CC BY
8УДК 619:616.98:578.835.2:615.371:515-078 Кременчугская С.Р., 1уленкин В.М.
(Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных»)
СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПРОТИВОЯЩУРНОГО ИММУНИТЕТА У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПОСЛЕ ИММУНИЗАЦИИ ВАКЦИНАМИ С РАЗЛИЧНЫМИ АДЪЮВАНТАМИ
Ключевые слова: профилактическая вакцинация, иммунитет, иммунизация, телята, крупный рогатый скот
Введение
Важная роль в борьбе с ящуром отводится профилактической вакцинации, обеспечивающей иммунитет в популяции восприимчивых животных. Наиболее часто для вакцинации используются сорбированные гидроокисьалюминиевые и эмульсионные вакцины. Существенным недостатком противоящурных сорбированных вакцин является индукция непродолжительного иммунитета и в связи с этим необходимость повторного введения препарата. Эмульсионные вакцины обеспечивают постепенное поступление антигена в организм животного, тем самым создавая более длительную защиту (5, 4, 2). Динамику накопления титров антител после применения сорбированных и эмульсионных вакцин изучают в РН и ИФА (3, 1).
Целью нашей работы являлась оценка антигенной активности вакцин на основе различных адъювантов по титрам антител в сыворотках крови иммунизированного крупного рогатого скота (КРС) в реакции микронейтрализации (РМН).
Материалы и методы
Вакцины. Для иммунизации животных применяли культуральные инактивиро-ванные моновалентные вакцины из штамма вируса ящура А/Киргизия/07 с различными адъювантами.
Сорбированная и сорбированная универсальная вакцины на основе двух адъю-вантов - гидроокиси алюминия и сапонина содержали по 6 мкг и 30 мкг иммунизирующего компонента в прививной дозе соответственно.
Эмульсионные вакцины с типами эмульсий вода-масло и вода-масло-вода на основе адъювантов Montanide ISA 70 и Montanide ISA 206 соответственно содержали по 6 мкг иммунизирующего компонента в прививной дозе.
Животные. В опытах были использованы 17 голов молодняка КРС, доставленные в ФГУ «ВНИИЗЖ» из буферной зоны РФ, где проводится систематическая профилактическая вакцинация против ящура, а также 20 голов взрослого КРС не вакцинированного против ящура. Для проведения экспериментов обе партии животных были разделены на 4 группы по 4 - 5 голов в каждой.
Вакцинация и контрольное заражение. Взрослых животных и молодняк каждой из 4 групп иммунизировали против ящура вакцинами из штамма А/Киргизия/07:
1-ая группа - вакцина сорбированная;
2-ая группа - вакцина сорбированная универсальная;
3-ья группа - вакцина эмульсионная (адъювант Montanide ISA 70);
4-ая группа - вакцина эмульсионная (адъювант Montanide ISA 206).
Через 28 суток после иммунизации молодняка и 91 сутки после иммунизации взрослых животных проводили контрольное заражение путем интрадермалинг-вального ведения афтозного вируса ящура КРС А/Турция/06 в дозе 104 ИД50/0,1 мл. Результаты контрольного заражения учитывали через 7 суток.
Сбор образцов. От животных после вакцинации еженедельно отбирали образцы крови. Для получения сыворотки крови образцы выдерживали в термостате при температуре 370С в течение 1 ч и оставляли на 16-18 ч в холодильнике при температуре 40С. Сыворотку крови отделяли от сгустка центрифугированием при 1000 об/ ми в течение 15 мин. Полученные образцы сыворотки крови хранили при температуре минус 200С до использования.
Серологические исследования. Титры вируснейтрализующих антител в образцах сывороток крови КРС определяли в реак-
ции микронейтрализации (РМН) в 96-лу-ночных культуральных планшетах фирмы "Costar" против 100 ТЦД50 вируса ящура типа А/Киргизия/07. Конечную точку титра антител рассчитывали как конечное разведение сыворотки, нейтрализующее 100 ТЦД50 гомологичного вируса в 50% лунок.
Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы «STATISTICA 6». Оценку уровня значимости (величина р) различия средних титров антител оценивали по t - критерию (распределение Стьюдента) для двух независимых выборок в случае их нормального распределения и по непараметрическому критерию (U-критерию Манна-Уит-ни), когда распределение отличалось от нормального. В случае получения уровня значимости р>0,05 (вероятности ошибочно отклонить нулевую гипотезу Н0: |2=|2 - генеральные средние в первой и второй выборке равны между собой или «отсутствие различия средних двух выборок»), средние значения выборок считали достоверно неразличимыми, а при р<0,05 - достоверно различимыми (нулевая гипотеза отвергается) при доверительной вероятности Р=0,95.
Результаты исследований
Изучение иммунного ответа на вакцинацию у телят. Из суммированных в табл. 1 результатов следует, что средний титр антител в РМН в сыворотке крови телят через 21 - 28 суток после иммунизации эмульсионной вакциной с адъювантом Montanide ISA 70 составлял 1:896 и превышал средние титры антител у животных, иммунизированных вакцинами на основе других адъювантов в 3,5 - 5,9 раза.
Результаты сравнительного анализа динамики накопления уровня противоя-щурных антител в крови вакцинированных телят в РМН представлены в табл. 2. Показано, что на 21 - 28 сутки имеется существенная достоверность различия средних титров антител после иммунизации животных вакциной на основе масляного адъю-ванта Montanide ISA 70 по сравнению с титрами антител, полученными на введение сорбированной, сорбированной универсальной и вакцины на основе масляного адъюванта Montanide ISA 206.
Следует отметить, что динамика накопления противоящурных антител в крови телят через 7 и 14 суток после иммунизации существенно не отличалась в зависимости от типа вводимой вакцины. Кроме того, за
период наблюдения не выявлены различия в титрах антител в сыворотках крови животных при иммунизации сорбированной, сорбированной универсальной вакцинами и эмульсионной вакциной на основе адъ-юванта Montanide ISA 206. Также не установлено существенного различия в титрах антител при использовании для иммунизации телят сорбированной универсальной вакцины и эмульсионной вакцины на основе адъюванта Montanide ISA 206.
Изучение иммунного ответа на вакцинацию у взрослого КРС. Представленные в табл. 3 и 4 результаты указывают на тот факт, что, начиная с 14 суток после иммунизации взрослого КРС, эмульсионная вакцина на основе масляного адъюван-та Montanide ISA 70 вызывает образование антител в наиболее высоких титрах по сравнению с другими вакцинами. При этом средние титры антител в РМН, начиная с 21 суток после вакцинации, достоверно отличаются от титров антител, полученных при использовании сорбированной вакцины, а с 35 суток - сорбированной универсальной вакцины. Исключением являются титры антител у животных на 35 - 42 сутки после применения эмульсионной вакцины на основе адъюванта Montanide ISA 70 по отношению к таковым после иммунизации эмульсионной вакциной на основе адъ-юванта Montanide ISA 206.
В группе из 5 животных, иммунизированных эмульсионной вакциной на основе масляного адъюванта Montanide ISA 70, одна голова КРС с инвентарным № 8747 не выдержала контрольного заражения. В сыворотке крови этого животного было отмечено снижение титра антител с 1:512 на 63 сутки после вакцинации до 1:32 при контрольном заражении на 91 сутки.
Эмульсионная вакцина на основе адъ-юванта Montanide ISA 206, начиная с 35 суток после иммунизации КРС, показала более высокие результаты по накоплению антител в сыворотке крови по сравнению с сорбированной и сорбированной универсальной вакцинами. При этом все животные этой группы были устойчивы к ящурной инфекции.
