CC BY
179
УДК 616-006-036.3.6-008:612.122.2
Куликов1А.В., Е.А. Слободкина1, В.Г. Гогвадзе1;2, Б.Д. Животовский1;2 СЕРДЕЧНЫЕ ГЛИКОЗИДЫ В ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ТЕРАПИИ
1 Факультет Фундаментальной Медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия; 2Институт Медицины Окружающей Среды, Каролинский Институт, Стокгольм, 17177, Швеция
Контактная информация:
А.В. Куликов, Факультет Фундаментальной Медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия e.mail: avkulikov@inbox.ru
Статья поступила 23.12.2015, принята к печати 14.06.2016. Абстракт
Сердечные гликозиды - вещества природного происхождения, которые по механизму действия являются ингибиторами №/К+-АТФазы. В течение длительного времени СГ применяются при лечении сердечной недостаточности и некоторых форм сердечных аритмий. Ретроспективные исследования свидетельствуют, что прием СГ может снижать риск развития рака, а данные in vitro показали, что эти соединения могут убивать опухолевые клетки и в перспективе найти применение в качестве противоопухолевых средств. Особый интерес представляет использование СГ в сочетании со стандартными противоопухолевыми препаратами с целью возникновения синергетического эффекта, а также преодоления резистентности. В настоящее время ряд СГ прошли клинические испытания фазы I и проходят испытания фазы II, что позволит в обозримом будущем сделать вывод об их терапевтической противоопухолевой эффективности. Нами проанализированы и обобщены последние данные, касающиеся различных аспектов противораковой действия сердечных гликозидов, а также целесообразности их применения при лечении опухолей.
Ключевые слова: сердечные гликозиды, рак, терапия, апоптоз.
Kulikov A.V., E.A. Slobodkina, V.G. Gogvadze, B.D. Zhivotovsky CARDIAC GLYCOSIDES IN ANTICANCER THERAPY
Abstract
Cardiac glycosides - substances of natural origin, which the mechanism of action are inhibitors of Na+/K+ -ATPase. The CG for a long time are used to treat non-cardiac sufficiency and some forms of cardiac arrhythmias. Retrospective studies suggest that taking the CG may reduce the risk of cancer, and in vitro data have shown that these compounds can kill EPP-cholic cells, and potentially find use as anti-tumor agents. Of particular interest is the use of the SG in combination with standard anti-cancer drugs to the WHO-penetration synergies and overcome resistance. Currently, a number of pro-CG were clinical trials of phase I and phase are tested II, which will allow for the foreseeable future, to conclude that their therapeutic anti-tumor efficacy. We have analyzed and summarized in a recent data on various aspects of anti-cancer action of cardiac glycosides, as well as the appropriateness of their use in the treatment of tumors.
Key words: cardiac glycosides, cancer therapy, apoptosis.
Строение сердечных гликозидов и действие на Ыа+/К+-АТФазу Сердечные гликозиды, также известные как кар-диотонические стероиды, являются природными соединениями, добываемыми из растений типа наперстянки -дигиталиса (Digitalis purpurea), и уже более 200 лет используются для терапии сердечной недостаточности [1]. Наиболее известными представителями СГ являются дигоксин и дигитоксин, производные дигиталиса, уаба-ин из растения Strophanthus gratus, олеандрин из Nerium oleander, а также буфалин, получаемый из жаб рода Bufo. По химической структуре сердечные гликозиды представляют собой сложные соединения, состоящие из агликона - стероидного ядра, лактонного фрагмента в положении С-17 и гликона (сахаристой части) в положении С-3 [2]. Их можно разделить на две группы: кар-денолиды, имеющие 5-членное лактоновое кольцо, и буфадиенолиды, характеризующиеся 6-членным ненасыщенным лактоновым (лактон-2-пирон) кольцом (рис.
1). К карденолидам относятся дигоксин, дигитоксин, дигитоксигенин, олеандрин и уабаин, а к буфадиеноли-дам буфалин, маринобуфагенин, просцилларидин А. Молекулярной мишенью СГ является №/К+-АТФаза -трансмембранный фермент, который осуществляет энергозависимый антипорт ионов №+ из клетки и ионов К+ внутрь клетки через плазматическую мембрану. В каждом цикле работы натриевый насос «выкачивает» из клетки три иона натрия, в обмен на поступление двух ионов калия, при этом расщепляется одна молекула АТФ. Таким образом, основная роль №+/К+-АТФазы -поддержание клеточного ионного баланса, высокой внутриклеточной концентрации К+ и низкой концентрации [3]. №+/К+-АТФаза формирует в липидном бис-лое мембраны олигомерные ансамбли и структурно является гетеромерным белком, состоящим из каталитической а-субъединицы и регуляторной р-субъединицы, которые необходимы для правильной посттрансляционной сборки фермента [4].
Дигитоксин
Рис. 1. Химическая структура некоторых сердечных гликозидов.
К настоящему моменту известно о четырех изоформах а-субъединицы и трех - р-субъединицы. Экспрессия субъединиц в тканях неоднородна. Так, комплекс а1р1 присутствует повсеместно, тогда как другие виды изоформ имеют тканеспецифическую экспрессию. Например, субъединица а2 наиболее сильно представлена в кардиомиоцитах и гладких мышцах сосудов, в скелетных мышцах, мозге, адипо-цитах. Субъединица а3 в основном экспрессируется в возбудимых клетках - нейронах центральной и периферической нервной системы и важна для нервно-мышечной передачи.
Субъединица а4 экспрессируется в тестику-лярных клетках [5]. Сердечные гликозиды ингибиру-ют активность №/К+-АТФазы, связываясь с каталитической а-субъединицей, а многочисленные комбинации ар-комплексов обладают различными характеристиками, в том числе различной чувствительностью к сердечным гликозидам [6].
Увеличение внутриклеточной концентрации вследствие действия гликозидов приводит к активации работы №+/И+- и №/Са-обменников, к изменению цитоплазматического рН и уровня внутриклеточного кальция [7]. Именно на этом механизме основан положительный инотропный эффект СГ на сердечную мышцу.
Ионы кальция могут принимать участие в регуляции программируемой клеточной гибели [8], а от работы №/К+-АТФазы также зависят процессы "вторичного транспорта": в частности, зависимого от переноса глюкозы и аминокислот.
