CC BY
33
ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 16. БИОЛОГИЯ. 2017. Т. 72. № 1. С. 35-38
35
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.21
СЕКВЕНИРОВАНИЕ ГЕНОМА И ТРАНСКРИПТОМА МИНИАТЮРНОГО ПЕРЕПОНЧАТОКРЫЛОГО MEGAPHRAGMA AMALPHITANUM (HYMENOPTERA:
TRICHOGRAMMATIDAE)
Е.Б. Прохорчук13, А.В. Недолужко2*, Ф.С. Шарко3, С.В. Цыганкова2, Е.С. Булыгина2, С.М. Расторгуев2, А.С. Соколов3, А.М. Мазур3, А.А. Полилов4, К.Г. Скрябин1,2,3
1 Кафедра биотехнологии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова;
Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12;
2 Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт";
Россия, 123182, г. Москва, пл. Академика Курчатова, д. 1;
3 Институт биоинженерии, Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук; Россия, 119071, г. Москва, Ленинский пр-т, д. 33, корп. 2;
4 Кафедра энтомологии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова;
Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12 *е-таН: nedoluzhko@gmail.com
Миниатюризация организмов — одно из наиболее интересных эволюционных явлений. Это весьма распространенный процесс, широко представленный у многоклеточных организмов: беспозвоночных (немертины, круглые черви, брахиоподы, моллюски, паукообразные и насекомые) и позвоночных (рыбы, амфибии, птицы и даже млекопитающие). Миниатюризация приводит к значительному сокращению размеров организма и упрощению ряда систем и органов без потери жизнеспособности. Как правило, эта комплексная эволюционная модификация связана с занятием особой экологической ниши, свободной от конкурентов. В ходе этого процесса не только изменяется общий размер организма, но и уменьшаются размеры клеток, составляющих его, а также меняется структура генома и отдельных генов. Паразитический наездник Megaphragma amalphita-пит (Нушепор1ега: ТпсЬс^гатшаШае) считается одним из мельчайших насекомых, описанных к настоящему времени, и потому представляет значительный интерес в качестве объекта для изучения генетических аспектов уменьшения размеров организмов в процессе эволюции. Секвенирование полного генома М. amalphitanum и его последующая аннотация, а также сборка транскриптома позволяют понять, насколько меняется генетический материал таких организмов при миниатюризации по сравнению с другими (более крупными) представителями отряда Нушепор1ега. Предварительный анализ показал, что размер генома М. amalphitanum составляет 346 миллионов пар оснований, а размер транскриптома — 27,5 миллионов пар оснований.
Ключевые слова: Hymenoptera, геном, транскриптом, Megaphragma amalphitanum, паразитический наездник, миниатюризация.
Понимание процесса миниатюризации многоклеточных организмов имеет колоссальное фундаментальное значение. Для позвоночных показано, что миниатюризация приводит к изменениям в строении тела, у беспозвоночных изменения, связанные с уменьшением размеров тела, также затрагивают многие органы и системы органов [1—3].
Процесс экстремального уменьшения размеров приводит к постепенной миниатюризации организма посредством последовательной редукции предко-вого фенотипа и появления новых, модифицированных, органов и систем. В ходе этого процесса не только изменяется общий размер организма, но и сокращаются размеры клеток, составляющих его.
Миниатюризация иногда может приводить к изменению структуры и размеров генома и, как следствие, изменению экспрессии определенных генов, связанных с ростом и развитием организма, хотя, к сожалению, к настоящему времени подобных исследований проведено мало [4—6].
В данной работе представлены результаты геномного и транскриптомного секвенирования одного из мельчайших насекомых, описанных к настоящему времени, — паразитического наездника Megaphragma amalphitanum (Hymenoptera: Trichogrammatidae). Показано, что размер генома и транскриптома этого насекомого сопоставим с этими показателями для других, более крупных, представителей Hymenoptera.
