CC BY
10ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия Б, 2003, том 45, № 9, с. 1595-1600
УДК 541.64:547.963.32 •
СЕЛЕКТИВНОСТЬ СВЯЗЫВАНИЯ АЛИФАТИЧЕСКОГО ИОНЕНА С ДНК И ПОЛИАКРИЛАТОМ НАТРИЯ
© 2003 г. А. Н. Зеликин*, Е. С. Труханова*, В. А. Изумрудов*, А. А. Литманович**
* Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Химический факультет 119992 Москва, Ленинские горы **Московский автомобильно-дорожный институт (Государственный технический университет) 125829 Москва, Ленинградский пр., 64 Поступила в редакцию 15.04.2003 г.
Принята в печать 19.05.2003 г.
Изучено комплексообразование в смесях ДНК, полиакрилата натрия и 3,3-ионена, определены константы комплексообразования поликатиона с каждым из конкурирующих полианионов в расчете на моль мономерных звеньев К1 и на моль прореагировавших цепей ионена К„. Продемонстрировано, что существенное изменение соотношения констант Кп обусловлено незначительной вариацией величин Показано, что при увеличении степени полимеризации полиакрилата натрия связывание ионена с нуклеиновой кислотой перестает доминировать и предпочтительным становится взаимодействие ионена с полиакрилатом. При росте концентрации вводимого в систему хлористого натрия усиливается тенденция к комплексообразованию цепей ионена с ДНК.
ВВЕДЕНИЕ
Селективность комплексообразования полимера со смесями макромолекулярных партнеров исследована для систем, в которых комплексы стабилизированы как водородными [1], так и солевыми связями [2], в том числе в случае, когда одним из "партнеров" является ДНК [3]. Продемонстрированная в этих работах способность макромолекул практически безошибочно выбирать оптимального партнера может быть использована для количественного разделения сложных смесей полимеров, в частности для высокоэффективного фракционирования полидисперсных полимеров по ММ [4] и сополимеров по составу [5].
С другой стороны, в литературе высказана гипотеза, что эффективность носителя генетического материала, осуществляющего доставку ДНК в живую клетку, во многом лимитирована обратимостью связывания поликатиона с ДНК [6], т.е. способностью их полиэлектролитного комплекса вступать в клетке в реакции замещения с высвобождением ДНК [7]. Поэтому изучение селективных взаимодействий в системах ДНК-поликатион-полианион представляется
E-mail: a_zelikin@mail.ru (Зеликин Александр Николаевич).
важным как в фундаментальном, так и в прикладном плане.
В настоящей работе предлагается общий подход, который позволяет определять константы комплексообразования поликатионов с ДНК и полианионом-конкурентом, исходя из данных о распределении цепей поликатиона между конкурирующими полианионами, получаемыми методом флуоресцентной спектроскопии. Этот подход применен для изучения комплексообразования в растворах 3,3-ионена, ДНК и натриевой соли полиакриловой кислоты.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Бромистый этидий (БЭ), NaCl и буферную соль MES (2-(1Ч-морфолино)этансульфоновая кислота) фирмы "Sigma" (США) использовали без дополнительной очистки. Концентрацию БЭ в растворах определяли спектрофотометрически, полагая мольный коэффициент экстинкции е48о = 5600 л/моль см [8]. Во всех экспериментах растворителем служила бидистиллированная вода.
Образец алифатического 3,3-ионена со степенью полимеризации (количеством заряженных групп в цепи) Р = 220 получали по реакции поли-
1595
присоединения из Ы,М,1\Г,1Ч'-тетраметилдиамино-пропана и 1,3-Дибромпропана с последующим фракционированием продукта методом ионообменной хроматографии, как описано в работе [9].
Вг
В г
U
-bN-(CH2)3-N-(CH2)3-h
Р/ 2
3,3-ионен бромид
Натриевую соль ДНК из тимуса теленка (степень полимеризации ~ 10000 пар оснований) фирмы "Sigma" (США) применяли без дополнительной очистки. Концентрацию ДНК в растворе [Р] выражали в молях фосфатных групп на литр и определяли спектрофотометрически (8^ = 6500 л/моль см [Ю]).
Фракции полиакриловой кислоты со средневе-совыми степенями полимеризации 210, 660, 1200 и 3000 получали радикальной полимеризацией акриловой кислоты в присутствии ДАК с последующим фракционированием продукта дробным осаждением в смесях метанол-этилацетат по методике [11]. Степени полимеризации образцов определяли методом светорассеяния в метаноле при комнатной температуре. В работе также использовали образцы ПАК со степенями полимеризации 30 и 70 фирмы "Aldrich" (США) без дополнительной очистки.