№/К+-АТФаза является не только ионным насосом, но и метаботропным рецептором, воздействующим на внутриклеточные сигнальные [9] системы (рис. 2).
Рис. 2. Молекулярные механизмы действия СГ на опухолевые клетки.
Связывание СГ с №+/К+-АТФазой может активировать киназные каскады, участвующие в пролиферации клеток, например тирозиновую проте-инкиназу 8гс. Белок 8гс в свою очередь активирует рецептор эпидермального фактора роста, что приводит к стимулированию сигнальных путей с участием киназы Егк1/2 (МАРК), фосфолипазы С-у, протеинкиназы С и других посредников. Активация сигнального пути с участием 8гс/ЕвРК и Егк1/2 показана на модели выделенных кардиомиоцитов, при этом важная роль в передаче сигнала отводится активным формам кислорода [10]. В кардиомиоци-тах активация такого сигнального каскада приводит к индукции транскрипционных факторов АР-1 и №-кВ, запуску транскрипции генов, связанных с пролиферацией, стимуляцией синтеза белка и гипертрофией миокарда [11]. При открытии сигнального действия №/К+-АТФазы высказано предположение о существовании двух пулов фермента -один пул классической, менее чувствительной к уабаину ион-транспортной №/К+-АТФазы и второй, метаботропный пул, более чувствительный к уабаину, расположенный в кавеолах плазматической мембраны и образующий кластеры с другими мембранными белками, например с ЕвРЯ [12]. Однако недавно выяснилось, что кавеолярный фермент сохраняет ион-транспортные функции, а сигнальные функции не ограничиваются данным ферментом [13]. Таким образом, №+/К+-АТФаза может как осуществлять активный транспорт ионов натрия и калия, так и образовывать сигналосому, т.е. молекулярный комплекс белков для передачи информации и воздействовать на процессы роста и выживаемости клеток.
В 1953 г. А^епЮуо^! предположил, что у используемых лекарственных производных дигиталиса существует естественный эндогенный аналог, участвующий в регуляции сердечной сократимости [14]. Впоследствии показано, что, действительно, уабаин и другие СГ продуцируются у чело-
века эндогенно и циркулируют в плазме крови в небольших концентрациях, что предполагает их гормоноподобные функции [15; 16]. Источниками эндогенных сердечных гликозидов являются кора надпочечников и гипоталамус, а АКТГ, ангиотен-зин II и вазопрессин могут способствовать их эндогенной продукции [17; 18]. В организме низкий эндогенный уровень уабаина не приводит к значительному сдвигу ионного баланса, но достаточен для активации сигнальных процессов через Na/K+-АТФазу, в которых важную роль вторичного посредника играют ионы кальция. Эндогенный уаба-ин важен для поддержания тонуса сердечной мышцы и регуляции работы почек. Показано, что уаба-ин и дигоксин могут снижать уровень паратирео-идного гормона [19]. Нарушения системы СГ являются причиной некоторых форм гипертензии, сердечной недостаточности, тиреоидной и адрено-кортикальной дисфункции и сахарного диабета [20]. Уровень эндогенного уабаина может использоваться как клинический биомаркер повреждений почек, что важно для предсказания осложнений при серьезных операциях на сердце [21].
В медицинской практике применение нашли дигоксин и дигитоксин, которые используются при лечении сердечной недостаточности (cardiac congestion) и некоторых видах сердечных аритмий, например, при атриальной фибрилляции. Однако, несмотря на более чем 200-летнюю историю медицинского применения, эффективность и безопасность этих соединений остается предметом споров и объектом новых биомедицинских исследований. СГ являются токсичными соединениями и имеют достаточно узкое «терапевтическое окно».
Частыми побочными эффектами применения СГ являются нарушения сердечной деятельности (желудочковые экстрасистолии), гастроинтести-нальные (тошнота, рвота и диарея), офтальмологические (нарушения зрения) и неврологические (головная боль) нарушения.
СГ в противоопухолевой терапии
Основанием для начала исследований противоопухолевых свойств сердечных гликозидов стали клинические наблюдения за онкологическими больными, которые получали СГ при нарушениях работы сердечно-сосудистой системы. В 1960-х гг. появились первые данные о возможном противоопухолевом действии СГ [22], а два десятилетия спустя были представлены эпидемиологические данные, полученные при лечении сердечнососудистых заболеваний СГ у пациенток, страдающих раком молочной железы. Размер новообразования у этих больных был статистически ниже, а выделенные опухолевые клетки - меньше и более однородны по морфологии по сравнению с таковыми больных, не получавших гликозиды [23]. Кроме того, у принимающих препарат случаи рецидивов в течение 5 лет после мастэктомии наблюдались в 9,6 раза реже [24]. Еще одно ретроспективное исследование, выполненное на данных 175 больных РМЖ, показало, что прием дигиталиса,
назначенный для лечения сердечной недостаточности, значительно снижал уровень смертности по сравнению с таковой группы больных РМЖ, не получавших препарат, - с 34 % до 6 % [25]. Однако по другим данным СГ не снижают, а умеренно увеличивают риск инвазивного РМЖ у женщин в постменопаузе [26]. В 2001 году опубликованные результаты ретроспективного исследования данных более чем 9 000 случаев РМЖ показали корреляцию высокого уровня дигитоксина в плазме и пониженного риска лейкоза/лимфомы и рака моче-выделительной системы [27]. В работах in vitro подтверждается, что уабаин и дигитоксин ингиби-руют рост лейкозных клеток и опухолевых клеток (аденокарцинома почки) в концентрациях, обычных для пациентов, принимающих этот препарат при проблемах с сердцем [28].
За последние 15 лет было проведено множество исследований по изучению действия СГ на пролиферацию и гибель различных культур опухолевых клеток, а также на биопсийном материале больных. Показана цитотоксичность дигоксина и дигитоксина на клиническом материале больных при таких опухолевых заболеваниях, как множественная миелома, лимфомы, лейкозы, карцинома яичников и мелкоклеточный рак легких. Было обнаружено, что СГ вызывают гибель всех указанных типов опухолевых клеток, но в большей степени проявляют цитотоксичность по отношению к клеткам солидных опухолей [29].
