CC BY
20PHYSICS AND MATHEMATICS
СЕЛЕНСОДЕРЖАЩИЕ НАНОСИСТЕМЫ: БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКИВНОСТЬ И ОПТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Валуева С.В.
Институт высокомолекулярных соединений РАН, Санкт-Петербург,
старший научный сотрудник, к.ф.-м.н.
SELENIUM CONTAINING NANO-SYSTEMS: BIOACTIVITY AND OPTICAL
PROPERTIES
Valueva S.V.
Institute of Macromolecular Compounds, Russian Academy of Sciences, Saint-Petersburg,
senior researcher, PhD in Physico-mathematical sciences
АННОТАЦИЯ
С целью получения агрегативно устойчивых наночастиц (НЧ) нуль-валентного селена с высокой биоактивностью, в качестве стабилизирующих матриц были использованы биоактивные стабилизаторы: бычий сывороточный альбумин (БСА) и поливинилпирролидон (ПВП). Установлено, что в результате восстановления ионного селена в редокс-системе селенит-аскорбат в водном растворе БСА или ПВП, образуются агрегативно устойчивые НЧ нуль-валентного селена, на которых происходит адсорбция молекул БСА или ПВП. На клеточной культуре промиелоцитарной лейкемии HL-60 показано, что селенсодержа-щие наносистемы (СНС) на основе БСА и ПВП способны подавлять рост опухолевых клеток. Обнаружена низкая токсичность, высокая биологическая активность и пролонгированность действия препаратов на основе НЧ селена. Это открывает перспективу создания на их основе новых селенсодержащих лекарственных средств с пониженной токсичностью и высокой терапевтической активностью.
ABSTRACT
Aiming on obtaining of the aggregative stable nanoparticles of zerovalent selenium with high bioactivity the following bioactive stabilizers were used as stabilizing matrixes: bovine serum albumin (BSA) and polyvinyl pyr-rolidone (PVP). It was found that in the result of reduction of ionic selenium in the selenite-ascorbate redox system in water solution of BSA or PVP the aggregative stable nanoparticles of zerovalent selenium where adsorption of BSA or PVOP molecules occur were formed. By means of the promyelocyte leukemia HL-60 cell culture it was demonstrated that selenium containing nanosystems (SNS) on the basis of BSA and PVP were capable to suppress growth of the tumor cells. The following features of the preparations on the basis of selenium nanoparticles effect were found: low toxicity, high bioactivity and prolonged effect of selenium based preparations. It demonstrates prospects of creation of new selenium containing pharmaceuticals basing on the above mentioned systems and characterized by low toxicity and high therapeutic potency.
Ключевые слова: наночастицы селена, биоактивные органические стабилизаторы, цитотоксичность и пролонгированность.
Keywords: selenium nanoparticles, bioactive organic stabilizers, cytotoxity, prolonged effect.
•Постановка проблемы. Выяснение исключительно важной роли селена для здоровья человека [1, с. 233] послужило толчком для разработки профилактических и лечебных средств на основе неорганических и органических соединений селена. Однако, грань между терапевтическими и токсическими дозами форм селена чрезвычайно мала. Так, при систематическом ежедневном поступлении селена в организм в количествах более 800 мкг наблюдаются тяжелейшие отравления, напротив, в суточных дозах до 100 мкг селен эффективен при лечении лейкоза, опухолей различной этимологии, аденом, миом, различных нарушений деятельности щитовидной железы, а также дистрофии и цирроза печени [2, с. 2882, 3 с. 117, 4 с. 1171].
•Анализ последних исследований и публикаций. Известно, что токсичность селена снижается при переходе от его ионных форм к органическим соединениям, и особенно к селену в нулевой
степени окисления (8е°). Оценка специфической биологической активности наночастиц (НЧ) нуль-валентного селена, получаемого химическим восстановлением его ионных форм без использования стабилизаторов [5, с. 4504], а также биотехнологическими методами с использованием бактерий, аккумулирующих и восстанавливающих ионный селен [6, с. 209], показала, что уровень их активности не превышает 2% от уровня активности селенита натрия. Однако, при добавлении бычьего сывороточного альбумина (БСА) к редокс-системе селенита натрия и глютатиона образуется красный аморфный наноселен, который в 7 раз менее токсичен, чем селенит натрия, и при этом сохраняет профиль и уровень биологической активности селенита натрия [7, с. 27]. Важно отметить, что в отсутствие БСА нуль-валентный селен не проявляет биологической активности, характерной для селен-альбуминового комплекса [7, с. 27].
