CC BY
51
Т.Д. Татаринова, А. Г.Пономарев, А. А. Перк, И.В.Васильева, В.В.Бубякина СЕЗОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ
ДЕГИДРИНОВ ПОЧЕК BETULA PLATYPHYLLA SUKACZ.,
СВЯЗАННЫЕ С ФОРМИРОВАНИЕМ УСТОЙЧИВОСТИ К ЭКСТРЕМАЛЬНОМУ КЛИМАТУ ЯКУТИИ
Введение
На территории Якутии, находящейся в пределах криолитозоны (многолетняя мерзлота), отмечаются максимальные годовые перепады температур (более 100 °С), не встречающиеся ни в одной другой точке мира. Резко континентальный климат региона характеризуется малой продолжительностью вегетационного периода, экстремально низкими зимними (до -55...-60 °С) и высокими летними (до +38 °С) температурами, приводящими к дефициту влаги в воздухе и почве. Местные древесные виды растений обладают ранними сроками вхождения в состояние глубокого покоя при относительной его краткости, а также очень продолжительным периодом вынужденного покоя при экстремально жестком низкотемпературном стрессе. Последний выступает как главный фактор отбора при адаптации растений на Севере.
Степень морозоустойчивости многолетних растений изменяется сезонно в зависимости от колебаний температуры. Этот процесс называется сезонным холодовым закаливанием и раззакаливанием [1]. Различные ткани и органы растений обладают разной степенью устойчивости к действию отрицательных температур. Известно, что наиболее криотолерантны почки и кора растений [2]. Вместе с тем даже в пределах одного вида встречаются особи с различной степенью устойчивости к тем или иным стресс-факторам. Каждая особь в популяции, как и сама популяция в целом, обладают разным набором генетических, морфологических и биохимических признаков, обусловливающих их гетерогенность (полиморфизм). Гетерогенность играет важную роль, обеспечивая значительное расширение адаптивного потенциала популяции. Одним из маркеров полиморфизма могут служить особенности как спектров суммарных белков, так и отдельных полипептидов индивидуальных растений, отличающихся высокой устойчивостью к холодовому стрессу.
В ходе холодового закаливания в результате низкотемпературного воздействия и уменьшения фотопериода индуцируется накопление АБК и других ингибиторов, происходит постепенная дегидратация, сопровождаемая экспрессией генов, кодирующих Cor-полипептиды (регулируемые холодом). К последним относятся, например, ферменты, ответственные за синтез совместимых осмолитов, десатуразы, а также белки теплового шока [1, 3]. Среди участвующих в процессах холодового закаливания полипептидов особый интерес вызывает ряд белков со структурным сходством с белками позднего эмбриогенеза (Late Embryogenesis Abundant, LEA). К группе II суперсемейства LEA-белков относятся водорастворимые белки-дегидрины, индуцируемые обезвоживанием [3, 4]. Они отличаются наличием высококонсервативных Y, S и K-сегментов,
© Т. Д. Татаринова, А. Г. Пономарев, А. А. Перк, И. В. Васильева, В. В. Бубякина, 2011
а также последовательностей богатых глицином. Обязательным для всех дегидринов является присутствие K-сегмента. Дегидрины выявляются при многих стрессовых воздействиях (низкие температуры, засуха, засоленность), сопровождающихся изменением водного статуса растений. Они задействованы в стабилизации макромолекул и мембран.
Вероятно, что спектр белков, связанный с формированием уникальной морозоустойчивости растений Якутии, а также характер их годовых изменений имеет особенности, отличные от таковых в многолетних растениях более умеренных зон. Подобного рода исследования биохимических особенностей деревьев криолитозоны ранее не проводились.
Цель настоящей работы — изучение сезонных изменений состава и содержания суммарных белков и дегидринов почек березы плосколистной (Betula platyphylla Sukacz.) при формировании морозоустойчивости в условиях экстремального климата Центральной Якутии.