СГ могут задерживать клеточный цикл в S или G2/M фазе, блокируя рост опухолевых клеток [30; 31]. Задержка клеточного цикла коррелирует с вызванным СГ повышением содержания АФК [32] и, например, в клетках РМЖ линии MDA-MB-435s, включает индукцию ингибитора клеточного цикла p21cip1 [33]. Кроме того, СГ влияют на миграцию опухолевых клеток и метастазирование. Так, уаба-ин в физиологических концентрациях препятствует миграции опухолевых клеток рака легких линии H292 вследствие ингибирования экспрессии белков, регулирующих клеточную миграцию FAK, Akt и Cdc42. Этот эффект также был связан с накоплением АФК. Антиоксиданты, N-ацетилцистеин и глутатион предотвращали опосредованную уабаи-ном блокаду клеточной миграции [34]. Способность СГ ингибировать метастазирование может быть связана с их ингибирующим влиянием на синтез N-гликанов, которые являются одной из причин канцерогенеза и метастазирования [35].
Гибель опухолевых клеток при действии уабаина показана на различных моделях: клетках множественной миеломы [36], КРР [37] карциномы простаты РС-3 [38], и гепатомы HepG2 [39] Дигоксин вызывал гибель андроген-независимых метастатических клеток аденокарциномы человека [40] а уабаин, дигоксин и буфадиенолид просциллари-дин А - гибель эстроген-независимых клеток РМЖ MDA-MB-231 и MCF-7. Препарат UNBS1450, химическое производное 2''-оксовушарина - кардено-лида из растения Calotropis procera - проявлял ци-тотоксическое действие на лейкозных клетках [41].
Компьютерный и высокопроизводительный скрининг библиотек химических соединений также показали, что СГ (дигоксин, уабаин и буфалин) могут быть потенциальными ингибиторами роста опухолевых клеток [36; 42].
Таким образом, в настоящее время СГ рассматриваются как возможные противоопухолевые агенты, а №+/К+-АТФаза может являться потенциальной мишенью для новых препаратов против рака [43; 44]. Обнаружено, что а1 субъединица №/К+-АТФазы высокоэкспрессирована в культурах опухолевых клеток рака простаты PC-3 и DU-145, клетках немелкоклеточного рака легких A549, глиобластомы Hs683, U373-MG, U87-MG, T98G, РМЖ MCF-7, и клетках карциномы печени HepG2 [43], [39]. В то же время, отмечено снижение экспрессии а1 субъединицы и усиление экспрессии а3 субъединицы в опухолевых клетках КРР [45]. Нокдаун субъединицы а1 с помощью siRNA в клетках A549 приводил к значительному снижению их миграции и пролиферации [46]. Уровень экспрессии а1-субъединиц №/К+-АТФазы может нарастать с тяжестью заболевания, например, при карциноме мочевого пузыря. Вероятность антипролифератив-ного действия СГ коррелирует с соотношением а3/а1 субъединиц, поэтому оценка экспрессии субъединиц №/К+-АТФазы может использоваться в качестве биомаркера для определения стадии заболевания и вероятного прогноза [44].
Возможные механизмы
противоопухолевого действия СГ
В последние годы обнаружено, что СГ могут вызывать апоптотическую гибель как по внутреннему (митохондриальному), так и по внешнему (рецепторному) пути (рис. 2). В клетках HeLa действие дигиталиса приводило к апоптозу по мито-хондриальному пути, что подтверждалось выходом цитохрома С из митохондрий, процессингом каспа-зы-9 и каспазы-3 [47]. В опухолевых клетках мочевого пузыря T24 буфалин вызывал активацию про-апоптотического белка Bax, выход цитохрома с, потерю митохондриального потенциала, активацию белка Apaf-1, каспаз-9, -3, и -7 [48] Карденолид UNBS1450 в наномолярных концентрациях вызывал апоптоз в лейкемических линиях клеток Jurkat, K562 и U937 при этом наблюдалась активация белков Bax и Bak и снижение активации транскрипционного фактора NF-kB [41].
СГ способны активировать внешний путь апоптоза. Так, карденолид олеандрина повышал чувствительность клеток Calu1, NCI-H520, SkLu1 и A549 к Apo2L/TRAIL (без олеандрина гибели клеток не происходило) за счет повышения экспрессии рецепторов смерти DR4 и DR5. Блокада этих рецепторов с помощью siRNA значительно снижала гибель клеток после совместного действия карде-нолида и TRAIL. Апоптоз в данном случае включал активацию каспаз-8, -7 и -3, расщепление каспаз-ных субстратов PARP и ламина А, но активации каспазы-9 не происходило, что свидетельствует о том, что митохондриальный путь апоптоза в этих
условиях не затрагивался [49]. В другой работе показана способность буфадиенолидов буфалина, буфоталина и гамабуфоталина значительно потенцировать гибель клеток в совместном действии с Apo2L/TRAIL на культурах РМЖ с различным статусом экспрессии эстрогенового рецептора. Данный эффект связан с ингибированием сигнального пути Mcl1/STAT3, поскольку гиперэкспрессия Mcl1 предотвращала стимуляцию гибели клеток при их совместном действии [50].
Помимо апоптоза СГ могут активировать гибель по типу аутофагии [51; 52]. Препарат UNBS1450 вызывает аутофагию в клетках немел-коклеточного рака легких [53] и клетках глиобла-стомы [54]. Основанный на проточной цитометрии скрининг библиотеки FDA из 1120 соединений выявил наиболее сильные активаторы аутофагии, среди которых оказались сердечные гликозиды дигоксин, строфантидин и дигоксигенин [55]. Способность СГ активировать аутофагию может быть использована для лечения форм рака, устойчивых к действию цитостатиков, индуцирующих апоптоз. Активация аутофагии СГ может послужить триггером для запуска клеточной гибели по типу апоптоза при действии других химиотерапевтических препаратов [56]. Гипотеза о том, что вид клеточной гибели зависит от типа используемого гликозида, не подтверждается. Например, олеандрин и буфалин активируют аутофагию в клетках КРР [32], но вызывают апоптоз в клетках лейкоза [57]. Можно предположить, что активация того или иного вида гибели зависит от уровня экспрессии субъединиц Na/K-АТФазы и их изоформного состава - соотношение субъединиц а и в может определять, какие внутриклеточные посредники будут при этом активироваться. Также тип гибели может определять специфический состав белков, регулирующих гибель клетки и характерный для конкретного вида опухолей. Надеемся, что в дальнейшем удастся выявить такие биомаркеры, по которым можно будет идентифицировать тип гибели и предсказывать действие СГ.