•Выделение нерешенных ранее частей общей проблемы. Известно, что токсичность НЧ напрямую связана с их размерами: чем меньше размер НЧ, тем выше удельная площадь, а значит -выше химическая активность и способность к проникновению в организм, следовательно, тем больше степень токсичности препарата [8, с. 552]. Поэтому определение оптических характеристик НЧ, связанных с их размерами, является необходимым компонентом исследований биоактивных наносистем.
•Цель исследований. Целью настоящей работы являлся синтез в водных растворах селенсо-держащих наносистем (СНС) на основе биоактивных органических стабилизаторов БСА и поливи-нилпирролидона (ПВП), установление природы взаимодействий БСА и ПВП с НЧ селена и оптических параметров СНС, а также проведение оценки потенциальной противоопухолевой in vitro активности синтезированных СНС в сравнении с селенитом натрия и сравнительных исследований особенностей метаболизма СНС in vivo.
• Изложение основного материала. В работе использовали селенистую кислоту
(«AcrosOrganics», Бельгия) и аскорбиновую кислоту («Вектон», Россия) с содержанием основного вещества не менее 99.99%. БСА (Calbiochem, frac-tionV, Bgrade) дополнительно очищали гель-фильтрацией на сефадексе G-100 (элюент - дистиллированная вода). Молекулярная масса БСА составляла Mw = 70 х 103. Выбор ПВП в качестве второго стабилизатора для НЧ селена основывался на том, что ПВП широко используется в фармации и медицине в качестве водорастворимого нетоксичного компонента ряда лекарственных препаратов и обладает рядом уникальных физико-химических свойств [9, с. 148]. В данной работе использовали ПВП с Mw= 23 х 103. Реакцию восстановления проводили при соотношениях селенистой кислоты и БСА/ПВП, обеспечивающих получение СНС БСА/Se0 и ПВП/Se0 с массовыми соотношениями компонентов 1:10 (v = Сse/Сp= 0.1). Синтез СНС проводился по реакции восстановления селенистой кислоты аскорбиновой
H2SeO3 + 2СбНвОб ^ Se0 + ЗН2О + 2СбИбОб(1)
Оптическую плотность растворов СНС определяли в кварцевых кюветах 1*1 см в диапазоне от 220 до 800 нм на спектрофотометре Specord M-40 («CarlZeiss», Германия).
Методом статического рассеяния света [10, с.159] определяли молекулярные массы (Mw ) и среднеквадратичные радиусы инерции Rg* наноструктур. Методом динамического светорассеяния [11, с. 145] определяли средние гидродинамические размеры наноструктур Rh*. По соотношению экспериментальных величин Rg* и Rh* получали значение параметра p*=Rg*/Rh*, характеризующего конфор-мацию наноструктуры [12, с.3-21].
Для биологического тестирования использовали клетки промиелоцитарной лейкемии линии HL-60. Клетки культивировали в инкубаторе (5% СО2, 37оС) на пластиковых чашках Петри в среде RPMI (Биолот, С.-Петербург) с добавлением 15% эмбриональной сыворотки крови крупного рогатого скота (Gibco). Для исключения микробной об-семененности культуральной среды использовали антибиотик гентамицин в концентрации 80 мкг/мл. Распределение клеток по содержанию ДНК изучали методом проточной цитофлюориметрии. Для увеличения проницаемости мембран, клетки обрабатывали тритоном X-100 в конечной концентрации 0,01% в течение 0,5 часа при комнатной температуре, затем добавляли йодид пропидия (10 мкг/мл, Sigma, США), инкубировали 15 мин при 370С и анализировали на проточном цитофлюори-метре АТС 300 (Brucker) при скорости потока 20 мкл/мин в течение 3 мин.
