CC BY
200
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 575.22
Секвенирование полного митохондриального генома древнего человека, представителя новосвободненской культуры, указывает на ее возможную связь с культурой воронковидных кубков
А. В. Недолужко1*, Е. С. Булыгина1, А. С. Соколов1, С. В. Цыганкова1, Н. М. Груздева1,
А. Д. Резепкин3, Е. Б. Прохорчук1,2*
Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», 123182, Москва, пл. Акад. Курчатова, 1
2Центр «Биоинженерия» РАН, 117312, Москва, просп. 60-летия Октября, 7, корп. 1 3Институт истории материальной культуры РАН, 191186, С.-Петербург, Дворцовая наб., 18 *E-mail: nedoluzhko@gmail.com, prokhortchouk@biengi.ac.ru Поступила в редакцию 25.12.2013 После доработки 20.03.2014
РЕФЕРАТ Методом широкомасштабного секвенирования впервые в России проанализирована полная последовательность митохондриального генома древнего человека - представителя новосвободненской археологической культуры. История изучения памятников эпохи ранней бронзы на Северном Кавказе насчитывает более 110 лет. Большинство археологов выделяют здесь единственную майкопскую культуру с двумя этапами развития, сформированную выходцами из Передней Азии в 3700-3600 годах до н. э. Однако характер ряда археологических находок, сделанных в 1979-1991 годах в станице Новосвободная (Республика Адыгея), и их сходство с артефактами культуры воронковидных кубков позволили предположить происхождение, отличное от майкопской культуры. В представленной работе с помощью методов геномного анализа изучены костные останки человека, найденные в районе станицы Новосвободной, возраст которых превышает 5500 лет. Однонуклеотидные полиморфизмы, обнаруженные в митохондриальном геноме этого человека, позволили отнести исследуемый образец к митохондриальной гаплогруппе V7. Таким образом, анализ полной нуклеотидной последовательности митохондриальной ДНК из костных останков, публикуемый в данной работе, в сочетании с результатами изучения археологических артефактов позволяет рассматривать найденные в станице Новосвободная артефакты как самостоятельное явление (археологическую культуру), тесно связанное с культурой воронковидных кубков.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА новосвободненская культура, майкопская культура, гаплогруппа, митохондриальная ДНК, секвенирование.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ мтДНК - митохондриальная ДНК; ОП - однонуклеотидный полиморфизм.
ВВЕДЕНИЕ
С конца 1970-х годов по мере накопления археологического материала в научной среде определились две точки зрения на генезис памятников эпохи ранней бронзы на Северном Кавказе. Первая из них предполагает существование единой майкопской культуры с двумя этапами развития [1 — 3], включая находки, сделанные в станице Новосвободная (бывшая Цар-
ская). Вторая гипотеза рассматривает археологические артефакты, найденные в окрестностях станицы Новосвободная, как самостоятельное явление (культуру). В ходе археологических исследований подкурганного могильника «Клады» вблизи станицы Новосвободная, проведенных в 1979-1991 годах под руководством А.Д. Резепкина, были раскопаны 22 кургана, в которых нашли 93 хорошо стратифи-
Азовское
море
р. Калаус
Черное море
Рис. 1. Ареал ново-свободненских памятников на Северном Кавказе (отмечен черными точками). Район раскопок подкур-ганного могильника «Клады» вблизи станицы Новосвободная в Республике Адыгея (отмечен звездочкой) и костный материал, использованный для выделения ДНК
цированных погребения. Этот материал позволяет не только построить относительную и абсолютную хронологию артефактов Новосвободной, но и вплотную приблизиться к решению проблемы происхождения новосвободненской культуры [4, 5].
В последние годы методы современной геномики широко используются для решения ряда археологических [6-10] и палеонтологических загадок [11-15]. Зачастую в подобных работах анализируют митохондриальную ДНК (мтДНК), особенности которой делают ее незаменимым инструментом изучения эволюции человека: наследование по материнской линии; относительно высокая копийность; быстрое по сравнению с ядерным геномом накопление мутаций; отсутствие рекомбинации; относительно хорошая сохранность этой молекулы в костных останках древних людей, поскольку ядерная ДНК деградирует как минимум в 2 раза быстрее митохондриальной [16, 17].