Молекулярные механизмы элиминации опухолевых клеток сердечными гликозидами связывают с изменением ионного гомеостаза Na+ и K+, ростом внутриклеточного уровня Са2+ и АФК, изменением внутриклеточного рН, воздействием на про-теинкиназы MAPK, JNK, ингибированием ДНК топоизомеразы II, ингибированием транскрипционных факторов NF-kB и HIF^. Например, активацию аутофагии олеандрином и буфалином в клетках КРР связывают с генерацией АФК и активацией JNK киназы [32], а в ситуации воздействия СГ на внешний путь апоптоза показано, что МАРК и NF-kB не участвуют в этих процессах [49].
Сигнальный путь NF-kB конститутивно активирован во многих видах опухолевых клеток. Блокада NF-kB [41], а также АР-1 и связанных с ними киназ [58], вызванная СГ, ведет к "аресту" клеточного цикла и запуску программы гибели. С действием СГ на сигнальные пути SRC/MAPK/PI3K может быть связано ингибирова-
ние синтеза белка р53, вызывающего остановку роста и деления клетки, необходимые для репарации генома или запуска апоптоза. Кроме того, p53 может напрямую связываться с митохондриями, участвуя в пермеабилизации внешней митохондри-альной мембраны, влияя, таким образом, на апоп-тоз. Показано, что в опухолевых клетках дигоксин и уабаин снижают уровень p53.
Это снижение происходило на уровне белка, а не мРНК, что, скорее всего, является следствием активации вышеупомянутых сигнальных путей под действием СГ [59].
Изменение ионного гомеостаза - снижение концентрации ионов калия внутри клетки или рост содержания ионов натрия могут быть триггерами апоптоза [60]. С помощью технологии измерения кальциевых потоков было обнаружено, что про-апоптотическое действие СГ связано с увеличением уровня внутриклеточного кальция. На культурах клеток аденокарциномы простаты показано: уаба-ин, дигоксин и олеандрин активируют рост кальция, что предшествует появлению молекулярных маркеров апоптоза таких как выход цитохрома с из митохондрий, активация каспазы-8 и каспазы-3, расщепление белка PARP [61; 62]. Повышенный уровень кальция при действии СГ активирует гибель клеток рака простаты за счет активации цик-лин-зависимой киназы (Cdk5) и расщепления р35 (Lin et al., 2009). Таким образом, через ионы кальция проходит регуляция программы гибели клеток под действием СГ.
Некоторые виды опухолевых клеток характеризуются чрезмерной активацией гликолиза, избыточной продукцией лактата и закислением внеклеточной среды. Исследования опухолевых клеток in vitro и спектроскопические измерения опухолей in situ показали, что такие линии, как MCF-7, MDAmb-435 (РМЖ), HT-29 (КРР), Rif-1 (фибросар-кома), CaNT (аденокарцинома) имеют более щелочной внутриклеточный рН (7,12-7,65 по сравнению с 6,99-7,2 в нормальной ткани) и кислый внеклеточный рН (6,2-6,9 по сравнению с 7,3-7,4 в нормальной ткани [63; 64]). Изменение рН в опухолевых клетках важно для злокачественной трансформации и прогрессии, при этом уровень внутриклеточного рН контролируется Na+/H+-обменником. Одной из стратегий борьбы с опухолевыми клетками является воздействие на рН клетки и закисление цитозоля. СГ, ингибируя Na/K+-АТФазу, опосредованно активируют Na/H+-обменник и сдвигают внутриклеточный рН в область более кислых значений, что может способствовать элиминации опухолевых клеток.
СГ способны опосредованно влиять на то-поизомеразу II - один из ключевых ферментов регуляции репликации, транскрипции и репарации ДНК [28]. Известно, что ингибиторы топоизомера-зы II (этопозид, иринотекан, адриамицин) составляют группу лекарственных препаратов, применяемых в терапии опухолей в качестве индукторов апоптоза. Дигоксин, уабаин и просцилларидин А ингибируют каталитическую активность топоизо-
меразы II в наномолярных концентрациях (100 пМ), а просцилларидин А, кроме того, способен ингиби-ровать топоизомеразу I [65]. Дигитоксин был в 1,6 раза менее токсичен для лейкемических клеток ССКР-УМ-1, дефектных по топоизомеразе II, по сравнению с аналогичной линией "дикого" типа [29]. Показано, что буфалин вызывает значительное снижение базального уровня мРНК топоизомеразы II в клетках лейкемии, что приводит к снижению активности фермента и индукции апоптоза [66]. Ингибирование топоизомеразы II гликозидами, вероятно, осуществляется за счет увеличения концентрации Са2+, который подавляет каталитическую активность фермента [67].
Многие виды опухолей развиваются в условиях дефицита кислорода за счет недостаточного ангиогенеза. При этом в клетках происходит адаптация метаболизма к условиям гипоксии. Одним из главных регуляторов этого процесса является транскрипционный фактор ИГР1. На различных клеточных моделях показано, что механизм противоопухолевого действия СГ может быть связан с подавлением ШР1. Например, дигоксин, уабаин и другие СГ, ингибируя ШР1, подавляли рост опухолевых клеток легкого А549 в условиях гипоксии [69], индуцировали "арест" клеточного цикла в в2/М фазе за счет опосредованного через ШР1а и №-кВ ингибирования Р1к1 киназы в клетках КРР ИСТ116 и ИТ-29 [70]. Ингибирование ИШа СГ подавляло рост клеток рака простаты РС-3 [71]. Эти данные подтверждаются ретроспективным анализом данных больных, показавшим, что прием дигоксина снижает риск развития рака простаты [72]. Есть данные, что механизм ингибирования ШР1 под действием СГ связан с активацией кальций-зависимой кальмодулин киназы II вследствие увеличения внутриклеточного содержания Са2+ (Riganti et а1. 2009). На модели ксенотранспланта-ции мышам клеток РМЖ МБА-МВ-435 дигоксин снижал количество метастазов в лимфатической системе [74]. Таким образом, дигоксин может быть использован в терапии больных РМЖ в условиях гиперэкспрессии ИШ, фактора повышенной агрессивности опухоли [75].
