CC BY
33ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия А, 2007, том 49, № 4, с. 691-700
РАСТВОРЫ
УДК 541(64+49+183)
СТАБИЛИЗАЦИЯ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ КАРБОКСИЛСОДЕРЖАЩИХ ПОЛИАНИОНОВ В НЕЙТРАЛЬНЫХ И СЛАБОКИСЛЫХ СРЕДАХ И ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА НЕЕ
© 2007 г. В. А. Изумрудов
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова.
Химический факультет 119992 Москва, Ленинские горы Поступила в редакцию 12.10.2006 г.
Принята в печать 09.11.2006 г.
Методом турбидиметрического титрования изучена устойчивость нерастворимых полиэлектролитных комплексов, образованных различными карбоксилсодержащими полианионами с положительно заряженным партнером - линейным поликатионом или белком. В подавляющем большинстве случаев подкисление среды приводит к существенному упрочнению комплексов по отношению к действию вводимой соли, которое наблюдали в нейтральных или слабокислых средах. Полученные данные по влиянию химической природы полимерных компонентов, а также степени полимеризации, плотности заряда и структуры их цепей на рН-зависимые профили разрушения комплексов свидетельствуют в пользу того, что этот эффект обусловлен стабилизацией полиэлектролитного комплекса системой водородных связей, формируемой карбоксильными группами частично заряженного полианиона, включенного в состав комплекса. Обнаруженное резкое и обратимое изменение устойчивости систем при благоприятных для функционирования биополимеров рН и ионной силе раствора (белков, ферментов, антител, нуклеиновых кислот и т.п.) делает поликарбоксилатные полиэлектролитные комплексы особенно привлекательными для решения важных практических задач, например в биотехнологии для разделения биологических смесей.
ВВЕДЕНИЕ
Хорошо известно, какую важную роль играет низкомолекулярный электролит в межмакромо-лекулярных реакциях, протекающих в водных средах с участием полиэлектролитных компонентов. Его присутствие является обязательным для осуществления интерполиэлектролитного обмена в смесях разбавленных растворов разноименно заряженных полиионов, приводящего к образованию водорастворимых нестехиометричных полиэлектролитных комплексов (НПЭК), а концентрация и природа добавляемых низкомолекулярных ионов могут определять направление и скорость конкурентных интерполиэлектролитных реакций в растворах НПЭК [1]. Как правило, введение больших количеств низкомолекулярного электролита приводит к диссоциации полиэлектролитных комплексов, построенных из высокозаряженных полимерных компонентов, которая
E-mail: izumrud@genebee.msu.su (Изумрудов Владимир Алексеевич).
завершается в достаточно концентрированных водно-солевых растворах. Поскольку введение соли является универсальным средством разрушения комплексных частиц, стабильность полиэлектролитных комплексов обычно оценивают по их устойчивости в водно-солевых средах.
Другим способом воздействия на комплексо-образование может быть изменение кислотности среды, влияющее на состояние пар полиионов, в которых один или оба полимерных компонента представляют собой слабые полиэлектролиты. Наличие во взаимодействующих цепях ионоген-ных групп с рН-зависимой ионизацией делает такие комплексы чувствительными к изменению кислотности среды и приводит к их диссоциации и полному разрушению в той области рН, где один из полимерных компонентов теряет свой заряд. Значимость рН как фактора, контролирующего стабильность полиэлектролитных комплексов, заметно возрастает, если в качестве слабого полиэлектролита использовать полимер, способ-
691
8*
ный образовывать водородные связи. Так, в трех-компонентных системах, содержащих слабую карбоксилсодержащую поликислоту (полиакриловую или полиметакриловую), слабое полиоснование (поли-2-винилпиридин или олигоэтилен-имин) и полимер, способный образовывать водородные связи (полиэтиленгликоль), реакционная способность полимерных компонентов и природа образующихся комплексов существенно зависят от рН раствора [2]. В кислой среде, где слабая поликислота находится преимущественно в недис-социированной форме, ее взаимодействие с поли-этиленгликолем приводит к возникновению комплекса, стабилизированного межмолекулярными водородными связями. В нейтральной области и слабая поликислота, и слабое полиоснование частично заряжены, и это создает условия для образования еще и полиэлектролитного комплекса. В щелочной среде, где слабая поликислота полностью ионизована, а слабое полиоснование незаря-жено, взаимодействие между компонентами отсутствует вовсе.