Существенного различия в титрах антител при использовании сорбированной и сорбированной универсальной вакцин не было выявлено. Однако при контрольном заражении вирусом ящура А/Турция/06 в группе КРС, иммунизированных сорбированной вакциной, только одно животное с инвентарным № 8806 противостояло генерализованной форме инфекции, что кор-
Таблица 2
Оценка статистической достоверности различия уровня антител в РМН после иммунизации телят вакцинами из штамма вируса ящура А/Киргизия/07 на основе
различных адъювантов
Таблица 1
Уровень титров антител в РМН в крови телят, иммунизированных вакцинами из штамма вируса ящура А/Киргизия/07
Титр антител в РМН (обратная величина разведений),
№ животных сутки после вакцинации
Тип вакцины (телята) 7 14 21 - 28
4718 32 128 192/ 96
4720 24 128 512/ 128
4746 32 128 384/ 96
4752 64 64 512/ 96
Сорбированная M±m 38,0±8,9 112,0±16,0 252,0±66,1
4768 48 128 384/256
4769 16 96 1024/ 768
4778 48 192 1536
Эмульсионная 4780 24 64 768/1024
Montanide ISA 70 M±m 34,0±8,2 120,0±27,3 896,0±191,5
4783 96 96 48/ 48
4785 48 128 384/ 64
4789 16 128 64
Эмульсионная 4792 32 128 256/384
Montanide ISA 206 M±m 48,0±17,3 120,0±8,0 178,3±59,9
4793 48 64 256/ 96
4964 48 128 384/ 256
4966 48 96 48/ 64
4967 32 48 24/192
Сорбированная 4968 32 96 128/ 64
универсальная M±m 41,6±3,9 86,4±13,9 151,2±37,0
Сравниваемые вакцины Значения величины р, сутки после вакцинации
7 14 21-28
Сорбированная и эмульсионная Montanide ISA 70 >0,75 >0,80 <0,006
Сорбированная и эмульсионная Montanide ISA 206 >0,62 >0,67 >0,42
Сорбированная и сорбированная универсальная >0,70 >0,26 >0,18
Эмульсионная Montanide ISA 70 и эмульсионная Montanide ISA 206 >0,49 1,0 <0,004
Эмульсионная Montanide ISA 70 и сорбированная универсальная >0,40 >0,28 <0,0004
Эмульсионная Montanide ISA 206 и сорбированная универсальная >0,69 >0,09 >0,69
Примечание: при р>0,05 - средние значения титров антител достоверно неразличимы;
при р<0,05 - средние значения титров антител достоверно различимы
релирует с результатами серологических исследований в РМН: Титры антител в сыворотке крови этого животного с 28 суток по 91 сутки были максимальными по сравнению с титрами антител животных данной группы. Тогда как в группе КРС, которому вводили сорбированную универсальную вакцину, только у одного животного с
инвентарным № 8804 были выявлены признаки генерализации после контрольного заражения. Титры антител в сыворотке крови этого животного с 7 по 21 сутки и с 49 по 91 сутки после вакцинации были ниже средних титров антител у животных этой группы и в момент контрольного заражения составили 1:64.
Таблица 3
Уровень титров антител в РМН в крови взрослого КРС, иммунизированного вакцинами из штамма вируса ящура А/Киргизия/07
Тип вакцины № животных (бычки) Титр антител в РМН (обратная величина разведений), сутки после вакцинации
7 14 21 -28 35-42 49-56 63-70 77 - 91
Сорбированная 8765 н/и 96 128/48 64/64 96/32 96/32 64/128/48
8769 16 128 256/64 96/64 48/64 128/48 64/128/64
8806 32 128 256/256 192/96 128/192 128/128 128/512/512
8807 24 64 128/32 48/64 32/64 128/64 48/96/96
8808 32 96 192/64 256/64 64/64 96/48 64/96/64
М±т 26,0±3,8 102,4±12,0 142,4±28,9 100,8±21,6 78,4±15,5 89,6±12,2 132,8±43,2
Эмульсионная Montanide ISA 70 8742 48 192 2048/1024 256/768 1024/512 1536/1536 512/1536/3072
8744 16 64 512/128 198/192 512/512 768/768 н/и
8747 16 64 96/128 256/96 64/384 512/48 32/48/32
8748 16 192 1536/384 384/192 256/768 768/512 1024/1536/2048
8749 24 128 192/64 64/128 384/768 1536/768 1024/1536/1024