Сердечные гликозиды
и хеморезистентность
СГ при совместном действии с другими противоопухолевыми агентами могут существенно влиять на эффективность элиминации опухолевых клеток, вызывая либо сенситизацию и усиление гибели клеток, либо резистентность к действию цитостатиков. Хорошо известным примером усиления гибели клеток является совместное действие СГ и ЛТ. Показано, что с помощью дигитоксина может быть повышена чувствительность к лучевому воздействию опухолевых клеток РМЖ [76], уа-баин повышал чувствительность к ЛТ клеток аде-нокарциномы легкого А549 [77], а олеандрин показал сходный эффект на клетках рака простаты РС-3 [78]. Другим примером сенситизации опухолевых клеток к терапии является потенциирование
TRAIL-индуцированного апоптоза с помощью СГ. TRAIL является лигандом рецепторов смерти, запускающим апоптоз по внешнему пути. Клиническое применение TRAIL основано на комбинаторной терапии различных опухолей, но существует проблема чувствительности клеток к TRAIL, которая может в некоторых случаях быть решена с помощью СГ. Олеандрин показал способность сен-ситизировать устойчивые к TRAIL линии опухолевых клеток легкого [49], буфадиенолид - клетки РМЖ [50], а уабаин - клетки (Jurkat T cells) ОЛЛ [79]. Еще одним примером сенситизации гибели является комбинаторное действие буфалина и со-рафениба на клетки PLC/PRF/5 и HepG-2 ГЦР, причем этот эффект связан с ингибированием фосфо-рилирования киназы Erk1/2 [80].
Если в одних условиях СГ вызывают потенцирование действия известных цитотоксических препаратов, в других они могут, наоборот, вызывать резистентность. Проблема устойчивости опухолевых клеток к терапии является одной из самых актуальных и сложных при лечении онкологии. Лечение может приводить к гибели большинства опухолевых клеток, но резистентные могут выживать и расти. На клетках аденокарциномы легкого A549, КРР HT29 и меланомы U1 показано уменьшение цитотоксичности доксорубицина при блокаде №+/К+-АТФазы уабаином [81]. В клетках гормон-независимого рака простаты человека уабаин и дигитоксин вызывают устойчивость к тубулин-зависимым химиотерапевтическим средствам (пак-литаксел, колхицин, винкристин, винбластин). Авторы связывают это со способностью СГ блокировать функции микротрубочек и таким образом предотвращать G2/M "арест", вызываемый связыванием перечисленных препаратов с тубулином [82]. Известен феномен МЛУ, которая может быть природной характеристикой опухолевых клеток или быть приобретенной в процессе действия противоопухолевых препаратов [83]. Одним из наиболее известных механизмов MDR является гиперэкспрессия гена mdr1 и его продукта - АТФ-зависимого трансмембранного белка PgP, который удаляет из клетки как эндогенные метаболиты, так и ксенобиотики, в том числе противоопухолевые препараты. MDR может развиваться из-за мутант-ных форм №+/К+-АТФазы - на этом основании №/К+-АТФазу рассматривают как мишень для разработки новых лекарств против рака [84; 85] СГ способны снижать гибель опухолевых клеток от цисплатина [86] и доксорубицина [87], а причиной вызванной резистентности является активация гли-козидами гена mdr1[88]. В клетках Calu-3, T-84, HuH7 и HT-29 дигоксин, уабаин и палитоксин стимулировали экспрессию mdr1, что связывают с увеличением внутриклеточной концентрации ионов кальция [89]. Однако по другим данным именно с помощью СГ можно преодолеть резистентность к химиотерапии, вызванную работой PgP-канала. Например, нивелирование лекарственной устойчивости и снижение количества мембран-связанного Pgp может быть достигнуто за счет ингибиторова-
ния N-гликозилирования PgP, вызванного СГ [35;
90]. В клетках A549 с МЛУ, обработанных одним из СГ, 19-гидрокси-2''-оксовушарином, наблюдалось увеличение количества убиквитинированной формы Pgp. Эти данные могут предложить новый подход для преодоления множественной лекарственной устойчивости с помощью СГ.
Доклинические
и клинические испытания сг
Результаты доклинических исследований СГ неоднозначны, что связано, вероятно, с большими видоспецифическими различиями в чувствительности опухолевых клеток к данным препаратам [56;
91]. Например, Свенсон с соавторами изучили действие дигоксина на опухолевые клетки in vitro и in vivo у иммунодефицитных мышей, которым инъецировали клетки нейробластомы человека SH-SY5Y и нейробластомы мыши Neuro2a. Рост опухоли у мышей, возникших в результате ксе-нотрансплантации клеток нейробластомы человека SH-SY5Y значительно подавлялся дигоксином, в отличие от опухоли, вызванной мышиной линией клеток Neuro2A, которая практически не отвечала на действие дигоксина [92]. СГ подавляли развитие опухоли у мышей после инъекции клеток рака человека P493-Myc, P493-Myc-Luc, PC-3, Hep3B [71] Таким образом, СГ могут подавлять рост опухолей у грызунов, которым трансплантировались ксено-графты опухолевых клеток человека, но такие модели могут приводить к ошибочным выводам относительно клинической эффективности СГ. Дело в том, что токсичность СГ отличается для разных видов - эти препараты вызывают гибель клеток человека и обезьян в гораздо меньших концентрациях, чем клеток крыс и мышей за счет того, что образуемый СГ комплекс с №+/К+-АТФазой более стабильный в мембранах клеток человека, чем мышей или крыс [93]. Поэтому аппроксимацию данных, полученных на животных моделях на человеческий организм в случае испытания СГ следует проводить осторожно. Единственным доказательством возможности применения СГ в противоопухолевой терапии являются клинические испытания. Собраны данные клинических испытаний для наиболее значимого для медицины соединения группы СГ, дигоксина. В одном из клинических исследований фазы I изучалось применение лапатиниба1 в комбинации с дигоксином для лечения метастази-рующего ErbB2+ РМЖ. Исследование проводилось с 2008 по 2012 год компанией GlaxoSmithKline однако окончательные результаты пока не опубликованы (ClinicalTrials.gov No NCT00650910). В недавно завершившемся испытании фазы II для пациентов с III/IV неоперабельной стадией немелкокле-точного рака легких оценивалось совместное применение эрлотиниба2 с дигоксином. К сожалению,
1противопухолевое средство, ингибитор протеинкиназ, связывающийся с белками НЕЯ2 и ЕОРЯ.