В данной работе мы представляем полную нуклеотидную последовательность митохондриального генома представителя новосвободненской культуры. Результаты анализа позволяют предположить общность этой культуры с культурой воронковидных кубков. Нами установлено, что представитель ново-свободненской археологической культуры принадлежит к митохондриальной гаплогруппе V7.
экспериментальная часть
ДНК была выделена из зубов человека, обнаруженных во время археологических раскопок под-курганного могильника «Клады» вблизи станицы Новосвободная (Республика Адыгея) экспедицией Института истории материальной культуры РАН
(Санкт-Петербург). Возраст останков датируется второй третью - концом 4 тысячелетия до н. э. (рис. 1).
Выделение ДНК, приготовление и секвенирование ДНК -библиотек
Древнюю ДНК выделяли из растертой в порошок костной ткани человека в специальных условиях, исключающих контаминацию современной ДНК. Использовали протеиназу К (New England Biolabs, США) и кремниевые шарики (Sigma-Aldrich, США) согласно протоколу, описанному Л. Орландо с соавт. [18]. ДНК-библиотеки готовили с использованием набора NEBNext Quick DNA Library Prep Master Mix set for 454 (New England Biolabs), используя адаптер-ные последовательности для секвенирования на приборах Illumina, согласно стандартному протоколу, предложенному производителем. Качество и концентрацию библиотек определяли с помощью 2100 Bioanalyser (Agilent, США) и HS Quibit (Invitrogen, США). Для обогащения фракции мтДНК использовали набор FleXelect Mitochondrial DNA enrichmеnt kit (Flexgen, Нидерланды) с перекрыванием олигону-клеотидных зондов от 10 до 40% (подробный список олигонуклеотидных зондов для обогащения мтДНК доступен по запросу). ДНК-библиотеки секвенирова-ли на геномном анализаторе Illumina GAIIx с использованием парных чтений (paired-end sequencing), с длиной чтений 50 нуклеотидов.
Биоинформатический анализ
Полученные чтения картировали на митохондриальном геноме (NC_012920.1) с помощью программы Bowtie 2 версии 2.1.0 с параметром very-sensitive [19].
Гипервариабельные регионы
Глубина покрытия Контиги
1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 12000 13000 14000 15000 16000
HVR1 HVR2
Рис. 2. Результаты секвенирования и сборки митохондриального генома
Длина последовательности
і
<и
5
га
m
га
и
га
X
0.15
0.10
0.05
0.00
Позиция от 5'-конца
Позиция от З'-конца
Рис. 3. Частота замен в ДНК-библиотеке. Тест на контаминацию современным генетическим материалом
Тест на древность ДНК проводили с использованием программы mapDamage 2.0 [20]. Согласно модели постмортальных изменений, построенной с помощью данной программы, скорректировано качество тех позиций в чтениях, которые могут содержать модификации. Другими словами, нуклеотидам, которые могут быть результатом замены С ^ Т или G ^ А, присваивалось худшее значение качества, чем в оригинальном чтении, и они не принимались во внимание при анализе однонуклеотидных полиморфизмов (ОП), характерных для исследуемого образца. Для поиска ОП применяли программное обеспечение VarScan версии 2.2.3, с помощью которого отбирали ОП с р < 0.01 [21]. Митохондриальную гаплогруппу определяли по отобранным ОП, используя сервис HaploGrep [22]. De novo-сборку митохондриального генома представителя новосвободненской культуры проводили с помощью программы AbySS версии 1.3.6. с длиной К-мера, равной 22 нуклеотидам [23].
результаты и обсуждение
Из геномных библиотек древнего человека были отобраны последовательности мтДНК. В результате
секвенирования обогащенных библиотек получено 58771105 чтений, большая часть которых (99.994%) имела экзогенное (бактериальное) происхождение, что нормально для подобных исследований [24], а также может объясняться сходством геномов бактерий и митохондрий. Картирование чтений на рефе-ренсный митохондриальный геном (hg19) позволило покрыть его в среднем в 13.4Х - всего картировалось 3422 чтения (0.006%) (рис. 2).