Концентрацию ПАК определяли потенциоме-трическим титрованием с помощью стандартного раствора гидроксида натрия. Растворы полиакри-лата натрия (ПА-Na) приготавливали из раствора ПАК нейтрализацией гидроксидом натрия.
Спектрофотометрические измерения проводили на спектрофотометре "Hitachi 150-20" (Япония) в термостатированной ячейке при постоянном перемешивании.
Интенсивность флуоресценции измеряли на спектрофлуориметре "Jobin-Yvon-3CS" (Франция), снабженном термостатированной ячейкой. Измерения выполняли в кварцевых кюветах при постоянном перемешивании, рН 7 и температуре 25 °С. Длина волн возбуждения и регистрации 535 и 595 нм соответственно. Во всех экспериментах использовали смесь ДНК и БЭ с соотношением концентраций [Р]:[БЭ]=4:1, где [Р] и [БЭ] - концентрация фосфатных групп и красителя. Раство-
ры полиэлектролитных комплексов получали непосредственным смешением реагентов во флуо-риметрической кювете. Во всех экспериментах исходная концентрация ДНК 4 х 10~5 моль/л.
Предварительные эксперименты показали, что время достижения термодинамического равновесия в смесях полиэлектролитов составляет около 10 мин при концентрации хлористого натрия 0.05 моль/л. Если не оговорено иначе, во всех экспериментах буферная смесь содержала 0.05 моль/л ЫаС1, интервал между добавлениями порций титранта - 10 мин.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Комплексообразование в растворах ДНК изучали с помощью катионного красителя БЭ. Ин-теркаляция БЭ в двойную спираль ДНК сопровождается значительным увеличением интенсивности его флуоресценции /, что широко используется для визуализации результатов гель-электрофореза. Введение поликатиона в раствор ДНК и БЭ приводит к вытеснению красителя в объем раствора и, как следствие, к уменьшению интенсивности его флуоресценции. Этот эффект был положен в основу исследования комплексо-образования ДНК с различными поликатионами, а также изучения устойчивости ПЭК, образующихся в водно-солевых средах, и конкурентных реакций в растворах ДНК, поликатиона и полианиона-конкурента [12].
На рис. 1 представлены результаты флуориме-трического титрования раствора ДНК раствором алифатического 3,3-ионена со степенью полимеризации 220 (кривая 1). Введение поликатиона сопровождается линейным снижением величины / до точки эквивалентности полиионов по заряженным группам, в которой происходит выделение стехиометричных не растворимых в воде частиц ПЭК в осадок и уменьшение / до значения интенсивности флуоресценции свободного БЭ в водном растворе.
Результат аналогичного титрования экви-мольной смеси ДНК и ПА-№ со средневесовой степенью полимеризации ~3 х 103 представлен на рис. 1 (кривая 2). Введение ионена в области Ф = [^]:[Р] < 1 тоже приводит к снижению величины /, однако эффективность тушения флуоресценции в данном случае значительно меньше, чем
СЕЛЕКТИВНОСТЬ СВЯЗЫВАНИЯ АЛИФАТИЧЕСКОГО ИОНЕНА
1597
/, усл. ед.
Ф
Рис. 1. Зависимость интенсивности флуоресценции / от соотношения концентраций заряженных звеньев 3,3-ионена и ДНК <р = [1Ч]:[Р] в растворах смеси 3,3-ионена и ДНК (У), 3,3-ионена и эквимольной смеси ДНК и ПА-Ыа (2). [Р] = 4 х х Ю-5; [ЫаС1] = 0.05 моль/л; рН 7; Т = 25°С.
е
1.5 2.5 3.5
ПА-Ыа
Рис. 2. Зависимость относительной доли солевых связей 6, образованных 3,3-ионеном и ДНК в эквимольной смеси ДНК и ПА-Ыа, от логарифма степени полимеризации ПА-Ыа. [Р] = 4 х х Ю-5; [N301] = 0.05 моль/л; рН 7; Г = 25°С.
в отсутствие ПА-Ыа (кривая 1). Это свидетельствует о том, что часть вводимого в раствор поликатиона связывается с ПА-Ыа и не участвует в ком-плексообразовании с ДНК.