В нанометровом диапазоне взаимодействие частица-частица может быть обусловлено слабыми Ван-дер-Ваальсовыми силами, более сильными полярными/электростатическими или ковалентными взаимодействиями. Учитывая гидрофобную природу наночастиц Se0 и то, что молекулы ПВП и БСА, также содержат гидрофобные фрагменты, можно заключить, что стабилизация в этих случаях осуществляется за счет гидрофобных взаимодействий (т. н. стерическая стабилизация) (рис. 1).
кислотой в водной среде (1) в присутствии БСА или ПВП при 200С и атмосферном давлении.
Рис. 1. Структурная формула ПВП (а) и структура БСА без и с НЧ Se0 (б, в).
На рис. 2 приведена зависимость оптической плотности Б от длины волны X, которая показывает, что введение ПВП или БСА в реакцию (1) существенно изменяет характер зависимости D(X). Так, ПВП поглощает в области X = 220-230 нм [9, с. 148]; БСА имеет характерный пик поглощения при X = 280 нм (рис. 2, кривая 2), а для коллоидного нуль-валентного селена наблюдается характерный пик
при X = 260 нм (рис. 2, кривая 1). Однако, при образовании СНС характерных для исходных веществ пиков не наблюдается: для СНС ПВП^е0 наблюдается широкая площадка при X = 250-320 нм, а в случае СНС БСА^е0 имеет место слабо выраженный пик при X = 285-290 нм (рис. 2, кривые 3 и 4 соответственно), что доказывает образование селенсо-держащих комплексов.
Рис. 2. Спектры поглощения для раствора коллоидного селена при СБв=0.01 масс.% (кривая 1); для водного раствора БСА при СВСА=0.1 масс.% (кривая 2); для СНС ПВП/Бв0: Спш=0.1масс%о, СБв=0.01 масс.% (V =0.1) (кривая 3) и для СНСВСА/Бв0: СВСА=0.1масс%, СБв=0.01 масс.% (V =0.1) (кривая 4).
Оценка гидродинамического радиуса Яь* НЧ селена методом динамического светорассеяния показала, что в отсутствие стабилизатора образуются крупные частицы селена с радиусом ~ 100 нм (первые сутки), ~180 нм (вторые сутки). По истечении двух суток происходит уже видимая агрегация селена. При использовании в качестве стабилизатора НЧ селена - ПВП или БСА, в водных растворах формируются структуры в нанометровом диапазоне с размером <100 нм (таблица 1), без тенденции к агрегации в течение нескольких месяцев. В таблице 1 приведены также массовые и конформа-ционные характеристики для СНС ПВП/8е0 и
БСА/8е°. По данным статического светорассеяния величина молекулярной массы для продуктов реакции составила 24х106 (ПВП/8е°) и 70х106 (БСА/8е°), т.е. возросла в ~1000 раз по сравнению со свободными макромолекулами ПВП и БСА = 1043 (ПВП^е0) и 1000 (БСА/8е°), где 14*- количество адсорбированных на НЧ селена органических молекул). Размер наноструктур ПВП/8е° и БСА/8е° составляет Кё*= = 50 нм, т.е. р*= Я^/Яь* = 1, что свидетельствует о сферической форме селенсодер-жащих наноструктур [12, с.3-21].
Таблица 1.
Массовые, размерные и конформационные характеристики СНС на основе ПВП и БСА при у = 0.1.
Система ,^х10-3 = нм * Р 1*
ПВП/8е° 24000 50 1 1043
БСА/8е° 70000 50 1 1000
Биологическая активность СНС была изучена на примере противоопухолевой активности. Так, на клетках линии промиелоцитарной лейкемии НЬ-60 было установлено, что СНС ПВП/8е° и БСА/8е° подавляют рост клеток линии НЬ-60 пропорционально росту их концентрации (рис. 3б и в), в то время как при добавлении селенита натрия (№^еОз) в низкой концентрации (10 мкМ) (рис.