Известно, что древняя ДНК со временем деградирует до небольших фрагментов, а остатки цитозина (С), расположенные на концах этих фрагментов, дезаминируются до урацила (и) и в ходе подготовки пробы (ПЦР) превращаются в тимин (Т) [25]. Частота концевых замен С ^ Т в образцах, чей возраст превышает 300 тысяч лет, может достигать 60% и выше [15, 26]. В то же время при секвенировании современной ДНК уровень концевых замен не превышает 0.5% (данные не приведены). Частоту концевых замен оценивали с использованием программы mapDamage 2.0. В образце из станицы Новосвободная частота концевых замен С ^ Т в 3'- и 5'-концах ДНК-библиотеки превышала 30% (рис. 3). Этот результат позволя-
Однонуклеотидные полиморфизмы (ОП (р < 0.01)), обнаруженные в митохондриальном геноме представителя новосвободненской культуры
Позиция ОП на мтДНК Референсная последовательность мтДНК, hg19 Замена Ген
72* T С -
93* A G -
2515 C T TVAS5
9378 G A JA760602; JA760600
9541 C T JA760602; JA760600
11018 C Т JA760602; JA760600; STRF6; JA760615
11720 А G JA760602; JA760600; STRF6; JA760615
11723 C Т JA760602; JA760600; STRF6; JA760615
12851 G А JA760602; JA760600; JA760615
14906 А G JA760602; цитохром b
15302 А G JA760602; цитохром b
15477 C Т JA760602; цитохром b
* ОП, определяющие гаплогруппу V7.
V7
Рис. 4. Результаты определения митохондриальной гаплогруппы, показанные в виде ветви дерева гаплогрупп мтДНК человека (сервис HaploGrep). Зеленым цветом в голубых прямоугольниках указаны ОП (72С и 93G), использованные при определении гаплогруппы
ет утверждать, что в секвенированном образце вся мтДНК принадлежит древнему человеку.
Сравнение нуклеотидных последовательностей индивидуальных чтений с консенсусной последовательностью митохондриального генома (с учетом понижения качества концевых замен, см. «Экспериментальную часть») позволило идентифицировать в мтДНК представителя исследуемой археологической культуры однонуклеотидные полиморфизмы, используя которые мы отнесли образец к митохондриальной гаплогруппе V7 (рис. 4, таблица).
При сборке митохондриального генома представителя новосвободненской культуры с минимальной длиной контига, равной 100 нуклеотидам, удалось собрать контиги с N50, равным 203 нуклеотидам (N50 -наибольшая длина контига при de novo-сборке такая, что в контигах не меньшей длины содержится 50% суммарной длины контигов).
Общий размер de novo-собранных фрагментов мтДНК составил 11063 нуклеотида (рис. 2). В связи с деградацией исходного материала, неравномерностью ПЦР и обогащения мтДНК (набор FleXelect Mitochondrial DNA enrichment kit) большинство
полученных контигов имели малую длину и не перекрывались, что не позволило обеспечить сборку полной последовательности мтДНК, несмотря на покрытие 13.4Х.
Ранее, основываясь на археологических находках, сомнению подвергли точку зрения о связи новосво-бодненской культуры с переднеазиатской майкопской археологической культурой. Более того, найденные артефакты позволили предложить гипотезу о решающем вкладе в формирование новосвободненской археологической культуры баальбергского варианта ранних этапов предположительно индоевропейской культуры воронковидных кубков, а не переднеазиатской майкопской археологической культуры [5]. Окончательный вердикт в подобных исследованиях позволяет вынести анализ ДНК, который считается одним из решающих доказательств.