2ингибитор ЕОРЯ, стандартно используемый в качестве средства терапии второй линии.
дигоксин не показал усиления ответа на эрлотиниб. У одного из пациентов наблюдался частичный ответ, у девятерых состояние осталось неизменным, а у 14 наблюдалось прогрессирование болезни, несмотря на химиотерапию, что привело к преждевременному завершению исследования. При этом дигоксин не стимулировал появления характерных для эрлотиниба побочных эффектов [94]. В другом исследовании фазы II клинических испытаний, включающем 47 пациентов с меланомой IV стадии, добавление дигоксина к иммунохимиотерапевти-ческим препаратам, содержащим цисплатин, блока-тор тубулина винбластин, и иммуностимуляторы (интерлейкин-2 и интерферон a2b) повышало общую эффективность ответа на терапию с 19,5 до 55,3 %. В настоящее время проводится фаза II клинического испытания безопасности и эффективности дигоксина, применяемого в качестве самостоятельного лекарственного средства у пациентов с рецидивами рака простаты [95]. Кроме этого, эффективность дигоксина планируется оценить (идет набор пациентов) в клиническом испытании фазы II для лечения больных с осложненной формой метастатической саркомы мягких тканей (ClinicalTri-als.gov identifier: NCT00017446). Анвирцел (Ozell Pharmaceuticals), экстракт Nerium oleander, препарат, содержащий смесь двух СГ, олеандрина и оле-андригенина, был испытан in vitro на клетках рака простаты РС3 и DU145 и показал высокую противоопухолевую активность [96]. В 2000 году прошли клинические испытания фазы I Анвирцела на 18 пациентах с трудноизлечимыми формами солидных опухолей - КРР, почечно-клеточный рак (renal cell carcinoma), медуллярный рак щитовидной железы, рецидивирующая опухоль герминогенных клеток (recurrent germ cell tumor). Они позволили определить максимально допустимую дозу препарата и показали его безопасность, но с такими побочными эффектами, как утомление, одышка и тошнота [97]. Значительной противоопухолевой эффективности анвирцела обнаружено не было. И хотя препарат был рекомендован для фазы II испытаний, их результаты в литературе не встречаются. Возможно, причина клинической неэффективности связана с гетерогенной группой испытуемых, тогда как препарат может оказаться селективно эффективным. Сейчас оценивается профиль безопасности и анти-неопластический потенциал AnvirzelTM в комбинации с карбоплатином и доцетакселом (проходит фаза I клинических испытаний на пациентах с прогрессирующим немелкоклеточным раком легких -https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01562301).
Другой препарат, содержащий олеандрин, PBI-05204, ингибирует №+/К+-АТФазу, связываясь с a3 субъединицей. Он способен подавлять активацию NF-kB, фосфорилирование Akt, p70S6K, инги-бирует экспорт фактора роста фибробластов FGF-2 и снижает активность mTOR. Недавно завершилась фаза I клинических испытаний PBI-05204, в которой оценивалась безопасность, рекомендуемые дозы, а также фармакокинетика и фармакодинамика препарата. Окончательные результаты исследова-
ния пока не опубликованы, но предварительные данные были представлены на ежегодном собрании ASCO. В исследовании приняли участие 46 пациентов, рекомендуемая доза составила lO^/mg^m. Наиболее часто наблюдаемыми побочными эффектами применения PBI-05204 были усталость (56,1 %), тошнота (41,5%), и диарея (39,0%). У 10 пациентов (24,4 %) наблюдались нарушения со стороны сердечно-сосудистой системы. Что касается противоопухолевой активности препарата, у 7 из 45 пациентов, страдавших раком мочевого пузыря, толстой кишки, маточных труб, молочной железы и поджелудочной железы, состояние оставалось стабильным в течение более четырех месяцев [98]. Высокую противоопухолевую активность in vitro показал препарат UNBS-1450 - полусинтетический карденолид, производное 2-оксивушарина, получаемого из произрастающего в пустыне кустарника Calotropis procera [53; 57]. К сожалению, клинические испытания UNBS-1450 приостановлены в 2011 г. из-за банкротства спонсора исследований.
В настоящее время активно изучается препарат HuaChanSu, содержащий буфалин. В исследованиях, включающих 2 пациентов, страдавши НМРЛ, 11 - ГЦР и 2 больных, страдавших раком поджелудочной железы, HuaChanSu оказался хорошо переносимым и вызывал стабилизацию заболевания в 40 % случаев. Сейчас на 80 пациентах, страдающих раком поджелудочной железы, изучается безопасность и терапевтический потенциал HuaChanSu в комбинации с гемцитабином (фаза II клинических испытаний). Полученные данные говорят о том, что такая терапия хорошо переносится, но пока не удалось добиться существенного уменьшения роста опухолей, улучшения качества жизни и её продолжительности [95].
Перспективы использования СГ
в медицине
Данные о взаимодействии СГ с другими препаратами разнородны и, видимо, эффект СГ в каждом случае определяется различными молекулярными механизмами. Возможно, успешный поиск клинической эффективности СГ может быть основан на подходах персонифицированной медицины, когда для клинических испытаний отбираются пациенты, заболевания которых имеют известные молекулярные характеристики - потенциальные мишени СГ.
Скорее всего, СГ будут эффективны для избирательных типов рака, например, с выраженной гиперэкспрессией HIF1 или гиперактивацией NF-кВ или характеризующихся MDR с известным механизмом. Необходимы дополнительные исследования о взаимодействии СГ с другими химиопрепа-ратами, особенно на моделях с устойчивостью к лекарственным препаратам.
Изучение и понимание всех особенностей действия СГ на опухолевые клетки позволит найти оптимальную область для их клинического применения и разработать новые, более эффективные методы противоопухолевой терапии.
Благодарности
Работа поддержана грантами Президента РФ № 14.120.14.2849-МК, РФФИ № 14-04-01660-а и № 14-04-31078-мол-а, а также грантом РНФ (14-25-
00056, гибель опухолевых клеток). Мы приносим свои извинения тем авторам, чьи публикации не могли быть процитироваными в силу ограниченности обьема статьи.