Поскольку в достаточно широком начальном интервале ср кривые флуориметрического титрования линейны, интенсивность флуоресценции смеси можно поставить в однозначное соответствие с составом комплекса ДНК-ионен. Отношение тушения флуоресценции в системе ДНК-по-ликатион-полианион-конкурент (/0 - /ЭКС(1)1 к таковому в отсутствие полианиона-конкурента (/0 -- /эксп)0 при фиксированном значении <р численно равно доле солевых связей, образованных ионе-ном с ДНК в конкурентной реакции [13, 14]
^ _ (/0 ~ ^эксп)] _ 01 ^
(А) ^эксп)о ®0
В рассмотренном случае 6 « 0.1, т.е. лишь 10% вводимого поликатиона связывается с ДНК, а 90% участвует в комплексообразовании с ПА-Ыа.
Аналогичные эксперименты и вычисления были проведены с использованием образцов ПА-Ыа; результаты приведены на рис. 2 в виде зависимости 0 от логарифма степени полимеризации ПА-Ыа.
Если степень полимеризации ПА-Ыа больше, чем у ионена (^Рпл-ыа > 2-3), значение 9 постоянно, т.е. не зависит от величины РПА_Ма. При уменьшении степени полимеризации ПА-Ыа ниже степени полимеризации ионена величина 9 значительно возрастает. Это наблюдение полностью согласуется с тем, что устойчивость ПЭК в первую очередь зависит от длины цепи его более короткого компонента [15], в данном случае - более короткого компонента в каждом из образующихся ПЭК.
Физико-химический анализ представленных данных основан на изотерме сорбции олигомера со степенью полимеризации п на одномерной матрице (длинноцепном полимере) [16]:
¿т^тЫ-Чтг1! <2>
Здесь Р - доля звеньев матрицы, связанных с оли-гомером, т - концентрация свободного олигомера, ДС" - свободная энергия комплексообразова-ния в расчете на моль образованных контактов. Правая часть уравнения (2) представляет собой
1п\|/
^ПА-Na
Рис. 3. Зависимость 1п\|/ от степени полимеризации ПА-Na. [Р] = 4 х 10"5; [NaCl] = 0.05 моль/л; pH 7; Т = 25°С.
константу равновесия адсорбции, т.е. константу связывания олигомера со степенью полимеризации п:
кп = к; (3)
(К1 - константа связывания в расчете на моль звеньев олигомера).
В смеси двух матриц nt и П2 и олигомера, степень полимеризации которого меньше, чем степень полимеризации каждой из матриц, уравнение (2) в равной мере применимо к взаимодействию олигомера с каждой из матриц. Если количество связей, образованных олигомером с каждой из матриц, равно п, селективность связывания олигомера с матрицами П| и П2 в их экви-мольной смеси выражается как
у = (Кп/К12)\ (4)
где Ки - константа связывания олигомера с матрицей П, в расчете на моль связанных звеньев, и
1п\|/ = lim (in^l = nln^ (5)
ßl + ß2-*oV ß2J Ki2
Если степень полимеризации олигомера выше, чем, например, для П2, уравнения (4) и (5) должны иметь вид
¥ = ^и/^12 (6)
и
1п\|/ = п1\пКп-п2\пКп (7)
(л, - степень полимеризации олигомера, п2 - степень полимеризации П2).
Обозначив ДНК как П, и ПА-Иа как П2, а ио-нен как олигомер и предположение, что распределение цепей ионена между двумя полианионами в точности равно доле звеньев каждого из полианионов, связанных в ПЭК, получаем для связывания ионена с ДНК = 0 и для комплексо-образования ионен-ПА-Иа |32 = (1 - 0).
Таким образом, экспериментальные значения распределения цепей ионена между ДНК и ПА-№ различных степеней полимеризации в их эквимольной смеси могут быть использованы для установления отношения констант связывания ионена с каждым из полианионов, а также для вычисления абсолютных величин Ки и Кп.