Материалы и методы исследования
Исследования проводили в течение 2009 г. в лесопарковой зоне на территории Ботанического сада Института биологических проблем криолитозоны СО РАН, расположенного на второй надпойменной террасе долины р. Лены в 7 км к западу от г. Якутска (62 °15' с.ш., 129 °37' в.д.). Объектом исследования являлась береза плосколистная (Betula platyphylla Sukacz.) — наиболее распространенная лесообразующая лиственная порода Якутии. Сбор полевых материалов осуществляли ежемесячно на постоянных пробных площадях с шести деревьев (Ya1-Ya6). Возраст берез — 40-50 лет. Использовали почки текущего прироста березы, расположенные в средней, хорошо освещаемой естественным светом части кроны и собранные в первую половину дня (9:00-10:00). В период отсутствия почек в июне для анализа собирались листья. Средняя температура воздуха за май-сентябрь 2009 г. составляла 14,2 °С, сумма осадков во время вегетации достигала 142 мм, минимальная зимняя температура воздуха -44 °С (начало февраля). Эти показатели климата близки к средним многолетним значениям, наблюдаемым в Центральной Якутии. Для выделения суммарных белков почки и листья березы (1-2 г) измельчали в ступке в жидком азоте в присутствии нерастворимого по-ливинилпирролидона (ПВП, “Serva”, Германия, 2,5 % по отношению к объему буфера для экстракции) и буфера (20 мл), содержавшего 0,1 М Трис-HCl, рН 7,5, 12 мМ 2-мер-каптоэтанола, 1%-ного ДДС, 10 мМ ЭДТА, 3 мМ ФМСФ (фенилметилсульфонилфто-рид) [5]. Гомогенат центрифугировали 20 мин при 50 000 g. К супернатанту добавляли ПВП (2,5% по отношению к объему супернатанта) и центрифугировали 20 мин при 50 000 g. Все процедуры проводили при 4 °С. Белки осаждали пятью объемами ацетона при -20 °С. Содержание белка определяли с помощью набора (“Bio-Rad”, США). Электрофорез проводили в 12,5%-ной SDS-PAGE [6] с использованием маркеров молекулярной массы (мол. м.) (“Fermentas”, Литва) и последующим окрашиванием белков Ку-масси R-250. На треки наносили равное количество белка (15 мкг). Иммуноблоттинг проводили в соответствии с методикой из работы [7]. Белки из ПААГ переносили на ПВДФ (поливинилиденфторид) мембрану (“Bio-Rad”, США).
Идентификацию дегидринов выполняли с помощью поликлональных антител против их консервативного К-сегмента (EKKGIME/DKIKEKLPG) [4] в разведении
1:500 (“Agrisera”, Швеция). Дегидрины визуализировали при помощи кроличьих антител, конъюгированных с щелочной фосфатазой в разведении 1 : 2500 (“Sigma”, США). В качестве хромогенных субстратов использовали 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат и нитросиний тетразолий (“AppliChem”, Германия). На рисунках приведены результаты электрофореза и иммуноблоттинга суммарных белков почек и листьев (июнь) трех характерных экземпляров берез (Ya3, Ya4, Ya6) после трех аналитических определений. Температуру воздуха в районе г. Якутска отслеживали по данным (URL: http:// www.wunderground.com) с параллельной ее регистрацией на опытном участке с помощью термографа DS1922L iBitton (“Dallas Semiconductor”, США). Данные сканирования гелей и блотов (“Canon”, Япония) обрабатывали с помощью программы ImageJ 1.41 o / Java 1.50_09 (США). Молекулярную массу белков рассчитывали в среде электронной таблицы Microsoft Excel 2002 из пакета Microsoft Office.
Результаты исследования и их обсуждение
Одним из подходов для выявления специфики адаптационного процесса растений служит исследование сезонных изменений белковых спектров [8]. По мере снижения минимальной температуры воздуха с 12,5 до 1,5 °С с июля по август происходит уменьшение на 30% содержания влаги в побегах березы, что запускает механизмы холодового закаливания деревьев [9].
В общем спектре суммарных белков почек B.platyphylla из Центральной Якутии было идентифицировано около 60 полос полипептидов с разной мол. м. (рис. 1). Эти белки берез условно могут быть разделены на три группы в зависимости от сезонного поведения. К первой группе относятся полипептиды, обнаруживающиеся круглогодично и мало подверженные сезонным количественным изменениям, например, мажорные белки с мол. м. 51, 83, 116 кДа. Во вторую группу можно объединить полипептиды с выраженной сезонной динамикой, наиболее представленные в летний период. К таковым можно отнести белки с мол. м. 15, 39, 60, 68 и 79 кДа. Видно, что с наступлением весны (май), после значительного повышения среднесуточных температур и в летний период во время вегетации растений в спектре суммарных белков почек берез количественно преобладают более высокомолекулярные полипептиды. Одновременно снижается содержание белков в низкомолекулярной области. Вместе с тем в июне, когда почки только формируются, в спектре белков листьев выявляются несколько мажорных полипептидов с мол. м. 15, 49 и 51 кДа, в то время как другие белки представлены в менее значительных количествах. К третьей группе белков, накопление которых наблюдается при подготовке растений к покою (август, сентябрь) и, вероятно, связанных с формированием устойчивости к экстремальным условиям перезимовки, относятся полипептиды с мол. м. 14, 17, 26, 27, 42, 49 кДа. Их уровень остается стабильно высоким в течение длительной зимы. Хотя функции этих мажорных белков в период покоя неизвестны, особенности их сезонной динамики позволяют предположить, что среди них могут быть запасающие и иные полипептиды, ассоциированные с перезимовкой. В целом выявленная динамика сезонных изменений суммарных белков является однотипной в годовом цикле якутской популяции берез.