Список литературы
1. Withering W. // G.G.J.&J. Robinson, London. 1785.
2. Calderón-Montaño J.M., Burgos-Morón E., Orta M.L., et al. // Biomed Res. Int. 2014. Vol. 2014.
3. Schoner W., Scheiner-Bobis G. // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2007. Vol. 293. P. C509.
4. Blanco G., Mercer R.W. // Am. J. Physiol. 1998. Vol. 275. P. F633.
5. Zahler R., Sun W., Ardito T., et al. // Circ. Res. 1996. Vol. 78. P. 870.
6. Sandtner W., Egwolf B., Khalili-Araghi F., et al. // J. Biol. Chem. 2011. Vol. 286. P. 38177.
7. Scheiner-Bobis G. // Cardiovasc. Res. 2011. Vol. 89, № 1. P. 6.
8. Orrenius S., Zhivotovsky B., Nicotera P. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2003. Vol. 4. P. 552.
9. Kometiani P., Liu L., Askari A. 2005. Vol. 67, № 3. P. 929.
10. Liang M, Cai T, Tian J., et al. // J. Biol. Chem. 2006. Vol. 281. P. 19709.
11. Xie Z., Askari A. // Eur. J. Biochem. 2002. Vol. 269, № 10. P. 2434.
12. LiangM, Tian J., Liu L., et al. // J. Biol. Chem. 2007. Vol. 282. P. 10585.
13. Liu L., Ivanov A. V., Gable M.E., et al. // Biochemistry. 2011. Vol. 50. P. 8664.
14. Szent-GyorgyiA. // Acad. Press. New York. 1953.
15. BagrovA.Y., Shapiro J.I., Fedorova O. V// Pharmacol. Rev. 2009. Vol. 61. P. 9.
16. Dvela M., Rosen H., Ben-Ami H.C., et al. // AJP Cell Physiol. 2012. Vol. 302. P. C442.
17. Komiyama Y., Nishimura N., Munakata M., et al. // J. Hypertens. 2001. Vol. 19. P. 229.
18. Murrell J.R., Randall J.D., Rosoff J, et al. // Circulation. 2005. Vol. 112. P. 1301.
19. Apel A., Rachel P., Cohen O., et al. // Eur. J. Clin. Invest. 2013. Vol. 43. P. 152.
20. BlausteinM.P. // Am. J. Physiol. 1993. Vol. 264. P. C1367.
21. Bignami E., Casamassima N., Frati E., et al. // Crit. Care Med. 2013. Vol. 41. P. 744.
22. Shiratori O. // Gan. 1967. Vol. 58, № 6. P. 521.
23. Stenkvist, Bengtsson, Eriksson, et al. // Lancet. 1979. Vol. 1, № 563.
24. Stenkvist, Pengtsson, Dahlqvist, et al. // N Engl J Med. 1982. Vol. 306, № 482.
25. StenkvistB. // Oncol. Rep. 1999. Vol. 6. P. 493.
26. Ahern T.P., Lash T.L., Sorensen H.T., et al. // Breast Cancer Res. 2008. Vol. 10. P. R102.
27. Haux J., Klepp O., Spigset O., et al. // BMC Cancer. 2001. Vol. 1. P. 11.
28. López-Lázaro M, Pastor N., Azrak S.S., et al. // J. Nat. Prod. 2005. Vol. 68. P. 1642.
29. Johansson S., Lindholm P., Gullbo J., et al. // Anticancer. Drugs. 2001. Vol. 12. P. 475.
30. Takai N., Ueda T., Nishida M., et al. // Int. J. Mol. Med. 2008. Vol. 21. P. 637.
31. Xu Z.W., Wang F.M., Gao M.J., et al. // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2011. Vol. 125. P. 181.
32. Xie C.-M., Chan W.Y., Yu S., et al. // Free Radic. Biol. Med. 2011. Vol. 51. P. 1365.
33. Kometiani P., Liu L., Askari A. 2005. Vol. 67, № 3. P. 929.
34. Pongrakhananon V., Chunhacha P., Chanvorachote P. 2013. Vol. 8, № 7.
35. Zavareh R.B., Lau K.S., Hurren R., et al. // Cancer Res. 2008. Vol. 68. P. 6688.
36. Tailler M., Senovilla L., Lainey E., et al. // Oncogene. 2012. Vol. 31. P. 3536.
37. Felth J., Rickardson L., Rosén J., et al. // J. Nat. Prod. 2009. Vol. 72. P. 1969.
38. Kulikov A., Eva A., Kirch U, et al. // Biochim. Biophys. Acta. 2007. Vol. 1768, № 7. P. 1691.
39. Xu Z.-W., Wang F.-M., Gao M.-J., et al. // Biol. Pharm. Bull. 2010. Vol. 33. P. 743.
40. McConkey D.J., Lin Y, NuttL.K., et al. // Cancer Res. 2000. Vol. 60. P. 3807.
41. Juncker T., Schumacher M., Dicato M., et al. // Biochem Pharmacol. 2009. Vol. 78. P. 1.
42. Wang Y, LonardD.M., Yu Y., et al. // Mol. Endocrinol. 2011. Vol. 25. P. 2041.
43. Lefranc F., Mijatovic T., Kondo Y., et al. // Neurosurgery. 2008. Vol. 62. P. 211.
44. Mijatovic T., Dufrasne F., Kiss R. 2012. Vol. 1. P. 91.
45. Sakai H., Suzuki T, Maeda M., et al. // FEBS Lett. 2004. Vol. 563. P. 151.
46. Mijatovic T., Roland I., Van Quaquebeke E., et al. // J. Pathol. 2007. Vol. 212. P. 170.
47. Ramirez-Ortega M., Maldonado-Lagunas V., Melendez-Zajgla J., et al. // Eur. J. Pharmacol. 2006. Vol. 534. P. 71.
48. Huang W., Yang J., Pai S., et al. // Mutat Res. 2012. Vol. 1, № 732. P. 26.
49. Frese S., Frese-Schaper M., Andres A.-C., et al. // Cancer Res. 2006. Vol. 66. P. 5867.
50. Dong Y., Yin S., Li J., et al. // Apoptosis. 2011. Vol. 16. P. 394.
51. Xie C.-M., Chan W.Y., Yu S., et al. // Free Radic. Biol. Med. 2011. Vol. 51. P. 1365.