На рис. 3 представлены зависимости 1пу от РПА.Ма в области значений, не превосходящих степень полимеризации ионена. В полном соответствии с уравнением (7) представленная зависимость является линейной (коэффициент корреляции 0.999). Согласно этому уравнению, наклон прямой В равен -1пК12, а отрезок, отсекаемый на оси У, составляет п{ [пА",,. Полученные из этих данных константы комплексообразования ионена с ДНК и ПА-Ыа в расчете на моль мономерных звеньев составили 1.012 и 1.024 соответственно. Как видно, и К^ имеют очень близкие значения, Кп : К12 = 0.989. Это отражает общий для каждой из пар полиэлектролитов тип взаимодействия полиионов, а именно электростатический. Однако даже столь незначительное различие констант Кх в силу кооперативное™ взаимодействия полиэлектролитов обусловливает существенное доминирование связывания ионена с ПА-№ в смеси высокомолекулярных ДНК и ПА-№, 0-0.1.
Поскольку величина Кп для каждой пары полиэлектролитов связана с энергией свободного состояния П,, можно предположить, что отношение Ки : К12 будет зависеть от свойств реакционной среды, в частности ионной силы. Для изучения этого эффекта эксперименты с использованием образца ПА-Ыа со степенью полимеризации
СЕЛЕКТИВНОСТЬ СВЯЗЫВАНИЯ АЛИФАТИЧЕСКОГО ИОНЕНА
1599
~3 х 103, аналогичные представленным на рис. 1, были проведены в средах с различным содержанием хлористого натрия. Из экспериментальных величин 0 были вычислены отношения Кп : Кп по уравнению (4), в которое для учета частичной диссоциации ПЭК под действием низкомолекулярного электролита подставляли значения я, определенные из кривых флуориметрического титрования ПЭК хлористым натрием [17]. Результаты таких вычислений представлены на рис. 4 в виде зависимости величины Кп : К12 от концентрации хлористого натрия cNaC1.
Действительно, увеличение ионной силы приводит к росту отношения констант комплексооб-разования ионена с ДНК и ПА-Na. Так, если при cNaC, = 0.05 моль/л значение Кп : К12 составляет 0.987, т.е. в системе доминирует связывание ионена с ПА-Na, то увеличение концентрации хлористого натрия до 0.5 моль/л приводит к тому, что величина Кп : Кп становится больше единицы; иными словами предпочтительным становится связывание ионена с ДНК. Этот вывод полностью согласуется с данными по устойчивости к диссоциации в водно-солевых средах ПЭК, образованных ДНК и полиметакрилатом натрия с различными поликатионами [18], в том числе ионе-нами [19]. При малой длине цепей поликатионов, для которых диссоциация ПЭК протекает при незначительных величинах ионной силы, комплексы полиметакрилата натрия с поликатионами являются более устойчивыми, т.е. диссоциируют при больших концентрациях соли, чем ПЭК этого поликатиона с ДНК. При некоторой величине степени полимеризации поликатиона происходит инверсия указанной закономерности, и ДНК-со-держащие ПЭК становятся более толерантными к действию соли. По всей видимости, эти данные объясняются именно выявленными в настоящей работе различиями в изменении величин Ки при варьировании ионной силы раствора. Такой эффект может быть положен в основу получения самонастраивающихся систем для разделения смесей полианионов, в том числе ДНК.
Таким образом, в работе разработан подход к определению констант комплексообразования поликатионов с ДНК и полианионом-конкурентом. Показано, что величины Ки являются сравнимыми, однако в силу кооперативности взаимодействия полиионов даже незначительное изменение отношения констант комплексообразования в
0.990
0.15 0.30 0.45
сМаС1, моль/л
Рис. 4. Отношения констант комплексообразования 3,3-ионена с ДНК и с ПА-Ыа в расчете на моль солевых связей в зависимости от концентрации хлористого натрия. [Р] = 4 х 10~5 моль/л; рН 7; Г= 25°С.
расчете на моль образующихся контактов приводит к доминирующему связыванию поликатиона с одним или другим полианионом. Полученные данные позволяют предположить, что высвобождение ДНК из ее полиэлектролитных комплексов с поликатионами-носителями генетического материала происходит в результате конкурентного связывания поликатиона с карбоксилсодержащи-ми заряженными клеточными компонентами. Обнаруженный эффект перераспределения цепей поликатиона между ДНК и ПА-Na при изменении ионной силы раствора можно использовать для создания самонастраивающихся систем, чувствительных к присутствию низкомолекулярных электролитов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Литманович A.A., Ануфриева Е.В., Паписов И.М., Кабанов В.А. // Докл. АН СССР. 1979. Т. 246. № 4. С. 923.
2. lzumrudov V.A., Bronich Т.К., Saburova O.S., Ze-zin A.B., Kabanov VA. // Makromol. Chem., Rapid Commun. 1988. V. 9. P. 7.