Одновременно при сравнении электрофоретических спектров белков между отдельными экземплярами берез установлено наличие вариабельных участков, расположенных в двух областях. Прежде всего, это относится к белкам с мол. м. 23-26 кДа.
-116 ■ 83 ' 79 68 60 - 51 ' 49 ' 42 ' 39
. 27 26
17
15
14
Янв. Фев. Март Апр. Май Июнь Июль Авг. Сент. Окт. Нояб. Дек. Месяцы
б
кДа
Янв. Фев. Март Апр. Май Июнь Июль Авг. Сент. Окт. Нояб. Дек. Месяцы в
Янв. Фев. Март Апр. Май Июнь Июль Авг. Сент. Окт. Нояб. Дек. Месяцы
Рис. 1. Результаты электрофореза суммарных белков почек (в июне — листьев) B. pla-typhylla Ya3 (а), Ya4 (б), Ya6 (в) в течение 2009 г.
Слева — мол. м. маркеров; справа — полипептидов с сезонной динамикой.
кДа
.69
‘ 66
кДа 116—►
66,2—►
45—►
35—►
25-»-
-21
. 18 -17 -15
Янв. Фев. Март Апр. Май Июнь Июль Авг. Сент. Окт. Нояб. Дек. Месяцы
б
кДа
69
:бб
'59
18,4-
14,4-
-17
Янв. Фев. Март Апр. Май Июнь Июль Авг. Сент. Окт. Нояб. Дек. Месяцы
Рис. 2. Результаты иммуноблоттинга суммарных белков почек (в июне — листьев) B. pla-typhylla Ya3 (а), Ya4 (б), Ya6 (в) с антителами на дегидрины в течение 2009 г.
Слева — мол. м. маркеров; справа — дегидри-нов.
кДа
73 69 : 66 64 59
Янв. Фев. Март Апр. Май Июнь Июль Авг. Сент. Окт. Нояб. Дек.
В данной области выявляются от 1 до 4 минорных белковых полос, которые занимают различные позиции у разных образцов растений. Другой полиморфный участок представлен в области мол. м. 16-18 кДа, где наблюдается от 1 до 3 минорных белковых полос. Таким образом, выявленные полиморфные участки в спектрах суммарных белков почек могут служить маркерами отдельных экземпляров берез.
Сравнение спектров дегидринов, выявленных с помощью иммуноблоттинга, показало, что у изученных берез наблюдаются две области распределения мажорных дегидринов: низкомолекулярная — в интервале от 15 до 21 кДа и среднемолекулярная — в интервале от 59 до 73 кДа (рис. 2). Мажорные полипептиды с мол. м. 17, 66 и 69 кДа встречаются у всех экземпляров растений, в то время как другие обнаруживаются только у отдельных берез. Например, 18 и 21 кДа-белки характерны для березы Ya3 (рис. 2, а), но отсутствуют у берез Ya4 (рис. 2, б) и Ya6 (рис. 2, в). Дегидрины с мол. м. 66 и 69 кДа наблюдаются у всех экземпляров берез, в то время как полипептид с мол. м. 73 кДа характерен только для Ya6. Дегидрин с мол. м. 59 кДа свойственен березам Ya4 и Ya6. Наличие дегидрина с мол. м. 64 кДа также характерно для березы Ya6. В целом березы Ya4 и Ya6 имеют меньше различий по спектру дегидринов почек между собой по сравнению с таковым березы Ya3. Остальные экземпляры берез (Ya1, Ya2, Ya5) обладали сходными характеристиками, более близкими к березам Ya4 и Ya6 (данные не приведены).