52. Trenti A., Grumati P., Cusinato F., et al. // Biochem. Pharmacol. Elsevier Inc., 2014. Vol. 89, № 2. P. 197.
53. Mijatovic T., Op De BeeckA., Van Quaquebeke E., et al. // Mol. Cancer Ther. 2006. Vol. 5. P. 391.
54. Lefranc F., Mijatovic T., Kondo Y., et al. // Neurosurgery. 2008. Vol. 62. P. 211.
55. Hundeshagen P., Hamacher-Brady A., EilsR., et al. // BMC Biol. 2011. Vol. 9. P. 38.
56. SlingerlandM., Cerella C., Guchelaar H.J., et al. // Invest. New Drugs. 2013. Vol. 31, № 4. P. 1087.
57. Juncker T., Cerella C., Teiten M.-H., et al. // Biochem. Pharmacol. 2011. Vol. 81. P. 13.
58. Manna S.K., Sah N.K., Newman R.A., et al. // Cancer Res. 2000. Vol. 60. P. 3838.
59. Wang Z., ZhengM., Li Z., et al. 2010. Vol. 69, № 16. P. 6556.
60. Yu S.P. // Prog. Neurobiol. 2003. Vol. 70. P. 363.
61. McConkey D.J., Lin Y, Nutt L.K., et al. // Cancer Res. 2000. Vol. 60. P. 3807.
62. Yeh J.Y., Huang W.J., Kan S.F., et al. // J. Urol. 2001. Vol. 166. P. 1937.
63. Cardone R.A., Casavola V., Reshkin S.J. // Nat. Rev. Cancer. 2005. Vol. 5. P. 786.
64. Gillies R.J., Raghunand N., Karczmar G.S., et al. // J. Magn. Reson. Imaging. 2002. Vol. 16. P. 430.
65. Bielawski K., Winnicka K., Bielawska A. // Biol. Pharm. Bull. 2006. Vol. 29. P. 1493.
66. Hashimoto S., Jing Y., Kawazoe N., et al. // Leuk. Res. 1997. Vol. 21. P. 875.
67. StrickR., Strissel P.L., Gavrilov K., et al. // J. Cell Biol. 2001. Vol. 155. P. 899.
68. Semenza G.L. // Cell. 2012. Vol. 148. P. 399.
69. Wei D., Peng J.-J., Gao H., et al. // Int. J. Mol. Sci. 2013. Vol. 14, № 4. P. 7273.
70. Xie C.-M., Liu X.-Y., Yu S., et al. // Carcinogenesis. 2013. Vol. 34, № 8. P. 1870.
71. Zhang H., Qian D.Z., Tan Y.S., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2008. Vol. 105. P. 19579.
72. Wright J., Hansten P.D., Janet S. // Prostate. 2014. Vol. 74, № 1. P. 97.
73. Riganti C., Campia I., Polimeni M., et al. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2009. Vol. 240. P. 385.
74. Schito L., Rey S., Tafani M., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. 2012. Vol. 109. P. E2707.
75. Wong C.C.L., Zhang H., Gilkes D.M., et al. // J. Mol. Med. 2012. Vol. 90. P. 803.
76. Haux J. 1999. Vol. 53, № August. P. 543.
77. Verheye-Dua F., Bohm L. // Radiat Oncol Investig. 1998. Vol. 6. P. 109.
78. Nasu S., Milas L., Kawabe S., et al. // Cancer Lett. 2002. Vol. 185. P. 145.
79. Panayiotidis M.I., Franco R., Bortner C.D., et al. // Apoptosis. 2010. Vol. 15. P. 834.
80. Gao Y., Li H.X., Xu L.T., et al. // Mol. Biol. Rep. 2012. Vol. 39. P. 1683.
81. Lawrence T.S., DavisM.A. // Cancer Chemother. Pharmacol. 1990. Vol. 26. P. 163.
82. Huang D.-M., Guh J.-H., Huang Y.-T., et al. // J. Biomed. Sci. 2002. Vol. 9, № 5. P. 443.
83. Szakács G., Paterson J.K., Ludwig J.A., et al. // Nat. Rev. Drug Discov. 2006. Vol. 5. P. 219.
84. Mijatovic T., KissR. // Planta Med. 2013. Vol. 79. P. 189.
85. Newman R.A., Yang P., Pawlus A.D., et al. // Mol.Interv. 2008. Vol. 8. P. 36.
86. Kishimoto S., Kawazoe Y., Ikeno M., et al. // Cancer Chemother. Pharmacol. 2006. Vol. 57, № 1. P. 84.
87. Riganti C., Campia I., Polimeni M., et al. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2009. Vol. 240. P. 385.
88. Takara K., Takagi K., Tsujimoto M., et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. Vol. 306. P. 116.
89. BrouillardF., Tondelier D., Edelman A., et al. // Cancer Res. 2001. Vol. 61. P. 1693.
90. Kramer R., Weber T.K., Arceci R., et al. // Br. J. Cancer. 1995. Vol. 71. P. 670.
91. López-LázaroM. // Expert Opin. Ther. Targets. 2007. Vol. 11, № 8. P. 1043.
92. Svensson Á., Azarbayjani F., Backman U., et al. // Anticancer Res. 2005. Vol. 25. P. 207.
93. Calderón-Montaño J.M., Burgos-Morón E., Orta M.L., et al. // Biomed Res. Int. 2014. Vol. 2014. P. 794930.
94. Lin J., Denmeade S., Carducci M.A. // Curr. Cancer Drug Targets. 2009. Vol. 9. P. 881.
95. Menger L., Vacchelli E., Kepp O., et al. // Oncoimmunology. 2013. Vol. 2. P. e23082.
96. Smith J.A., Madden T., Vijjeswarapu M., et al. // Biochem. Pharmacol. 2001. Vol. 62. P. 469.
97. Mekhail T., Kaur H., Ganapathi R., et al. // Invest. New Drugs. 2006. Vol. 24. P. 423.
98. Henary HA, R K., GS F., et al. // J Clin Oncol. 2011. Vol. 29. P. suppl; abstr 3023.
99. Mijatovic T., Op De BeeckA., Van Quaquebeke E., et al. // Mol. Cancer Ther. 2006. Vol. 5. P. 391.