Материалы и методы
Выделение ДНК и РНК, приготовление библиотек и секвенирование. В работе использовали взрослых особей M. amalphitanum, которые были выведены из яиц трипсов Heliothrips haemorrhoidalis (Thysano-ptera: Thripidae), собранных в окрестностях города Санта-Маргарита (Северная Италия). Выделение ДНК и создание ДНК-библиотек проводили по методике, описанной ранее [7]; тотальную РНК выделяли с использованием реагента Тризол (Thermo
3б
Е.Б. Прохорчук и др.
Fisher Scientific, США) по стандартному протоколу, кДНК-библиотеки конструировали, используя коммерческий набор Ovation RNA-Seq System V2 kit (NuGEN, США).
Созданные ДНК-библиотеки секвенировали на геномном анализаторе Illumina Hiseq 1500 (Illumina, США).
Биоинформатический анализ данных. В качестве исходного материала для сборки генома нами были использованы данные, полученные при секвениро-вании (исходный формат *.fastq) ДНК-библиотек, приготовленных из геномной ДНК. Для сборки полной последовательности генома паразитического наездника были использованы 102188833 парных чтений длиной 150 нуклеотидов. Для реконструкции генома M. amalphitanum проводилась сборка de novo с использованием нескольких общедоступных программ (ABySS, Velvet, CLC, SOAP и SPAdes). На первом этапе сборки мы объединили исходные чтения с помощью программы Pear [8] и удалили ПЦР-дубликаты.
Программный пакет SPAdes показал лучшие результаты сборки генома, поэтому в дальнейшем мы использовали контиги, полученные с его помощью. Сборку скаффолдов проводили с использованием утилиты SOAPdenovo Data Preparation Module [9].
В качестве исходного материала для сборки транскриптома нами были использованы данные, полученные при секвенировании (исходный формат *.fastq) кДНК-библиотек, приготовленных из тотальной РНК. Для сборки полной последовательности генома паразитического наездника были использованы 59 790 973 парных чтений длиной 125 нуклеотидов. Для сборки de novo транскриптома M. amalphitanum использовали программный пакет Trinity со стандартными параметрами [10]. Аннотацию генома проводили с помощью программы AUGUSTUS [11].
Результаты и обсуждение
В результате проведенного биоинформатическо-го анализа была получена геномная сборка паразитического наездника M. amalphitanum (PRJNA344956) — её суммарный размер составляет 346 миллионов пар оснований (п.о.) при N50 контига, равном 4275 п.о.
Комбинирование двух de novo-сборщиков SOAP and SPAdes позволило собрать 94 687 скаффолдов (N50 = 10 296 п.о.). Программный пакет SPAdes продемонстрировал лучшие результаты сборки (табл. 1).
Используя полученные чтения кДНК-библио-тек, полученных из тотальной ДНК и отсеквени-рованных, собрали 46 841 контигов с N50, равным 633 п.о. Суммарный размер транскриптома составил 27 407 647 миллионов п.о. Полученные геномные и транскриптомные данные были использованы при аннотации генома, которая позволила выявить ряд белок-кодирующих и некодирующих последовательностей (доступны по ссылке: www.treefrog.ru/ megaphragma.gif). Эти последовательности в дальнейшем будут использованы при сравнении полученных результатов с данными, касающимися более крупных представителей Hymenoptera. Это позволит выявить гены/генные кластеры/метаболические пути, вероятно, связанные с миниатюризацией M. amalphitanum.
К настоящему времени не существует единого мнения насчет корреляции между размером тела и размером генома. В частности, в исследованиях плоских червей и веслоногих рачков (копепод) продемонстрировали наличие достоверной связи между этими двумя признаками [4], в то время как в работах, посвященных размерам генома у муравьев, не просматривается подобной корреляции [12]. В случае с M. amalphitanum (предварительный размер генома — 346 миллионов п.о.) мы также не просматриваем корреляции между размером организма и его геномом — согласно данным, депонированным в NCBI (Национальный центр биотехнологической информации США), размер генома более крупного паразитического наездника Nasonia vitripennis составляет 295 миллионов п.о., а наиболее качественно собранного генома медоносной пчелы (Apis mellifera) — 247 миллионов п.о.
Анализ транскриптома M. amalphitanum, который был использован нами для аннотации, показал, что он также имеет стандартный размер для перепончатокрылых — 27,5 миллионов п. о.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 14-24-00175).