М±т 24,0±6,2 128,0±28,7 611,2±220,1 253,4±64,0 518,4±87,7 875,2±160,0 906,0±226,5
Эмульсионная Montanide ISA 206 8775 16 96 64/96 256/768 512/256 768/256 512/512/512
8776 32 96 512/128 256/384 384/512 512/256 512/768/1536
8779 48 128 64/198 768/256 384/256 768/128 512/128/1024
8780 24 128 128/128 256/128 96/256 192/96 768/768/192
8781 16 16 16/16 32/16 48/32 24/48 64/192/192
М±т 27,2±6,0 92,8±20,6 135,0±45,5 312,0±83,9 273,6±55,8 304,8±88,8 473,6±83,8
Сорбированная универсальная 8801 16 96 256/128 128/32 96/128 192/64 96/192/192
8802 96 192 512/96 192/64 192/192 256/64 192/512/384
8803 24 128 256/192 96/96 128/128 192/64 192/256/48
8804 16 64 128/192 96/96 64/64 64/64 48/64/48
8805 32 128 256/128 128/32 48/64 64/24 64/128/128
М±т 36,8±15,1 121,6±21,3 214,4±38,2 96,0±15,1 110,4±16,6 104,8±24,6 169,6±34,4
Таблица 4
Оценка статистической достоверности различия уровня антител в РМН после иммунизации взрослого КРС вакцинами из штамма вируса ящура А/Киргизия/07 на основе различных адъювантов
Сравниваемые Значения величины р, сутки после вакцинации
Вакцины 7 14 21-28 35-42 49-56 63-70 77-91
Сорбированная и >0,80 >0,43 <0,05 <0,04 <0,00011 <0,00012 <0,002
эмульсионная Montanide ISA 70
Сорбированная и >0,87 >0,69 >0,89 <0,03 <0,0034 <0,028 <0,002
эмульсионная Montanide ISA 206
Сорбированная и >0,55 >0,45 >0,14 >0,085 >0,17 >0,058 >0,50
сорбированная
универсальная
Эмульсионная >0,71 >0,34 <0,05 >0,058 <0,031 <0,006 >0,06
Montanide ISA 70 и
эмульсионная Montanide ISA 206
Эмульсионная >0,45 >0,86 >0,09 <0,03 <0,00024 <0,0002 <0,0003
Montanide ISA 70 и
сорбированная
универсальная
Эмульсионная >0,57 >0,35 >0,19 <0,021 <0,012 <0,044 <0,001
Montanide ISA 206
и сорбированная
универсальная
Примечание: при р>0,05 - средние значения титров антител достоверно неразличимы;
при р<0,05 - средние значения титров антител достоверно различимы
В тоже время не совсем стабильна динамика отличия титров антител при иммунизации КРС эмульсионными вакцинами на основе адъювантов Montanide ISA 70 и Montanide ISA 206, что требует более детальных повторных испытаний с использованием большего числа животных.
Выводы
1. Через 7 - 14 суток после иммунизации КРС моновалентными инактивированны-ми вакцинами из штамма вируса ящура А/ Киргизия/07 с разными адъювантами достоверных различий в титрах антител в РМН не установлено.
2. Титры антител в сыворотках крови телят в РМН, начиная с 21 - 28 суток после иммунизации моновалентной инактивиро-ванной эмульсионной вакциной из штамма
вируса ящура типа А/Киргизия/07 на основе адъюванта Montanide ISA 70, статистически достоверно превышают титры антител, полученные на введение сорбированной, сорбированной универсальной вакцин и эмульсионной вакцины с масляным адъ-ювантом Montanide ISA 206.
3. Титры антител в сыворотках крови взрослого КРС в РМН, иммунизированного противоящурной моновалентной инак-тивированной эмульсионной вакциной на основе адъюванта Montanide ISA 70, с 21 суток после иммунизации статистически достоверно превышают титры антител, полученные на введение сорбированной вакцины, а с 35 суток - сорбированной универсальной вакцины.
Резюме: В статье представлены результаты оценки в реакции микронейтрализации (РМН) антигенной активности культуральных инактивированных моновалентных вакцин из штамма вируса ящура типа А/Киргизия/07. Установлено, что при иммунизации телят и взрослого крупного рогатого скота эмульсионной вакциной на основе масляного адъюванта Montanide ISA 70 титры антител статистически достоверно выше, чем при использовании вакцин с другими адъю-вантами.