Способность карбоксильных групп поликар-боновых кислот взаимодействовать друг с другом за счет образования водородных связей открывает дополнительные возможности регулирования стабильности полиэлектролитных комплексов изменением кислотности среды. В настоящей работе исследованы пары, составленные из различных карбоксилсодержащих полианионов и их положительно заряженных партнеров. В подавляющем большинстве случаев они обладали высокой чувствительностью к изменению рН, существенно упрочняясь в нейтральных и слабокислых средах. Совокупность полученных в работе данных дополняет результаты проведенных ранее исследований [3-5] и свидетельствует в пользу того, что этот эффект обусловлен стабилизацией полиэлектролитного комплекса системой водородных связей, формируемой карбоксильными группами частично заряженного полианиона. Резкое и обратимое изменение устойчивости систем при благоприятных для функционирования биополимеров pH и ионной силе раствора (белков, ферментов, антител, нуклеиновых кислот и т.п.) делает поликарбоксилатные полиэлектролитные комплексы особенно привлекательными для решения важных прикладных задач, например в
биотехнологии для разделения биологических смесей.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы
Буферные соли MES (2-[К-морфолино]этан-сульфоновая кислота), HEPES (К-[2-оксиэтил]пи-перазин-№-[2-этансульфоновая кислота]) и TRIS (трис(гидроксиметил)аминометан), а также NaCl и NaOH фирмы "Sigma" (США) использовали без дополнительной очистки. Растворы готовили в бидистиллированной воде.
Поликатионы
3,3-, 6,6- и 10,10-Ионен бромиды. Образцы ионен бромидов с среднечисленной степенью полимеризации 80, 110 и 100 соответственно были синтезированы, фракционированы и охарактеризованы по методике [6].
Поли-^этил-4-винилпиридиний бромиды
(ПЭП-Р). Образцы ПЭП-Р с различной степенью алкилирования в получали алкилированием по-ли-4-винилпиридина бромистым этилом. Использовали фракции поли-4-винилпиридина со сред-невесовыми степенями полимеризации 100, 340 и 900, измеренными светорассеянием, а также оли-гомерные фракции со среднечисленными степенями полимеризации 10, 20 и 30, определенными эбуллиоскопией. Степень алкилирования полимеров определяли ИК-спектроскопией [7].
Полианионы
Полиметакриловая кислота. Использовали олигомерный образец ПМАК фирмы "Fluka" (Швейцария) среднечисленной степени полимеризации 80 (ПМАК80) и относительно высокомолекулярные образцы ПМАК215 и ПМАК1840 фирмы "Polysciences" (США).
Полиакриловая кислота. Исследовали образцы ПАК степени полимеризации 30, 70 и 2360 фирмы "Aldrich" (США).
Сополимер дивинилового эфира и малеиново-го ангидрида (ДИВЭМА). Образец гидролизован-ного ДИВЭМА средневесовой степени полимеризации 820 был синтезирован из соответствующих
мoнoмepoв по peaкции paдикaльнoй циклосопо-лимepизaции. Пoлимep пoлyчeн и oxapa^ep^o-ван M.û. Гopшкoвoй (ИHXC им. A.В. Toпчиeвa PAH).
Полигалактуроновая кислота (ПГК) и поли-итаконовая кислота (ПИК). Использовали o6pa-зeц ПГK фиpмы "Aldrich" (CШA) и oбpaзeц ПИK фиpмы "Polysciences" (CMA).
Глoбyляpныe белku
Использовали кoммepчecкиe пpeпapaты лизо-цима (Lys) из кypиныx яиц, а тaкжe бычьeгo у-глoбyлинa (IgG) и pибoнyклeaзы A (RNase) из пoджeлyдoчнoй жeлeзы быка фиpмы "Sigma-Aldrich" (CMA) в видe лиофилизованных oбpaзцoв 95-98%-ной чистоты.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Typбuдuмempuчecкoe mumpoвaнue
Typбидимeтpичecкoe титpoвaниe ocyщecтвля-ли на cпeктpoфoтoмeтpe "Hitachi 150-20" (Япония) пocлeдoвaтeльным дoбaвлeниeм кoнцeнтpи-poвaннoгo pacraopa xлopиcтoгo нaтpия в cмecь pacraopoB пoлимepныx кoмпoнeнтoв с и^^ва-лом в 2 мин. Tитpoвaниe пpoвoдили нeпocpeд-cтвeннo в квapцeвoй кювeтe пpи постоянном да-peмeшивaнии и комнатной тeмпepaтype, измepяя oптичecкyю плотность пpи длинe волны 320 нм. В oтдeльныx опытах в кaчecтвe титpaнтa использовали pacтвop бyфepa.