Таблица 1
Статистика сборки de novo генома паразитического наездника M. amalphitanum с использованием ассемблеров ABySS , Velvet, CLC и SPAdes, SOAP
Количество собранных контигов Минимальный размер контига N50 Максимальный размер контига Суммарный размер сборки Использованный ассемблер
541 950 300 869 19 313 2,91x108 Velvet
484 255 300 1425 33 321 3,07x108 CLC
553 157 300 4285 56 202 3,58x108 SPAdes
4,58E+06 300 974 21 336 2,20x108 ABySS
94 687 300 10 296 895 906 3,46x108 SPAdes+SOAP
СЕКВЕНИРОВАНИЕ ГЕНОМА И ТРАНСКРИПТОМА
37
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Grebennikov V.V., Beutel R.G. Morphology of the minute larva of Ptinella tenella, with special reference to effects of miniaturisation and the systematic position of Ptiliidae (Coleoptera: Staphylinoidea) // Arthropod Struct. Dev. 2002. Vol. 31. N 2. P. 157-172.
2. Polilov A.A. The smallest insects evolve anucleate neurons // Arthropod Struct. Dev. 2012. Vol. 41. N 1 P. 29-34.
3. Polilov A.A. Consequences of miniaturization in insect morphology // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2015. Vol. 70. N 3. P. 37-43.
4. Gregory T.R., Hebert P.D., Kolasa J. Evolutionary implications of the relationship between genome size and body size in flatworms and copepods // Heredity (Edinb). 2000. Vol. 84. Pt. 2. P. 201-208.
5. Liu S., Hui T.H., Tan S.L., Hong Y. Chromosome evolution and genome miniaturization in minifish // PLoS One. 2012. Vol. 7. N 5. e37305.
6. Harris R.A., Tardif S.D., Vinar T., Wildman D.E., Rutherford J.N., Rogers J., Worley K.C., Aagaard K.M. Evolutionary genetics and implications of small size and twinning in callitrichine primates // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2014. Vol. 111. N 4. P. 1467-1472.
7. Nedoluzhko A.V., Sharko F.S., Boulygina E.S., Tsygan-kova S.V., Sokolov A.S., Mazur A.M., Polilov A.A., Prokhort-
chouk E.B., Skryabin K.G. Mitochondrial genome of Mega-phragma amalphitanum (Hymenoptera: Trichogrammatidae) // Mitochondrial DNA Part A. 2016.Vol. 27. N 6. P. 4526-4527.
8. Zhang J., Kobert K., Flouri T., Stamatakis A. PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR // Bioinformatics. 2014. Vol. 30. N 5. P. 614-620.
9. Luo R., Liu B., Xie Y., et al. SOAPdenovo2: an empirically improved memory-efficient short-read de novo assembler // Gigascience. 2012. Vol. 1. N 1. P. 18.
10. Haas B.J., Papanicolaou A., Yassour M., et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis // Nat. Protoc. 2013. Vol. 8. N 8. P. 1494-1512.
11. Stanke M., Steinkamp R., Waack S., Morgenstern B. AUGUSTUS: a web server for gene finding in eukaryotes // Nucleic Acids Res. 2004. Vol. 32 (Wb Server issue). W309-W312.
12. TsutsuiN.D., Suarez A.V., Spagna J.C., Johnston J.S. The evolution of genome size in ants // BMC Evol. Biol. 2008. Vol. 8 : 64.
