CC BY
42
ЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВО
ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ BETULA PLATYPHYLLA В СВЯЗИ С УСЛОВИЯМИ ПРОИЗРАСТАНИЯ
на многолетней мерзлоте
А.Г ПОНОМАРЕВ, ст. науч. сотр. Института биологических проблем криолитозоны СО РАН, канд. биол. наук,
Т.Д. ТАТАРИНОВА, ст. науч. сотр. Института биологических проблем криолитозоны СО РАН, канд. биол. наук,
A. А. ПЕРК, науч. сотр. Института биологических проблем криолитозоны СО РАН,
B. В. БУБЯКИНА, ст. науч. сотр. Института биологических проблем криолитозоны СО РАН, канд. биол. наук,
В.А. АЛЕКСЕЕВ, асп. Института биологических проблем криолитозоны СО РАН
Проблемы, связанные с комплексным изучением условий формирования, функционирования бореальных лесных экосистем на фоне глобального изменения климата и процессов интенсивного ресурсного освоения Северной Евразии, требуют создания эффективных механизмов мониторинга исходного состояния биоразнообразия, выявления его адаптационного потенциала [3]. Обширная территория Якутии с многолетней мерзлотой является уникальной средой обитания, в которой растительные организмы подвергаются максимально контрастным температурным воздействиям от +35°С летом до -60°С зимой. Стратегия выживания древесных видов в таких условиях характеризуется ранними сроками вхождения в состояние глубокого покоя, относительной его краткостью и очень продолжительным периодом вынужденного покоя. Последний протекает в условиях значительного обезвоживания и полного подавления обмена веществ зимой на фоне экстремально низких температур. Конкретная степень морозостойкости определяется процессами холодовой акклимации и деакклимации, в ходе которых происходят структурные перестройки на тканевом, клеточном и молекулярном уровнях. В процессах холодовой акклимации одну из ведущих ролей отводят белкам. Среди них известны ферменты для синтеза совместимых осмолитов, для модификации липидов мембран, ряд белков со структурным сходством с белками позднего эмбриогенеза (late embryogenesis abundant, LEA), белками теплового шока (heat-shock proteins, HSP) и белками, связанными с патогенезом (pathogenesis-related, PR) [6, 8].
a.g.ponomarev@ibpc.ysn.ru
В связи с этим интересным является изучение морозостойкости наиболее распространенной лесообразующей лиственной породы Якутии - березы плосколистной Betula platyphylla Sukacz., занимающий гигантский ареал в границах таежной зоны. Из общей площади лесов Республики Саха (Якутия) в 255631 тыс. га (28 % площади лесов России), представленных в основном лиственничниками и сосняками, на березняки приходится 1,5 % [4].
Для комплексной оценки морозостойкости и зимостойкости растений часто используют метод электролитов «electrolyte leakage method.», который находит применение при исследованиях температурных, токсикологических и других стрессовых воздействий [1, 5]. Основным показателем в этом случае является величина утечки электролитов из тканей и органов растений, которая прямо пропорциональна повреждающему клеточные мембраны фактору. Можно предполагать, что качественный состав и содержание белков, синтезируемых в период осеннего закаливания и необходимых для успешной перезимовки древесных видов в условиях экстраконтинетального климата Якутии, отличается от таковых растений более умеренных зон. Однако, насколько известно, подобные исследования до сих пор не проводились. Полученная таким образом информация в свою очередь может быть применена для целенаправленного поиска белков-маркеров морозостойкости древесных пород, пригодных для экспресс-отбора перспективных видов и сортов растений без многолетнего длительного тестирования.
12
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 2/2009
ЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВО
4 8 12 16 20 24 Ф.
Время, ч
♦ 21.03.2007 -25.06.2007 а 10.01.2008 Рис. 1. Динамика удельного электрического сопротивления (r) вытяжек из побегов B. platyphylla в разные сезоны года.; Ф - фиксированные кипячением побеги
Рис. 2. Ход минимальной температуры воздуха (А) и изменения коэффициента морозостойкости B. platyphylla (Б) в течение анализируемого периода (конец 2006 г. - начало 2008 г.)
Целью настоящей работы являлась оценка степени сезонной морозостойкости центральноякутской популяции B. platyphylla с помощью метода электролитов, изучение изменений качественного состава и содержания белков, ассоциированных с формированием уникальной морозостойкости в условиях криолитозоны.