У всех берез наблюдаются общие черты в сезонных изменениях дегидринов. Во-первых, низкомолекулярные дегидрины имеют более выраженную сезонную динамику, чем среднемолекулярные. Они полностью исчезают во время вегетации, начиная с апреля-мая, и вновь появляются в августе-сентябре при подготовке растений к покою. Интересно, что дегидрин с мол. м. 17 кДа у березы Ya6 исчезает ранней весной и появляется также рано осенью в августе, в то время как у берез Ya3 и Ya4 он исчезает в мае и вновь синтезируется в сентябре. С другой стороны, среднемолекулярные дегидрины имеют менее выраженную динамику в годовом цикле. Их содержание несколько падает в летний период. Изученные экземпляры берез также отличались по количеству мажорных дегидринов. В целом количество изоформ дегидринов колебалось от 4 (Ya4) до 6 (Ya3 и Ya6), причем низкомолекулярных от 1 (Ya4 и Ya6) до 4 (Ya3), а среднемолекулярных — от 2 (Ya3) до 5 (Ya6). Осенью в период листопада березы, вероятно, полностью формируется необходимый набор дегидринов. Можно предположить, что главным для поддержания низкотемпературной устойчивости берез является наличие двух групп дегидринов — низко- (17, 18 и 21 кДа) и среднемолекулярных (59, 64, 66, 69 и 73 кДа). Их индивидуальный полиморфизм, возможно, обусловлен посттрансляцион-ной модификацией отдельных дегидринов, что может являться одной из адаптивных реакций организма. Существование подобных изменений было описано для белка Picg5 белой ели (Picea glauca), предполагаемая функция которого связана с приобретением устойчивости к холодовому стрессу [10].
В период подготовки к зиме наблюдается значительный синтез дегидринов, связанный со снижением содержания воды, одновременно сопровождаемый появлением ингибиторов роста и повышением содержания ненасыщенных жирных кислот в органах и тканях B.platyphylla и возрастанием морозоустойчивости [11, 12]. Нами было показано, что уровень дегидринов в побегах B. platyphylla якутской популяции является самым высоким в период покоя, когда морозоустойчивость достигает максимума [9]. В период возобновления роста побегов весной происходит деакклимация, которая
сопровождается резким снижением уровня дегидринов, особенно низкомолекулярных, и морозоустойчивости в целом. Таким образом, самый низкий уровень дегидринов приходится на период вегетации. Аналогичная зависимость для дегидринов почек выявлена в настоящей работе. Другие исследователи также отмечали связь между накоплением дегидринов у древесных растений умеренных зон и уровнем их устойчивости к холоду [3]. Содержание обнаруженных нами низкомолекулярных дегидринов почек берез в области мол. м. 15-21 кДа и среднемолекулярных дегидринов в области мол. м. 56-73 кДа в период с октября по апрель оставалось без заметных колебаний на высоком уровне. Данный факт отличается от выводов, сделанных при изучении дегидринов, выявляемых с помощью антител против дегидрина dsp 16 из Craterostigma plantagineum, в почках другого вида березы (B. pubescens) в условиях Скандинавии [13]. Авторы указанной работы отмечали максимум содержания найденного ими дегидрина 24 кДа в течение всего осенне-зимнего периода, а дегидрина 30 кДа — только в самые холодные месяцы зимы. Возможно, это связано с тем, что в условиях относительно мягкого климата Финляндии часто наблюдаются возвратные потепления, в отличие от резко континентального климата Центральной Якутии, где температура воздуха стабильно держится в пределах низких отрицательных значений, подавляя возможность изменения состава дегидринов во время покоя.
При сравнении молекулярных масс наиболее близким к дегидрину с мол. м. 21 кДа почек якутской березы B. platyphylla является дегидрин с мол. м. 24 кДа почек финской березы B.pubescens. Наблюдаемые различия в молекулярных массах могут быть связаны с видовой спецификой растений и климатическими особенностями региона. Сходные по молекулярным массам дегидрины, индицируемые холодом, также найдены у Vaccinium corymbosum (14 и 65 кДа) [14] и Citrus unshiu (19 кДа) [15]. Насколько нам известно, идентифицированные в данной работе низко- и среднемолекулярные дегидрины ранее у берез не описывались.