Пoлиэлeктpoлитныe кoмплeкcы готовили пocpeдcтвeннo пepeд измepeниeм, cмeшивaя в кю-вeтe paвныe oбъeмы pacтвopoв пoликapбoкcи-латного аниона и поликатиона в бyфepe (MES, HEPES или TRIS). Бyфep пpeдвapитeльнo доводили до нужного знaчeния pH дoбaвлeниeм кон^н-тpиpoвaнныx pacтвopoв HCl или NaOH. Для ис-cлeдoвaния слабокислых pacraopoB использовали 0.05 M pacтвopы MES, а нeйтpaльныe и cлaбoщe-лочныге pacтвopы кoмпoнeнтoв готовили в 0.05 M pacraopax HEPES и TRIS cooтвeтcтвeннo. Ko^ цeнтpaция кapбoкcильныx ^упп полианиона в cмecяx составляла 4 x 10-4 моль/л.
Koмплeкcы с бeлкaми готовили аналогичным oбpaзoм, но пpeдвapитeльнo находили cooтнoшe-
ние белок/поликислота, соответствующее максимальной мутности. Для этого проводили турбиди-метрическое титрование раствора поликарбокси-латного аниона концентрированным раствором белка (0.05 M HEPES, pH 6.0). Найденное соотношение компонентов использовали при приготовлении смесей белок/поликислота. Концентрация карбоксильных групп полианиона в смесях составляла 4 х 10-4 моль/л.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Стабильность комплексов оценивали по их устойчивости в растворах хлористого натрия. Для этого проводили турбидиметрическое титрование растворов смесей полиионов, содержащих эк-вимольные количества ионогенных групп, концентрированным раствором соли. Точку, соответствующую полному исчезновению мутности, определяли спектрофотометрически по отсутствию оптического поглощения при длине волны 320 нм, т.е. в области спектра, где ни один из полимерных компонентов не поглощал свет. Мольную концентрацию соли, при которой достигалось полное растворение, обозначали [№0]*. В специальных экспериментах ту же точку находили титрованием раствором буфера прозрачных смесей полимерных компонентов, заранее приготовленных в концентрированных солевых растворах. Значения [№0]* при прочих равных условиях не зависели от использованного титран-та (соли или буфера). Это свидетельствует о том, что за время проведения опытов в системах успевало установиться равновесное состояние, и дает основание использовать значения [№0]*, найденные из турбидиметрических кривых, в качестве критерия устойчивости полиэлектролитного комплекса. Отметим, что этот критерий не является строгим. По данным флуориметрического титрования и скоростной седиментации [8], полное разделение компонентов полиэлектролитного комплекса достигается при более высокой концентрации вводимого низкомолекулярного электролита, а при концентрации [№0]* происходит только растворение комплекса из-за глубокого разрушения системы межмакромолекулярных солевых связей. Однако разница в концентрации соли, соответствующей этим двум критическим точкам, невелика и составляет обычно 10-15%,
Рис. 1. рН-Зависимость критической концентрации хлористого натрия, соответствующей полному растворению эквимольных смесей ПМАК1840 и ПЭП-Р340 со степенью алкилирова-ния в = 95 (1), 55 (2) и 40% (3). сПМАК = 4 х 10-4 осново-моль/л. Т = 20°.
Рис. 2. рН-Зависимость критической концентрации хлористого натрия, соответствующей полному растворению эквимольных смесей ПМАК1840 и п,п-ионен бромида, имеющего п =
= 3 (1), 6 (2) и 10 (3). сПМАК = 4 х 10"4 осново-моль/л. Т = 20°.
что позволяет использовать данные турбидимет-рического титрования для оценки стабильности полиэлектролитных комплексов.