Генетические исследования, посвященные миграции древнего человека по территории Европы, активно ведутся в последние десятилетия. Б. Сайкс [27], например, предполагает, что основными митохондриальными гаплогруппами на территории Европы были и, Н, V, I, W, Т, К, которые появились и распростра-
нились по территории Европы во время таяния ледника 11-14 тысяч лет назад. При этом не исключена миграция с территории Ближнего Востока населения с гаплогруппой J мтДНК, принесшего в регион культуру земледелия [27]. Анализ митохондриальной ДНК представителей культуры линейно-ленточной керамики (предшественника культуры воронковидных кубков) позволил установить доминирование гаплогрупп Н, V и Т [28]. Кроме того, в ряде работ показано, что в Европе времен археологической культуры линейно-ленточной керамики и родственных ей культур представлены в первую очередь гапло-группы и, Н и V [29-32]. Результаты нашей работы, полученные с использованием современных методов геномного анализа, согласуются с гипотезой о происхождении новосвободненской культуры, предложенной А.Д. Резепкиным [5].
заключение
Нами представлены результаты секвенирования нуклеотидной последовательности мтДНК представителя новосвободненской археологической культуры, жившего более 5 тысяч лет назад. Обнаруженные однонуклеотидные полиморфизмы позволяют отнести изученный образец к митохондриальной гаплогруппе V7, широко распространенной у совре-
менных жителей Европы, а также встречавшейся в ряде культур, населявших Центральную Европу. Результаты работы не противоречат гипотезе о происхождении новосвободненской культуры от ранних европейских культур Северной и Центральной Европы и выделении ее в качестве самостоятельной археологической культуры, однако требуют более детального геномного анализа как новосвободнен-ской, так и майкопской археологических культур. В настоящее время достоверные данные о митохондриальных гаплогруппах майкопской и, предположительно, предковой для нее культуры позднего восточноанатолийского халколита этапов III—IV (Амук F) отсутствуют. •
Авторы выражают благодарность М.В. Ковальчуку (Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт») за пристальное внимание к работе и К.Г. Скрябину (Центр «Биоинженерия» РАН) за ценные замечания, сделанные в процессе подготовки статьи к публикации.
Работа поддержана РФФИ (грант № 13-06-12025 офи_м) и стипендией Президента Российской Федерации (СП-2056.2012.5).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Иессен А.А. К хронологии «больших кубанских курганов». М.: Советская археология, 1950. Т. 12.
2. Мунчаев Р.М. Кавказ на заре бронзового века. М.: Наука, 1975. 416 с.
3. Мунчаев Р.М. Майкопская культура. Археология: Эпоха бронзы Кавказа и Средней Азии. Ранняя и средняя бронза Кавказа. М.: Наука, 1994. C. 158—225.
4. Rezepkin A.D. Das frflhbronzezeitliche Graberfeld von Klady und die Majkop-Kultur in Nordwestkaukasien. Archaologie in Eurasien. M.: Leidorf, 2000. V. 10. 74 S.
5. Резепкин А.Д. Новосвободненская культура (на основе материалов могильника «Клады»). Санкт-Петербург: Нестор история, 2012. 343 с.
6. Paabo S. // Nature. 1985. V. 314. № 6012. Р. 644—645.
7. Haak W., Balanovsky O., Sanchez J., Koshel S., Zaporozh-chenko V., Adler C., der Sarkissian C., Brandt G., Schwarz C., Nicklisch N., et al. // PLoS Biol. 2010. V. 8. № 11. e1000536.
8. Green R.E., Krause J., Briggs A.W., Maricic T., Stenzel U., Kircher M., Patterson N., Li H., Zhai W., Fritz M.H., et al. // Science. 2010. V. 328. № 5979. Р. 710—722.
9. Lorenzen E.D., Nogues-Bravo D., Orlando L., Weinstock J., Binladen J., Marske K.A., Ugan A., Borregaard M.K., Gilbert M.T., Nielsen R., et al. // Nature. 2011. V. 479. № 7373.
Р. 359—364.
10. Rasmussen M., Guo X., Wang Y., Lohmueller K.E., Rasmussen S., Albrechtsen A., Skotte L., Lindgreen S., Metspalu M., Jombart T., et al. // Science. 2011. V. 334. № 6052. Р. 94—98.
11. Ozawa T., Hayashi S., Mikhelson V.M. // J. Mol. Evol. 1997.
V. 44. № 4. P. 406—413.
12. Poinar H., Kuch M., McDonald G., Martin P., Paabo S. //
Curr. Biol. 2003. V. 13. № 13. P. 1150-1152.