3а) или свободного ПВП (свободного БСА), на вторые сутки инкубации наблюдается увеличение про-лиферативной способности клеток. При высокой концентрации (100 мкМ) СНС ПВП/8е° показывает более высокую противоопухолевую активность, чем СНС БСА/8е°. При добавлении селенита натрия и СНС на основе ПВП или БСА до конечной концентрации 200 мкМ на третьи сутки наблюдалась картина полной гибели раковых клеток.
тыс/мл Атыс/мл А, ть
800 400 1200 600
0 1 2 3 су|ки
1 2 3 су1к" ' 0,5 " 1,5 2,0 2,5 с?,,
Рис. 3а. Рис. 3б. Рис. 3в.
Рис. 3: а- Кривые роста клеток ИЬ-60: 1 -контроль; 2-4 при добавлении Ыа2БвО3:2 - 10мкМ; 3 -100мкМ; 4 - 200мкМ; б- Кривые роста клеток ИЬ-60: 1 - контроль; 2- при добавлении ПВП; 3-6 - при добавлении СНС ПВП/Бв0: 3 - 1мкМ; 4 - 50мкМ; 5 - 100мкМ; 6 -200мкМ; в- Кривые роста клеток ИЬ-60: 1 - контроль; 2- при добавлении ВСА; 3-6 - при добавлении СНС ВСА/Бв0: 3 - 1мкМ; 4 - 50мкМ; 5 - 100мкМ; 6 -200мкМ
Для анализа цитотоксичности была выбрана полимера ПВП. Оценку цитотоксичности прово-наносистема на основе физиологически активного дили на клетках «ФЛЕЧ». Установлен диапазон
концентраций нанокомплекса (до 140 мкМ), в котором СНС ПВП/Se0 не показала токсичности, но сохранила биологическую активность. Это открывает перспективы использования биоактивных СНС в качестве основы лекарственных препаратов широкого спектра действия, в частности - противоопухолевых препаратов.
Для исследования особенностей метаболизма СНС на примере СНС ПВП/Se0 были проведены измерения концентрации селена в пробах биоматериала от подопытных мышей (урина) методом атомно-эмиссионной спектрометрии на приборе VISTA PRO (Varían, USA) через различные интервалы времени после инъекций препаратов СНС ПВП/Se0 в сравнении с раствором Na2SеОз. В первой серии экспериментов мышам вводили по 0.1 мл
CSe, мкг/г
растворов с концентрацией селена 460 мкг/мл (т.е. 46 мкг селена на мышь или ~2.3 мкг/г при среднем весе мыши~20г). Измерение концентрации селена в пробах биоматериала показало, что в пробах урины после инъекции раствора Na2SеОз (рис. 4, кривая 1) уже через 1 час содержится 29800 мкг/кг селена, через 3 часа - 36500 мкг/кг. Фактически в течение суток потери селена с уриной превысили 80% от введенного количества. В случае СНС ПВП^е0 потери биоэлемента, в первые сутки после инъекции, существенно ниже (рис. 4, кривая 2). Увеличение длительности сохранения более высоких концентраций селена в урине наглядно демонстрирует эффект пролонгированности действия СНС ПВП^е0 по сравнению с традиционным препаратом на основе селенита натрия.
0 10 20 30 40 50 60 70
t,4ac
Рис. 4. Измерения концентрации селена в пробах биоматериала от подопытных мышей (урина) во времени: кривая 1 - для раствора Na2SеОз, кривая 2- для раствора СНС ПВП/Бв0.
Более эффективное присутствие селена в организме при инъекциях СНС ПВП^е0 открывает возможность использования более высоких доз селена в случае необходимости экстренного вмешательства при острых проявлениях у животных и чело-
века дефицита селена. Такая возможность подкреплена и тем, что острая токсичность СНС ПВП^е0 на порядок ниже, чем у препарата в виде раствора селенита натрия. В испытаниях на мышах установлено, что ЛД50 по препарату: 6159 мг/кг (СНС ПВП^е0) и 642 мг/кг (Na2SеОз) (рис. 5).