На рис. 1 приведены результаты турбидимет-рического титрования эквимольных смесей ПМАК с высокомолекулярным поли-К-этил-4-винилпиридиний бромидом одинаковой степени полимеризации (ПЭП-Р340), но различной степени алкилирования р. Данные представлены в виде зависимости концентрации соли, отвечающей точкам помутнения, от рН раствора. Видно, что в нейтральных средах при рН > 6.9 значения [КаС1]* практически не зависят от рН, а расположение кривых 1-3 соответствует ожидаемому росту стабильности комплексов с ростом р, т.е. с увеличением плотности заряженных четвертичных пиридиниевых групп на цепях поликатионов. Ситуация меняется на прямо противоположную при рН < 6.9, где подкисление среды вызывает резкое возрастание значений [КаС1]*, а более устойчивыми к действию соли оказываются комплексы, образованные поликатионами с меньшей р. В этом легко убедиться, сравнивая значения [КаС1]*, полученные для различных ПЭП-Р при фиксированном рН. С увеличением Р стабилизация комплексов происходит в более кислой среде, хотя даже в случае практически полностью алки-
лированого ПЭП-95 (кривая 1) она наблюдается в близком к нейтральной области интервале 5.7 < < рН < 6.1. Ранее [3] мы уже отмечали значительное упрочнение водорастворимого НПЭК (ПМАК/ПЭП-Р) в слабокислых средах, которое также было выражено наиболее ярко для поликатионов с наименьшей степенью алкилирования. Этот эффект связывали с протонированием неал-килированных звеньев поликатиона, включенного в состав НПЭК и со стабилизацией комплекса за счет вновь образующихся ионных пар с карбоксилатными анионами. Высказывалось также предположение о возникновении комплексов с переносом заряда между карбоксильной группой ПМАК и неалкилированной пиридиновой группой ПЭВП-р. Эти комплексы могли вносить свой вклад в упрочнение комплексных частиц. Однако результаты исследований смесей ПМАК с п,п-ионен бромидами (рис. 2) свидетельствуют о том, что не эти факторы лежат в основе стабилизации комплексов. Ионеновые поликатионы несут в основных цепях исключительно четвертичные аминогруппы, разделенные последовательностями из п-метиленовых групп. Такие аминогруппы заряжены при любом рН и потому могут принимать участие лишь в кулоновских взаимодействиях. Тем не менее, приведенные на
рис. 2 профили устойчивости комплексов ПМАК с ионен бромидами, различающимися плотностью заряда на цепях, подчиняются тем же закономерностям. Плотность заряда ионенов определяется количеством метиленовых групп в развязках, и увеличение их числа от трех (кривая 1) до шести (кривая 2) и, наконец, до десяти (кривая 3) приводит к тем же последствиям, что и уменьшение степени алкилирования ПЭП-Р (рис. 1), а именно: при фиксированном рН в нейтральных средах значения [КаС1]* закономерно уменьшаются, тогда как в слабокислых средах наблюдаются резкий рост стабильности комплексов и инверсия хода кривых.
Для понимания механизма такой стабилизации комплексов важными являются результаты работ по изучению полиэлектролитных многослойных пленок [4, 5]. Пленки, сформированные многократной попеременной адсорбцией на подложку ПЭП-Р и ПМАК из их разбавленных растворов, проявляли высокую устойчивость к действию хлористого натрия в слабокислых средах. Профили разрушения пленок и комплексов, составленных из тех же компонентов (рис. 1), практически совпадают. У пленок, приготовленных из ПЭП-Р и полиакриловой кислоты, наблюдалась та же зависимость изменения стабильности от степени алкилирования поликатиона, но профили разрушения смещались почти на единицу рН в кислую область. Наиболее интересный результат получен при анализе состояния ионо-генных групп поликислот в пленках. Оказалось, что если массив данных по разрушению пленок ПАК/ПЭП-Р или ПМАК/ПЭП-Р представить в виде зависимости критической концентрации соли от степени ионизации поликислоты, то экспериментальные точки укладываются на общую кривую, причем резкое упрочнение пленок наступает, когда доля ионизованных групп поликислоты снижается до половины [4]. Иными словами, стабильность комплекса определяется степенью ионизации поликарбоксилатного аниона, включенного в комплекс. Следует особо отметить, что степень ионизации поликислоты в комплексе, как правило, не совпадает со степенью ионизации свободной поликислоты в растворе. Будучи в связанном с поликатионом состоянии и испытывая влияние его положительно заряженных групп, слабая поликислота ионизуется в более кислых
средах [1]. С ростом плотности заряда на цепях поликатиона это влияние возрастает, что находит свое отражение в сдвиге профилей разрушения комплексов в кислые среды (рис. 1, 2). Очевидно также, что в случае поликарбоксилатного полимера с большей кислотностью его ионизация в комплексе должна осуществляться при меньших значениях рН. Соответственно профили разрушения комплексов на основе полиакриловой кислоты, имеющей (по разным данным) рКа ~ 5-6, располагаются в более кислой области по сравнению с аналогичными кривыми, полученными для ПМАК с рКа ® 6-7.