SUMMARY
Results of evaluation of antigenic activity of cultural inactivated monovalent vaccines based on FMD virus strain of type A/Kirghizia/07 are presented. It was established that antibody titer was significantly higher when calves and adult cattle were immunized with emulsion vaccine based on oil adjuvant Montanide ISA 70 than if vaccines with other adjuvants were used.
Keywords: preventive vaccination, immunity, immunization, calves, cattle
Литература
1. Дудников А.И., Борисов В.В., Дудников С.А. Противоящурный иммунитет и практические достижения в области противоящурной защиты // Пробл. зоошженери та вет. Медицини: зб. наук. прац. - Харьыв, 2007. - Вип.15(40). - Ч.2, - т.1. - С. 116-120.
2. Михалишин В.В., Мамков Н.С. Адъюванты и их использование // Тр. Федерального центра охраны здоровья ж-ных. - Владимир, 2008. - Т.6. - С. 340-371.
3. Early antibody responses of cattle for foot-and-mouth disease quadrivalent double oil emulsion vaccine
/ PK. Patil, J. Bayry, S.P Nair [et al.] // J. Vet. Microbiol.
- 2002 - Vol. 87.- P 103-109
4. Evaluation of different adjuvants for foot-and-mouth disease vaccine containing all the SAT serotypes / M. Cloete, B. Dungu, L.I. Van Staden [et al] // J Vet Res.
- 2008. - Vol. 75, N 1. - P 17-31
5. Hunter P. Vaccination as a means of control of foot-and-mouth disease in sub-saharan Africa // Vaccine.
- 1998. - Vol. 16, N 2-3. - P 261-264.
Контактная информации об авторах для переписки Кременчугская Светлана Ревдитовна,ведущий научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение» Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), 600900 г. Владимир, мкр. Юрьевец, Институтский городок, 32, кв.41, д.т. 8 (4922) 26-36-64; м.т. 89107745875; e-mail: kremenchugskaya@arriah.ru
Гуленкин В.М., ведущий научный сотрудник, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение» Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)
УДК 619:572:636.22/.28
Криворучко С.В., Абакин С.С., Дубравная Г.А.
(ГНУ Ставропольского НИИ животноводства и кормопроизводства)
ВИРУС ИММУНОДЕФИЦИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В ХОЗЯЙСТВАХ СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ
Ключевые слова: вирус иммунодефицита крупного рогатого скота (ВИКРС), ретровирусы, реакция иммуно-диффузии (РИД), полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Болезни крупного рогатого скота -важнейшая область ветеринарной науки. Большое внимание привлекала роль ре-тровирусов в патологии КРС. Еще в начале 70-х гг. был открыт ретровирусный возбудитель лейкоза коров (вирус бычьего лейкоза, BLV). В настоящее время этот ретровирус относят к роду дельтаретрови-русов (в этой же группе находится и вирус человека ВТЛЧ). Примерно в тоже время был выделен еще один вирус КРС, роль которого в патологии окончательно не ясна до сих пор. В конце 80-х - начале 90-х гг. он был идентифицирован, как лентивирус, родственный ВИЧ и обозначен как вирус бычьего иммунодефицита (ВБИ) или вирус иммунодефицита крупного рогатого скота (ВИКРС).
Впервые ВБИ был выделен из крови коровы с повышенным лимфоцитозом, прогрессирующей слабостью и истощением. При экспериментальном заражении телят у них появлялись противовирусные антитела, и развивалась гиперплазия лимфатических узлов (Flaming K.,Van der Maaten et al 1993).
Имеются только отдельные сообщения о выявлении ВБИ на территории Российской Федерации, что не позволяет сделать объективные выводы о степени его распространения в популяции крупного рогатого скота (Колотвин В.В. и др. 2006, Федоров Ю.Н., Верховский А.О., 1996). Получение информации о циркуляции вирусов в популяциях домашних животных является достаточно важным для обеспече-