Пробы (одно- двухлетние побеги) B. platyphylla отбирали в лесопарковой зоне ботанического сада ИБПК СО РАН (окрестности г. Якутска, 62° 01' с.ш., 129° 36' в.д.) в течение декабря 2006 г- марта 2008 г. не менее одного раза в месяц. Климатические параметры в годы наблюдений не выходили за стан-
дартные пределы, отмечаемые за последние десятилетия для Центральной Якутии.
Кондуктометрию проб проводили в день их сбора. Параллельно пробы фиксировали жидким азотом для анализа качественного и количественного состава тотальных белков. Для метода электролитов отрезки побегов массой в 1 г заливали 40 мл дистиллированной воды. Электрическое сопротивление вытяжек измеряли с помощью реохордного моста P38 с кондуктометрическим датчиком (платинированные электроды) на переменном токе частотой 50 гц при постоянной температуре. Измерения проводили через 2, 4, 6 и 24 часа в 3-кратной повторности. Степень морозостойкости оценивали в виде коэффициента, выражаемого отношением электрического сопротивления исходной вытяжки (r.) через определенное время (в стандартном случае - 24 часа) к сопротивлению фиксированных кипячением этих же образцов (Гф).
Для экстракции тотальных белков из побегов березы применяли метод Сарнигхау-зена. Образцы измельчали в порошок. 300 мг порошка гомогенизировали в 3 мл экстракционного раствора (62,5 мМ трис-HCl, pH 6,8, 2 % додецилсульфат-Na, 5 % 2-меркаптоэта-нол, 1 мМ PMSF) и кипятили 5 мин. После охлаждения экстракты центрифугировали при 11000 g н. Тотальные белки осаждали 5 объемами ацетона в течение ночи (-20 °С). Белковое содержание было определено с помощью сканирования нанесенных на PVDF-мембрану и окрашенных Кумасси R-250 белков [5]. Для определения молекулярных масс индивидуальных полипептидов и их количественных соотношений был выполнен гель-электрофорез в 12,5 % ПААГ в присутствии додецил-сульфата-Na с последующим окрашиванием Кумасси R-250. В результатах приведены средние арифметические величины и их ошибки.
Динамика выхода электролитов по изменению электрического сопротивления вытяжек растений может быть представлена степенной (аллометрической) функцией: y=Ax-k (R = 0,90-0,99), где y. - показатель электрического сопротивления вытяжки в момент измерения х , А - константа начального сопротивления вытяжки, к - константа аллометрии (рис. 1).
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 2/2009
13
ЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВО
А Оп тическая плотность, отн. ед. Б
4321043210432104321043210
I V VI IX XI I V VI IX XI
Рис. 3. Тотальные белки однолетних побегов B. platyphylla (показаны типовые месяцы 2007 г. по белковым спектрам). А - гель окрашен Кумасси; Б - денситограммы электрофоретических спектров полипептидов: I - январь, V - май, VI - июнь, IX - сентябрь, XI - ноябрь. В каждую лунку вносили 30 мкг белков. Слева приведены молекулярные массы белков-маркеров, кД; в центре - белков, ассоциированных с перезимовкой
Параметр А за время наблюдений по абсолютному значению варьировал от 43,2 до 89,9 кОм-см, к - от 0,18 до 0,34. После фиксации побегов кипячением удельное электрическое сопротивление водных вытяжек падало до уровня 7,8-18,0 кОм-см в зависимости от сезона года. Сравнение динамики выхода электролитов может дать предварительную оценку устойчивости растений в тот или иной период, но оно менее информативно, чем использование показателя относительного сопротивления, принятого нами за коэффициент морозостойкости.
Как и следовало ожидать, наибольшие значения коэффициента морозостойкости отмечались в зимние месяцы, наименьшие - летом (рис. 2).
Этот показатель для B. platyphylla изменялся в пределах 0,39 (начало августа) - 0,61 (середина января). Годовой ход коэффициента морозостойкости описывается асимметричной колоколообразной кривой с относительно быстрым подъемом с конца лета к середине зимы и постепенным спадом к началу вегетации. Такое уменьшение коэф-
фициента морозостойкости связано с повышением температуры воздуха от -47 °С в декабре-январе до +32 °С в начале июля 2007 г. Наблюдается сильная обратная корреляция (R = -0,71) между морозостойкостью и температурой воздуха (особенно минимальной ночной).
Следует отметить, что побеги березы, взятые в середине зимы (январь-февраль) и находящиеся в состоянии вынужденного покоя, в условиях прогревания (t = 25 °С) уже через 8-12 суток развертывали листья. В результате деакклимации у них было отмечено снижение коэффициента морозостойкости в 1,5-2,0 раза по сравнению с контролем.