Совокупность этих данных позволяет отнести наблюдаемый эффект за счет формирования системы водородных связей, включающей в себя протонированные карбоксильные группы, которая армирует полиэлектролитный комплекс и препятствует его разрушению под воздействием вводимой соли. В основе такого механизма стабилизации лежит известная способность поликар-боновых кислот образовывать устойчивые водородные связи, циклические димеры и олигомер-ные ассоциированные структуры, которые обнаруживаются не только в пленках [9], но и в водных растворах [10].
Мы исследовали пары полиионов, состоящие из ПЭП-95 и различных карбоксилсодержащих поликислот (рис. 3). Во всех случаях, кроме одного (кривая 5), наблюдался тот же эффект значительного упрочнения комплексов при подкисле-нии растворов. Расположение кривых 1-4 по оси абсцисс следует упомянутому выше принципу, смещаясь влево с уменьшением рКа поликислот, образующих комплекс. Однако ход кривых, будучи практически тем же для комплексов ПАК (кривая 3) и ПМАК (кривая 2), в остальных случаях различается. Так, для ПГК, имеющей рКа ~ 5 [11], упрочнение комплекса осуществляется наиболее кооперативно, тогда как в нейтральных средах этот комплекс оказывается наименее устойчивым к действию соли (кривая 4). И то и другое может быть обусловлено действием сте-рического фактора. Как известно, цепь ПГК отличается высокой жесткостью. Это должно препятствовать подстраиванию компонентов комплекса друг к другу и, следовательно, снижать его стабильность из-за увеличения расстояния между
рН
Рис. 3. рН-Зависимость критической концентрации хлористого натрия, соответствующей полному растворению эквимольных смесей ПЭП-95900 и полианиона ПИК (1), ПМАК (2), ПАК (3), ПГК (4) и ДИВЭМА (5). сПЭП-95 = 4 х х 10-4 осново-моль/л. Т = 20°.
зарядами в ионных парах. По той же причине жесткость цепей ПГК может затруднять образование армирующей сетки водородных связей в комплексе, формирование которой сдвигается в кислые среды. Как следствие, на кривой 4 практически отсутствует переходная область с постепенным возрастанием стабильности комплекса, которая предшествует его резкому упрочнению.
Такая переходная область присутствует на остальных кривых и выражена наиболее ярко в случае полиитаконовой кислоты (рис. 3, кривая 1), имеющей pKa ~ 7.2 [12]. В повторяющихся звеньях ПИК у одного атома углерода присутствуют а- и Р-СООН-группы. Иными словами, в этой поликислоте такой же интервал между карбоксильными группами вдоль хребта макромолекулы, как в ПАК или ПМАК, но плотность заряда в 2 раза больше. Поскольку обе карбоксильные группы звена ПИК стерически доступны для межмолекулярного взаимодействия, стабильность ее комплекса с поликатионом относительно велика, а переходная область, отражающая зарождение и рост фрагментов армирующей сетки водородных связей, расположена в нейтральных средах (кривая 1). Особым образом вел себя комплекс, в котором роль поликислоты играл гидролизованный сополимер дивинилового эфира и малеинового
ангидрида. Плотность карбоксильных групп в цепях ДИВЭМА, имеющего pKa ~ 7 [13], сравнима и даже выше, чем в цепях ПАК и ПМАК. Тем не менее вместо ярко выраженного упрочнения в этой системе наблюдается относительно невысокий рост стабильности комплекса при подкисле-нии раствора (кривая 5). Этот результат легко объясним в рамках предложенного механизма стабилизации комплекса, если учесть склонность соседних по цепи карбоксильных групп ДИВЭМА образовывать пары, стабилизированные водородными связями [14]. Очевидно, что участие таких связанных групп в формировании прочной пространственной сетки в комплексе затруднительно, если вообще возможно.
