Заключение
Выделен и изучены морфологические, культуральные, биохимические, антигенные, молекулярно-генетические свойства штамма бактерий Salmonella abortus equi БН-12. Штамм депонирован во «Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» ФГБУ «ВГНКИ» под номером ВКШМ-Б-01ПД, который может быть использован для разработки диагностических и вакцинных препаратов при сальмонеллезном аборте лошадей.
Список источников
1. Гулюкин М.И. Профилактика массовых инфекционных болезней лошадей в табунном коневодстве / Гулюкин М.И., Юров К.П. // Ветеринария и кормление. - 2004. - № 4. - С. 22-24.
2. Неустроев М.П., Петрова С.Г., Ордахов И.А. Сальмонеллезный аборт лошадей (этиология, эпизоотология, меры борьбы и профилактики): - Монография;. - Новосибирск: Изд. ООО «СибАК», 2019. - С. 9.
3. Borovikov S. Clinical case of Salmonella detected in an aborted mare fetus and its characteristics / Borovikov S., Kuibagarov M., Akibekov O. and Muranets A. // International Journal of Veterinary Science. - 2024 - 13(3) - P. 357-361.
4. Неустроев М.П. Результаты разработки вакцины против сальмонеллезного аборта лошадей / Неустроев М.П., Петрова С.Г. // Российская сельскохозяйственная наука. -2020. - № 4. - С. 69-72.
5. Султанов А.А. Диагностика и профилактика сальмонеллезного аборта кобыл / Султанов A.A. [и др.] // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2015. - № 12 (часть 10) - С. 1883-1887.
6. Неустроев М.П. Результаты лабораторного контроля иммуногенности инактивированной вакцины против ринопневмонии и сальмонеллезного аборта лошадей / Неустроев М.П. [и др.] // Российская сельскохозяйственная наука. - 2016. - №4. - С. 74-77.
7. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / под ред. М.О. Биргера. - 3-е изд.перераб. и доп. - М.: Медицина, 1982. - С. 183-198.
References
1. Gulyukin M.I. Prevention of mass infectious diseases of horses in herd horse breeding / Gulyukin M.I., Yurov K.P. // Veterinary medicine and feeding. - 2004. - No. 4. - pp. 2224.
2. . Neustroev M.P., Petrova S.G., Ordakhov I.A. Salmonella abortion of horses (etiology, epizootology, control and prevention measures): - Monograph;. Novosibirsk: Ed. SibAK LLC, 2019. - p. 9.
3.
4. . Neustroev M.P. The results of the development of a vaccine against salmonella abortion of horses / Neustroev M.P., Petrova S.G. // Russian agricultural science. - 2020. - No. 4. -pp. 69-72.
5. Sultanov A.A. Diagnostics and prevention of salmonella abortion of mares / Sultanov A.A. [et al.] // International Journal of Applied and Fundamental Research. - 2015. - No. 12 (part 10) - P.1883-1887.
6. Neustroev M.P. Results of laboratory control of immunogenicity of inactivated vaccine against rhinopneumonia and salmonella abortion of horses / Neustroev M.P. [et al.] // Russian agricultural science. - 2016. - No.4. - pp. 74-77.
7. Handbook of microbiological and virological research methods / edited by M.O. Birger. - 3rd ed.overworking and additional - M.: Medicine, 1982. - P. 183-198.