13. Barnes I., Shapiro B., Lister A., Kuznetsova T., Sher A., Guthrie D., Thomas M.G. // Curr. Biol. 2007. V. 17. № 12. P. 1072-1075.
14. Vilstrup J.T., Seguin-Orlando A., Stiller M., Ginolhac A., Raghavan M., Nielsen S.C., Weinstock J., Froese D., Vasiliev
S.K., Ovodov N.D., et al. // PLoS One. 2013. V. 8. № 2. e55950.
15. Orlando L., Ginolhac A., Zhang G., Froese D., Albrechtsen A., Stiller M., Schubert M., Cappellini E., Petersen B., Moltke I., et al. // Nature. 2013. V. 499. № 7456. P. 74-78.
16. Pakendorf B., Stoneking M. // Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2005. V. 6. P. 165-183.
17. Allentoft M.E., Collins M., Harker D., Haile J., Oskam C.L.,
Hale M.L., Campos P.F., Samaniego J.A., Gilbert M.T., Willerslev E., et al. // Proc. Biol. Sci. 2012. V. 279. № 1748. P 4724-4733.
18. Orlando L., Metcalf J.L., Alberdi M.T., Telles-Antunes M., Bonjean D., Otte M., Martin F., Eisenmann V., Mashkour M., Morello F., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106.
№ 51. P 21754-21759.
19. Langmead B., Salzberg S.L. // Nat. Methods. 2012. V. 9. № 4.
P. 357-359.
20. Jonsson H., Ginolhac A., Schubert M., Johnson P.L., Orlando L. // Bioinformatics. 2013. V. 29. № 13. P 1682-1684.
21. Koboldt D.C., Larson D.E., Chen K., Ding L., Wilson R.K. // Genome Res. 2012. V. 22. № 3. P 568-576.
22. Kloss-Brandstatter A., Pacher D., Schonherr S., Weissen-steiner H., Binna R., Specht G., Kronenberg F., et al. // Hum. Mutat. 2011. V. 32. № 1. P 25-32.
23. Simpson J.T., Wong K., Jackman S.D., Schein J.E., Jones S.J., Birol I. // Genome Res. 2009. V. 19. № 6. P 1117-1123.
24. Garcia-Garcera M., Gigli E., Sanchez-Quinto F., Ramirez O., Calafell F., Civit S., Lalueza-Fox C. // PLoS One. 2011. V. 6. № 8. e24161.
25. Hofreiter M., Jaenicke V., Serre D., Haeseler A., Paabo S. // Nucl. Acids Res. 2001. V. 29. № 23. P. 4793-4799.
26. Dabney J., Knapp M., Glocke I., Gansauge M.T., Weihmann A., Nickel B., Valdiosera C., Garcia N., Paabo S., Arsuaga J.L., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013. V. 110. № 39. P. 15758-15763.
27. Sykes B. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 1999.
V. 354. № 1379. P. 131-139.
28. Haak W., Forster P., Bramanti B., Matsumura S., Brandt G., Tanzer M., Villems R., Renfrew C., Gronenborn D., Alt K.W., et al. // Science. 2005. V. 310. № 5750. P. 1016-1018.
29. Kittles R. A., Bergen A.W., Urbanek M., Virkkunen M., Lin-noila M., Goldman D., Long J.C. // Am. J. Phys. Anthropol. 1999. V. 108. № 4. Р. 381-399.
30. Achilli A., Rengo C., Magri C., Battaglia V., Olivieri A., Scoz-zari R., Cruciani F., Zeviani M., Briem E., Carelli V., et al. // Am. J. Hum. Genet. 2004. V. 75. № 5. Р. 910-918.
31. Malmstrom H., Gilbert M.T., Thomas M.G., Brandstrom M., Stora J., Molnar P., Andersen P.K., Bendixen C., Holmlund G., Gotherstrom A., et al. // Curr. Biol. 2009. V. 19. № 20. Р. 1758-17б2.
32. Skoglund P., Malmstrom H., Raghavan M., Stora J., Hall P., Willerslev E., Gilbert M.T., Gotherstrom A., Jakobsson M. // Science. 2012. V. 33б. № б080. Р. 4бб-4б9.