Полученные нами данные по влиянию степени полимеризации полимеров на устойчивость полиэлектролитных комплексов (рис. 4-6) также согласуются с предлагаемым механизмом их стабилизации. В системе ПЭП-95/ПАК (рис. 4) при использовании высокомолекулярной поликислоты ПАК2360 обсуждаемый эффект наблюдается вполне отчетливо (кривая 3). Однако для относительно коротких цепей ПАК70 (кривая 2) и ПАК30 (кривая 1) профили разрушения комплекса вырождаются в пологие кривые, располагающиеся друг под другом в соответствии с уменьшающейся ММ поликислоты. Похожим образом ведут себя комплексы ПЭП-95/ПМАК (рис. 5), но для них резкий рост устойчивости реализуется для образцов поликислоты ПМАК1840 (кривая 3) и ПМАК215 (кривая 2), а вырождение наступает в случае короткой ПМАК80 (кривая 1).
Таким образом, для надежной стабилизации комплексов необходимо использовать поликислоты, цепи которых содержат не менее двухсот звеньев. Если учитывать, что резкое упрочнение комплексов наступает при содержании в них примерно равных количеств ионизованных и неиони-зованных карбоксильных групп [4], и полагать, что карбоксилатные анионы электростатически связаны с поликатионами и не участвуют в образовании водородных связей, то минимальное число неионизованных карбоксильных групп, способных стабилизировать комплекс, снижается до сотни. Иными словами, даже такая грубая оценка приводит к числу карбоксильных групп 50-100, обеспечивающему поликислотам их кооператив-
[NaCl]*, моль/л 3 Ь
5
6 pH
Рис. 4. рН-Зависимость критической концентрации хлористого натрия, соответствующей полному растворению эквимольных смесей
ПЭП-95
900
ПАК
степени полимеризации
30 (1), 70 (2) и 2360 (3). сПЭП-95 = 4 х 10 моль/л. T = 20°.
1-4
осново-
[NaCl]*, моль/л 3h
5.5
6.0
6.5 pH
Рис. 5. рН-Зависимость критической концентрации хлористого натрия, соответствующей полному растворению эквимольных смесей ПЭП-95100 и ПМАК степени полимеризации
80 (1), 215 (2) и 1840 (3). сПЭП-95 = 4 х 10 моль/л. T = 20°.
осново-
2
2
1
1
1
и
ное связывание с партнерами за счет водородных связей [15]. Следовательно, поликислоты, состоящие из двухсот звеньев, уже способны взаимодействовать между собой в полиэлектролитном комплексе, армируя его достаточно прочной сеткой водородных связей.
Другим аргументом в пользу рассматриваемого механизма является принципиально иное поведение комплексов, образованных высокомолекулярной ПМАК1840 и ПЭП-95 различной длины (рис. 6). Снижение степени полимеризации поликатиона с 900 (кривая 5) до 100 (кривая 4) не только не приводит к отмене эффекта стабилизации, но и практически не влияет на расположение профиля разрушения комплекса по оси абсцисс. Более того, при переходе к олигомерным положительно заряженным цепям, содержащим 30, 20 и даже 10 звеньев (кривые 3,2 и 1 соответственно), явление резкого роста устойчивости комплексов сохраняется, хотя уменьшение степени полимеризации сопровождается последовательным сдвигом кривых в кислую область. Этот результат еще раз подчеркивает главенствующую роль поликислот в стабилизации комплекса, которая, по всей вероятности, осуществляется по изложенному выше механизму. Для высокомолекулярного полимера с достаточным количеством неионизо-ванных карбоксильных групп хватает всего не-
скольких положительно заряженных групп у партнера, чтобы связаться с ним и образовать устойчивый комплекс, даже если в нейтральных средах, где поликислота полностью ионизована, такой комплекс разрушается при введении первых порций соли (рис. 6, кривая 1).
В полном соответствии с этим выводом находятся результаты аналогичных экспериментов, проделанных нами с комплексами высокомолекулярных ПМАК1840 и ПАК2360, в которых партнерами поликислот служили не синтетические поликатионы, а глобулярные белки (рис. 7). Наряду с лизоцимом (pI 11.0) и рибонуклеазой (pI 9.4), отличающимися высокими значениями изоэлектри-ческих точек, в качестве модельного белка использовали иммуноглобулин G с pI 6.5. На поверхности белковых глобул находится сравнительно небольшое количество ионоген-ных групп, способных к образованию солевых связей с поликислотами. Так, для Lys и RNase, имеющих близкие ММ (14306 и 13682 Да), число таких групп одинаково и равно 19. Подкисление растворов вызывает существенное упрочнение комплексов белок/поликислота, которое и в этом случае происходит в более кислых средах при замене ПМАК (рис. 7а) на ПАК (рис. 76). Судя по результатам определения степени ионизации поликислот в многослойных пленках, приготовлен-
рН
Рис. 6. рН-Зависимость критической концентрации хлористого натрия, соответствующей полному растворению эквимольных смесей ПМАК1840 и ПЭП-95 степени полимеризации 10 (1), 20 (2), 30 (3), 100 (4) и 900 (5). сПМАК = 4 х х 10"4 осново-моль/л. Т = 20°.