Поступила в редакцию 09.11.2016 Принята в печать 06.12.2016
MOLECULAR BIOLOGY
THE GENOME SEQUENCING AND TRANSCRIPTOMIC ASSEMBLY OF THE PARASITOID WASP MEGAPHRAGMA AMALPHITANUM (HYMENOPTERA: TRICHOGRAMMATIDAE)
E.B. Prokhortchouk1,3,A.V. Nedoluzhko2*, F.S. Sharko3, S.V. Tsygankova2, E.S. Boulygina2, S.M. Rastorguev2, A.S. Sokolov3, A.M. Mazur3, A.A. Polilov4, K.G. Skryabin12 3
1 Department of Biotechnology, Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskiye gory 1-12, Moscow, 119234, Russia;
2 National Research Centre "Kurchatov Institute", Kurchatov sq. 1, Moscow, 123182, Russia;
3 Institute of Bioengineering, Research Center of Biotechnology of the Russian Academy of Sciences, Leninsky prospect 33-2, Moscow, 119071, Russia 4 Department of Entomology, Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskiye gory 1-12, Moscow, 119234, Russia *e-mail: nedoluz.hko@gmail.com
Miniaturization of organisms is one of the most interesting evolutionary phenomena. This is a very common process, widely represented in multicellular organisms: invertebrates (nemertean, nematodes, brachiopods, mollusca, arachnids, and insects) and vertebrates (fishes, amphibians, birds, and even mammals). Miniaturization leads to a significant reduction in the body size and simplifying of some systems and organs without loss of species viability. The cell size reduce as well as genome and gene structure change during minitiaruzation. Typically, this complex evolutionary modification is associated with the occupation of ecological niches. Parasitoid wasp Mega-phragma amalphitanum (Hymenoptera: Trichogrammatidae) is considered one of the smallest insects described to date and therefore is attractive as an object for studying of genetic aspects of body size reduction during evolution. The whole genome sequencing of M. amalphitanum and subsequent genome annotation and transcriptome assembly allow us to understand how the genetic material changes during miniaturization in relation to the corresponding characteristics of the larger Hymenoptera species. Preliminary analysis showed that the genome size of the M. amalphitanum is 346 Mbp; the transcriptome size is 27.5 Mbp.
Keywords: Hymenoptera, genome, transcriptome, Megaphragma amalphitanum, parasitoid wasp, miniaturization.
38
Е.Б. Прохорчук и др.
Сведения об авторах
Прохорчук Егор Борисович — докт. биол. наук, проф. кафедры биотехнологии биологического факультета МГУ, заведующий лабораторией Института биоинженерии, ФИЦ "Фундаментальные основы биотехнологии" РАН. Тел.: 8-499-135-53-37; e-mail: prokhortchouk@gmail.com
Недолужко Артём Валерьевич — канд. биол. наук, начальник лаборатории НИЦ "Курчатовский институт". Тел.: 8-499-196-79-37; e-mail: nedoluzhko@gmail.com
Шарко Фёдор Сергеевич — аспирант, мл. науч. сотр. Института биоинженерии ФИЦ "Фундаментальные основы биотехнологии" РАН. Тел.: 8-499-135-53-37; e-mail: fedosic@ gmail.com
Цыганкова Светлана Валерьевна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. НИЦ "Курчатовский институт". Тел.: 8-499-196-79-37; e-mail: svetlana.tsygankova@gmail.com
Булыгина Евгения Станиславовна — канд. биол. наук, вед. науч. сотр. НИЦ "Курчатовский институт". Тел.: 8-499-196-79-37; e-mail: eugenia.bulygina@gmail.com
Расторгуев Сергей Михайлович — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. НИЦ "Курчатовский институт". Тел.: 8-499-196-79-37; e-mail: rastorgueff@gmail.com
Соколов Алексей Сергеевич — мл. науч. сотр. Института биоинженерии, ФИЦ "Фундаментальные основы биотехнологии" РАН. Тел.: 8-499-135-53-37; e-mail: sokolovbiotech@ gmail.com
Мазур Александр Михайлович — канд. физ.-мат. наук, ст. науч. сотр. Института биоинженерии, ФИЦ "Фундаментальные основы биотехнологии" РАН. Тел.: 8-499-135-53-37; e-mail: mazur.am@gmail.com
Полилов Алексей Алексеевич — докт. биол. наук, зав. кафедрой биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-35-32; e-mail: polilov@gmail.com
Скрябин Константин Георгиевич — докт. биол. наук, проф., академик РАН, заведующий кафедрой биотехнологии биологического факультета МГУ, научный руководитель ФИЦ "Фундаментальные основы биотехнологии" РАН. Тел.: 8-499-135-73-19; e-mail: office@biengi.ac.ru