Проведенное нами ранее изучение видов и сортов черной смородины и некоторых других плодово-ягодных культур в условиях Якутии также показало, что в зимний период происходит резкое снижение уровня выхода электролитов у адаптированных образцов растений [2]. Причем, наблюдалась хорошая корреляция с прямым определением морозостойкости сортов по степени обмерзания побегов. Таким образом, метод электролитов
14
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 2/2009
ЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВО
позволяет достаточно точно фиксировать картину физиологического состояния растений. Он отражает установившийся баланс между коллоидами, включая полипептиды, ионной и водной средой в клетках в зависимости от конкретных условий роста и развития.
Полученные нами электрофизиологические данные по степени морозостойкости изучаемых растений существенно дополняются показателями сезонных изменений качественного и количественного состава тотальных белков побегов березы (рис. 3).
В летний период отмечается значительное преобладание средне- и высокомолекулярных полипептидов с молекулярными массами 31, 36, 51, 73, 82 кД, которые, вероятно, связаны с ростом и развитием растений. Зимой, наоборот, в белковом спектре доминируют низко- и среднемолекулярные полипептиды. Они появляются в конце вегетационного периода, достигают максимума в ходе осенней адаптации растений (к концу сентября) и удерживаются на относительно постоянном уровне в течение всех месяцев с устойчивой отрицательной температурой. К ним относятся мажорные белки с молекулярными массами 17, 27, 38, 50 кД и также минорные - 13, 42, 64 кД. В период возобновления роста побегов (май) содержание этих полипептидов резко снижается при одновременном возрастании количества средне- и высокомолекулярных белков.
Идентифицированный нами в побегах березы 27 кД полипептид близок по молекулярной массе к таковой WAP 27, относящегося к группе III LEA белков, найденных в клетках кортикальной паренхимы шелковицы Morus bombycis (Хоккайдо, Япония) [8]. WAP 27, обладающий криопротекторной активностью, появляется в середине октября, достигает максимального уровня в середине зимы и затем постепенно исчезает. Другой близкий по молекулярной массе доминантный дегидрин с молекулярной массой 24 кД обнаружен у растений кизила Cornus sericea (США) и связан с клеточными стенками ксилемы. Он накапливается с конца августа, достигает пика содержания в середине зимы, уменьшается весной и исчезает в начале лета. Так же как и вышеназванные белки, 27 кД по-
липептид побегов березы накапливается осенью, стабильно присутствует в зимние месяцы и пропадает в мае.
Следующий заслуживающий внимания мажорный 17 кД-полипептид березы имеет молекулярную массу, близкую к таковой WAP18 из клеток кортикальной паренхимы шелковицы [8]. WAP18 проявляет криопротекторную активность in vitro, установлена его высокая гомология с PR-10/Bet v1. Его содержание увеличивается с сентября по декабрь и затем постепенно падает до июня. Идентифицированный нами полипептид с молекулярной массой 17 кД также обнаруживается в значительных количествах в осенне-зимний период, в мае он практически отсутствует.
В побегах якутской популяции березы плосколистной также найдены 38 и 50 кД-по-липептиды, которые, насколько нам известно, не имеют аналогов, близких по своей молекулярной массе, среди белков, участвующих в формировании адаптационного ответа на холодовое воздействие у деревьев умеренной зоны. Их синтез начинается в августе, в осенне-зимний период они содержатся в достаточных количествах, в мае они практически исчезают. Минорные белки, связанные с перезимовкой, представлены полипептидами с молекулярной массами 13, 42 и 64 кД. Наши опыты по деакклимации растений (зимние побеги, проращиваемые в тепле) также показали характерные изменения в составе тотальных белков, схожие с естественным весенним пробуждением.
Вероятно, что обнаруженные нами в побегах B. platyphylla мажорные и минорные белки, которые можно условно отнести к белкам, участвующим в формировании уникальной морозостойкости деревьев Якутии, после проведения иммунохимических исследований могут разделиться на два класса: уже известных полипептидов, например группы LEA-белков, и еще не идентифицированных пока полипептидов.
Накопление осенью и поддержание на относительно постоянном уровне зимой ряда мажорных полипептидов с молекулярными массами 17, 27, 38, 50 кД и минорных полипептидов с молекулярными массами 13, 42 и 64 кД
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 2/2009
15