Заключение
Впервые в почках берез якутской популяции Betula platyphylla выявлены сезонные изменения суммарных белков и дегидринов. С помощью иммунодетекции обнаружены две группы мажорных низкомолекулярных (15, 17, 18 и 21 кДа) и среднемолекулярных (59, 64, 66, 69 и 73 кДа) дегидринов, стабильно высокое содержание которых в период покоя коррелирует с наибольшей морозоустойчивостью деревьев. Установлен их полиморфизм внутри популяции. Обнаруженные особенности сезонных изменений дегидринов предполагают их участие в формировании морозоустойчивости березы к экстремально низким зимним температурам в условиях резко континентального климата Якутии.
***
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант №09-04-98556-р_ восток_а).
1. Functional role of winter-accumulating proteins from mulberry tree in adaptation to winter-induced stresses / Fujikawa S., Ukaji N., Nagao M. Yamane K., Takezawa D., Arakawa K. // Cold Hardiness in Plants: Molecular and Physiology. 2006. P. 181-202.
2. Туманов И. И. Физиология закаливания и морозостойкости растений. М.: Наука, 1979. 350 с.
3. Welling A., Palva E. T. Molecular control of cold acclimation in trees // Physiologia Plantarum. 2006. Vol. 127. P. 167-181.
4. Svensson J., Ismail A. M., Palva E. T., Close T. J. Dehydrins // Cell and molecular responses to stress. Amsterdam, NL: Elsevier Press, 2002. Vol. III. P. 155-171.
5. Variations in the content of stress proteins in the needles of common pine (Pinus sylvestris L.) within an annual cycle / Korotaeva N. E., Oskorbina M. V., Kopytova L. D., Suvorova G. G., Borovskii G. B., Voinikov V. K. // J. For. Research. 2011. DOI 10.1007/s10310-011-0260-y.
6. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. P. 680-685.
7. Timmons T. M., Dunbar B. S. Protein blotting and immunodetection // Methods Enzymol. 1990. Vol. 182. P. 679-701.
8. Пономарев А. Г., Татаринова Т. Д., Перк А. А., Бубякина В. В., Алексеев В. А. Физиологобиохимические характеристики Betula platyphylla в связи с условиями произрастания на многолетней мерзлоте // Вестн. Моск. гос. ун-та леса: Лесной вестник. 2009. № 2. С. 12-16.
9. Особенности сезонной динамики дегидринов Betula platyphylla Sukacz., ассоциированные с формированием морозоустойчивости в условиях криолитозоны / Бубякина В. В., Татаринова Т. Д., Пономарев А. Г., Перк А. А., Соломонов Н. Г. // Докл. АН. 2011. Т. 439. № 6. С. 844-877.
10. Characterization of Picg5 novel proteins associated with seasonal cold acclimation of white spruce (Picea glauca) / Liu J. J., Abul К. М., Ekramoddoullah D. T., Piggott N, Summer L., Hawkins B. // Trees. 2004. Vol. 18. P. 649-657.
11. Древесные растения Якутии и низкотемпературный стресс / Петров К. А., Софроно-ва В. Е., Бубякина В. В., Перк А. А., Татаринова Т. Д., Пономарев А. Г., Чепалов В. А., Охлопкова Ж. М., Васильева И. В., Максимов Т. Х. // Физиология растений. 2011. Т. 439. №6. С. 866-874.
12. Сезонная динамика тотальных белков и ингибиторов роста Betula platyphylla в условиях разных регионов криолитозоны Якутии / Бубякина В. В., Алексеев В. А., Петров К. А., Тата-ринова Т. Д., Перк А. А., Пономарев А. Г. // Первые Беккеровские чтения. Ч. I. Волгоград, 2010. С. 25-26.
13. Rinne P., Welling A., Kaikuranta P. Onset of Freezing Tolerance in Birch (Betula pubescens Ehrh.) Involves LEA Proteins and Osmoregulation and is Impaired in an ABA-deficient Genotype // Plant Cell Environ. 1998. Vol. 21. P. 601-611.
14. Muthalif M. M., Rowland L. J. Identification of Dehydrin-Like Proteins Responsive to Chilling in Floral Buds of Blueberry (Vaccinium, section Cyanococcus) // Plant Physiol. 1994. Vol. 104. P. 14391447.
15. Hara M., Terashima S., Kuboi T. Characterization and cryoprotective activity of cold-responsive dehydrin from Citrus unshiu // J. Plant Physiol. 2001. Vol. 158. P. 1333-1339.
Статья поступила в редакцию 9 июня 2011 г.