36
27
18
Рис. 5. Острая токсичность (ЛД50) преп
Важной оценкой эффективности селенсодер-жащих препаратов является измерение активности антиокислительных ферментов, в первую очередь глутатион пероксидазы (ГТП), в состав молекулы, которой входит 4 атома селена. ГТП - важный фермент, защищающий от окислительной деградации
атов на основе ^23еО3 и СНС ПВП^е0. полиненасыщенные липиды клеточных мембран. Результаты анализа крови показывают (рис. 6), что использование СНС ПВП^е0 обеспечивает более высокую активность ГТП в длительном интервале измерений (до 15 суток) по сравнению с Na2SеОз.
Активность ГТП,
Врем я после инъекций, сутки
Рис.6. Кинетика изменения активности глутатион пероксидазы при инъекции селена (10 мкг на мышь) в
виде Na2SеО3 (кривая 1) и СНС ПВП/Бг0 (кривая2).
Полученные данные составляют физико-химическую основу для освоения технологии производства высокоэффективных лекарственных средств на основе селена в нуль-валентной форме с пониженной токсичностью и улучшенной фармокинети-кой.
•Выводы.
1. В водных растворах определены массовые, размерные и конформационные характеристики СНС БСА/Se0 и ПВП/Se0. Установлена природа взаимодействий полимерного стабилизатора с НЧ селена.
2. Проведена оценка (на клетках промиело-цитарной лейкемии HL-60) потенциальной противоопухолевой и антиоксидантной активности СНС in vitro в сравнении с селенитом натрия. Было показано, что наносистемы БСА/Se0 и ПВП/Se0 ингиби-руют рост опухолевых клеток, пропорционально увеличению ее концентрации, вызывая их полную гибель при концентрации 200 мкМ.
3. Установлено, что СНС на основе ПВП и НЧ Se0 проявляют меньшую токсичность, более высокую биологическую эффективность и пролонги-рованность действия по сравнению с растворами селенита натрия.
Литература
1. Rayman P. M. The Importance of Selenium to Human Health// Lancet, V. 356, № 9225, 2000.
2. Ip C., Thompson H.J., Zhu Z., Ganther H.F. In vitro and in vivo studies of methylseleninic acid: Evidence that a monomethylated selenium metabolite is critical for cancer chemoprevention // Cancer Res, V.60, № 11, 2000.
3. Yu S.Y., Zhu Y.J., Li W.G. Chemoprevention trial of human hepatitis with selenium supplementation in China / // Biol. Trace Element Res., № 51 (1), 1997.
4. Menter D.G., Sabichi A.L., Lippman S.M. Selenium effects on prostate cell growth // Cancer Epidemiol Biomarkers, V. 9, 2000.
5. Schlekat C.E., Dowdle P.R., Lee B.G., Luoma S.N., Oremland R.S. Bioavailability of particle-associated Se to the bivalve Potamocorbula amurensis// Env. Sci. & Technol., V. 34, 2000.
6. Combs G.F., Garbisu C., Lee B.G., Yee A., Carlson D.E., Smith N.R., Magyarosy A.C., Leighton T., Buchanan B.B. Bioavailibility of selenium accumulated by selenite-reducing bacteria //Biol.Trace Elem. Res., V. 52, № 3, 1996.
7. Zhang J.S., Gao X.Y., Zhang L.D., Bao Y.P. Biological effects of a nano red elemental selenium.// Bio-factors., V. 15, №1, 2001.
8. Medina C., Santos-Martinez M.J., Radomski A. et.al. Nanoparticles: pharmacological and toxicological significance// British J. Pharm., V. 150, 2007.
9. Кирш Ю.Э. Поли-Ы-винилпирролидон и другие поли-Ы-виниламиды. - М.: Наука, 1998. -252 с.
10. Эскин В.Е. Рассеяние света растворами полимеров и свойства макромолекул. - Л.: Наука, 1986. - 288с.
11. Brown W. Dynamic Light Scattering: the Method and Some Application. -Oxford: Clarondon Press, 1993. - 305 p.
12. Burchard B.W. Static and dynamic light scattering approaches to structure determination of biopolymers. Laser Light Scattering in Biochemistry./ Eds. by Harding S.E., Satelle D.B., Bloomfild V.A. Cambridge : Royal Soc. Chem. 1992. Information Services. P.3-21.