3. Izumrudov V.A., Kargov S.I., Zhiryakova M.V., Zez-in A.B., Kabanov VA. // Biopolymers. 1994. V. 35. № 5. P. 523.
4. Паписов И.M., Литманович A.A. // Высокомолек. соед. А. 1977. Т. 19. № 4. С. 716.
5. Литманович A.A., Паписов ИМ., Кабанов В.А. // Высокомолек. соед. А. 1980. Т. 22. № 5. С. 1180.
6. Schaffer D.V., Fidelman NA., Dan N.. Lauffenburg-er DA. // Biotechnol. Bioeng. 2000. V. 67. № 5. P.598.
7. Erbacher P., Roche A.C., Monsigny M., Midoux P. // Bioconjugate Chem. 1995. V. 6. P. 401.
8. Warring MJ. //I. Mol. Biol. 1965. V. 13. P. 269.
9. Zelikin A.N., Akritskaya NJ., Izumrudov V.A. // Macro-mol. Chem. Phys. 2001. V. 202. № 15. P. 3018.
10. Olins D.E., Olins A.L., von Hippel P.H. // J. Mol. Biol. 1967. V. 24. P. 157.
11. Харенко O.A., Харенко A.B., Калюжная Р.И., Изумрудов B.A., Касаикин B.A., Зезин А.Б., Кабанов В А. /I Высокомолек. соед. А. 1979. Т. 21. № 12. С. 2719.
12. Izumrudov V.A., Zhiryakova M.V., Kudaibergenov S. H Biopolymers. 2000. V. 52. P. 94.
13. Izumrudov VA., Zhiryakova M.V., Akritskaya N.I. // Advanced Macromolecular and Supramolecular Materials
and Processes / Ed. by Geckeier K. New York-Boston-Dordrecht-London-Moscow: Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2003. P. 277.
14. Erbacher P., Roche A.C., Monsigny M., Midoux P. H Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1324. P. 27.
15. Kabanov VA. // Macromolecular Complexes in Chemistry and Biology / Ed. by Dubin P.L. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 1994. P. 151.
16. Papisov I.M., Litmanovich AA. Il Adv. Polym. Sei. 1989. V. 90. P. 139.
17. Zelikin A.N., Litmanovich A.A., Paraschuk V.V., Sybatchin A.V., Izumrudov VA. // Macromolecules. 2003. V. 36. № 6. P. 2066.
18. Izumrudov V.A., Zhiryakova M.V. // Macromol. Chem. Phys. 1999. V. 200. № 11. P. 2533.
19. Zelikin A.N., Izumrudov VA. // Macromol. Biosci. 2002. V. 2. № 2. P. 78.
Selectivity of Binding of Aliphatic Ionene with DNA and Sodium Polyacrylate
A. N. Zelikin*, E. S. Trukhanova*, V. A. Izumrudov*, and A. A. Litmanovich**
* Moscow State University, Faculty of Chemistry, Leninskie gory, Moscow, 119992 Russia ** Moscow State Automobile and Road Technical University, Leningradskii pr. 64, Moscow, 125829 Russia
Abstract—Complex formation in mixtures of DNA, sodium polyacrylate, and 3,3-ionene was studied, and constants of polycation binding with each of the competing polyanions per mol of monomer units (K{ ) and per mol of the reacted ionene chains (Kn) were determined. It was demonstrated that an essential change in the ratio of Kn constants results from an insignificant variation in values. It was shown that, with an increase in the degree of polymerization of sodium polyacrylate, the predominant binding of ionene with DNA disappears and the interaction of ionene with polyacrylate becomes preferential. As the concentration of sodium chloride added to the system grows, the tendency toward complexation of ionene chains with DNA enhances.
Сдано в набор 21.05.2003 г. Подписано к печати 28.07.2003 г. Формат бумаги 60 х 88*/8
Офсетная печать Усл. печ. л. 22.0 Усл. кр.-отт. 6.9 тыс. Уч.-изд. л. 21.9 Бум. л. 11.0
Тираж 308 экз. Зак. 7552
Свидетельство о регистрации № 0110165 от 04.02.93 г. в Министерстве печати и информации Российской Федерации
Учредители: Российская академия наук, Институт нефтехимического синтеза им. A.B. Топчиева
Адрес издателя: 117997 Москва, Профсоюзная ул., 90 Отпечатано в ППП "Типография "Наука", 121099 Москва, Шубинский пер., 6