ных из пар, содержащих белки [5], стабилизация белковых комплексов, как и комплексов поликатион/поликислота [4], целиком контролируется этим параметром. Однако для таких систем критическая степень ионизации поликислоты в комплексе оказалась гораздо ниже 50% и не превышала 10-20% для разных пар белок/поликислота. Столь значительное различие в степени ионизации поликислот, стабилизирующих тот или иной комплекс, разумно объяснить разницей в кон-формациях их партнеров. При одном и том же числе заряженных групп на белковой глобуле и на линейном полиэлектролите количество ионных пар белок/поликислота меньше, чем может реализоваться при взаимодействии гибких комплементарных высокозаряженных цепей. Кроме того, жесткая фиксация ионогенных групп на поверхности белковой глобулы затрудняет образование максимального числа их контактов с цепью. А если принимать во внимание еще и сравнительно невысокое содержание ионогенных групп в белках, становится понятной низкая устойчивость их комплексов в нейтральных средах (рис. 7). Тем не менее даже такого малого числа групп, доступных для взаимодействия с высокомолекулярной поликислотой, оказывается достаточным для образования прочных белок-полиэлектролитных комплексов в слабокислых
средах. Однако, как и в случае олигомерных катионов (рис. 6, кривая 1), для стабилизации столь чувствительных к ионной силе комплексов требуется более плотная сетка водородных связей, которая формируется при более низких значениях рН (рис. 7).
Таким образом, из полученных в работе данных следует, что рассматриваемый эффект стабилизации комплексов носит общий характер, он присущ широкому кругу систем, составленных из пар обычно используемых поликарбоксилатных анионов и их положительно заряженных партнеров. Важно, что этот эффект проявляется в слабокислых и нейтральных средах и полностью обратим. В специальных опытах мы установили, что введение в реакционные смеси раствора щелочи или кислоты практически не влияет на профиль разрушения комплексов.
Оба эти обстоятельства делают поликарбок-силатные комплексы особенно привлекательными для решения прикладных задач молекулярной биологии и биотехнологии. Поскольку включение фермента в НПЭК путем его ковалентного связывания с одним из полиэлектролитов не приводит ни к заметной потере каталитической активности, ни к изменению свойств самого НПЭК [16], можно ожидать, что фермент, иммобилизованный таким образом в комплекс поликарбокси-латного аниона с поликатионом, тоже будет проявлять высокую чувствительность к изменению рН. Более того, если изоэлектрическая точка белка достаточно высокая, трудоемкую стадию его ковалентного связывания с полиионом можно избежать. Простым добавлением раствора поли-карбоновой кислоты можно придать такому белку (ферменту) ту же способность обратимо переходить из осадка в раствор в узком интервале изменения рН, причем в условиях, благоприятных для функционирования биополимеров (ферментов, антител, нуклеиновых кислот и т.п.). Ранее [16] мы использовали кооперативность фазовых переходов в растворах НПЭК для создания обратимо растворимых иммобилизованных ферментов, позволяющих осуществлять ферментативную реакцию в растворе, пользуясь всеми преимуществами гомогенного катализа, а затем выводить иммобилизованный фермент из сферы реакции небольшим изменением рН. По всей видимости, в смесях с высокомолекулярным поли-
Рис. 7. рН-Зависимость критической концентрации хлористого натрия, соответствующей полному растворению смесей ПМАК1840 (а) или ПАК2360 (б) и глобулярного белка RNase (1), IgG (2) и Lys (3). Спмак = спак = 4 х 10-4 осно-во-моль/л. T = 20°.
карбоксилатным анионом, в которых фермент может быть использован как сам по себе, так и в виде конъюгата с поликатионом, гомогенный катализ можно проводить в нейтральных или слабокислых средах, если концентрация соли достаточно высока. В этом случае отделение иммобилизованного (или химически не связанного) белка от продукта ферментативной реакции легко осуществимо, поскольку фермент можно перевести в осадок незначительным подкислением среды или простым разбавлением реакционной смеси.
Возможность существования поликарбокси-латных комплексов в растворах с высокой ионной силой может быть положена в основу разработки еще одного интересного и важного практического приложения, связанного с выделением нуклеиновых кислот из биологических смесей. Не обладающие способностью к стабилизации комплексов по упомянутому выше механизму,
нуклеиновые кислоты должны терять связавшиеся с ними компоненты (гистоны, белки и т.п.) при достаточно высокой концентрации соли, когда те же компоненты образуют устойчивые комплексы с поликарбоновой кислотой. Подбором рН и ионной силы растворов может быть реализовано наиболее полное отделение целевой нуклеиновой кислоты (например, плазмиды). Результаты предварительных экспериментов по исследованию конкурентных интерполиэлектролитных реакций в таких смесях подтверждают плодотворность этого подхода.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Кабанов В.А. // Высокомолек. соед. А. 1994. Т. 36. № 2. С. 183.
2. Abe K, KoideM, Tsuchida E. // Macromolecules. 1977. V. 10. № 6. P. 1259.
3. Изумрудов В.А., Рыкунова А.И., Синицын А.А. // Вестн. МГУ. Сер. 2, Химия 1993. Т. 34. С. 405.
4. Izumrudov VA., Sukhishvili SA. // Langmuir. 2003. V. 19. № 13. P. 5188.
5. Izumrudov VA, Kharlampieva E., Sukhishvili SA. // Biomacromolecules. 2005. V. 6. № 3. P. 1782.
6. Zelikin A.N., Akritskaya N.I., Izumrudov VA. // Macro-mol. Chem. Phys. 2001. V. 202. № 15. P. 3018.
7. Starodubtsev S.G., Kirsh Yu.E., Kabanov VA. // Eur. Polym. J. 1977. V. 10. № 3. P. 739.
8. Izumrudov VA, Wahlund P.-O, Gustavsson P.-E, Larsson P.-O., Galaev I.Yu. // Langmuir. 2003. V. 19. № 11. P. 4733.
9. Dong J, Ozaki Y, Nakashima K. // Macromolecules. 1997. V. 30. № 4. P. 1111.
10. Tanaka N., Kitano H., Ise N. // Macromolecules. 1991. V. 24. № 10. P. 3017.
11. Мейчик Н.Р., Ермаков И.П. // Биохимия. 2001. Т. 66. № 5. С. 556.
12. Kawaguchi S., Nishikawa Y., Kitano T., Ito K. // Macromolecules. 1990. V. 23. № 10. P. 2710.
13. Levine HI, Mark EH, Fiel R.J. // Arch. Biochem. Bio-phys. 1977. V. 184. P. 156.
14. Горшкова М.Ю., Лебедева Т.Л., Стоцкая Л.Л. // Изв. РАН. Сер. хим. 1996. № 7. С. 1719.
15. Papisov IM, Litmanovich AA. // Adv. Polym. Sci. 1989. V. 90. P. 139.
16. Margolin A. L., Sherstyuk S. F., Izumrudov V.A ., Sve-das V.K., Zezin A.B., Kabanov VA. // Eur. J. Biochem. 1985. V. 146. № 3. P. 625.
Polyelectrolyte Complexes of Carboxyl-Containing Polyanions: Stabilization in Neutral and Weakly Acidic Media and Factors Affecting This Phenomenon
V. A. Izumrudov
Faculty of Chemistry, Moscow State University, Leninskie gory, Moscow, 119992 Russia e-mail: izumrud@genebee.msu.su
Abstract—The stability of insoluble polyelectrolyte complexes formed by various carboxyl-containing polyanions with a positively charged partner—a linear polycation or protein—has been studied by means of turbi-dimetric titration. In most cases, acidification of the reaction medium leads to a significant strengthening of complexes toward the action of the added salt in neutral or weakly acidic media. The data concerning the effect of the chemical nature of polymer components, the degree of polymerization, the density of charge, and the structure of their chains on the pH-dependent profiles of complex dissociation provide evidence that this effect is related to stabilization of the polyelectrolyte complex through the system of hydrogen bonds formed by car-boxyl groups of a partially charged polyanion incorporated into the complex. Owing to a sharp and reversible change in the stability of systems at a pH and ionic strength of solution that are favorable for functioning of biopolymers (proteins, enzymes, antibodies, and nucleic acids), polycarboxylate polyelectrolyte complexes offer promise for solving practically important problems, for example, in biotechnology for separation of biological mixtures.
