CC BY
38САХАРНЫЙ ДИАБЕТ II ТИПА И АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ
ПРОТЕОЛИЗА Акбашева О.Е.1, Агеева Т.С.2, Дьяков Д.А.3
1Акбашева Ольга Евгеньевна - профессор, доктор медицинских наук, кафедра биохимии и молекулярной биологии с курсом клинической лабораторной диагностики;
2Агеева Татьяна Сергеевна - профессор, доктор медицинских наук, заведующий кафедрой, кафедра пропедевтики внутренних болезней с курсом терапии, педиатрический факультет;
3Дьяков Денис Александрович - студент, лаборант, кафедра биохимии и молекулярной биологии с курсом клинической лабораторной диагностики, Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск
Аннотация: сахарный диабет - одно из самых распространенных заболеваний в медицинской практике. На сегодняшний день сахарный диабет имеет отрицательную статистику, поскольку его распространённость в мире неуклонно растет. В ходе проведенных исследований выявлена активация протеолитических ферментов.
Ключевые слова: СД II типа, сахарный диабет II типа, протеолиз, а1 -протеиназный ингибитор, трипсиноподобные протеиназы, эластазоподобные протеиназы.
Актуальной проблемой современной медицины является тенденция роста установления диагноза сахарный диабет II типа. По данным ГосРегистра рост распространенности сахарного диабета II типа в Российской Федерации за период 2003-2015 г. составляет 2,2 млн человек.
Протеолиз - процесс гидролиза белков, катализируемый ферментами протеазами, который принимает участие в поддержании клеточного гемостаза [1].
Трипсиноподобные протеиназы (КФ 3.4.21.4) - фермент, относящийся к классу гидролаз группа сериновых протеаз. Помимо гидролазной активности обладает эстеразной активностью - принимает участие в гидролизе сложных эфиров. Гидрализуются пептидные связи образованные, карбоксильными группами аргинина и лизина [2, 4].
Эластазоподобные протеиназы - одноцепочный гликопротеин с катионным характером своей молекулы, относящийся к классу пептид - гидролазы (КФ 3.4.21...). Большинство эластаз является сериновыми протеиназами. Особенностью данного фермента является возможность гидролитически расщеплять молекулу эластина разрывая связи, которые образованны между карбонильными группами аминокислот [2, 3, 4].
Активность эластазы регулируется системой протеиназных ингибиторов, которые присутствуют в различных тканях организма. Наиболее важное значение имеет ai -протеиназный ингибитор (ai - ПИ, ai - антитрипсин) [2, 3, 4].
ai - Антитрипсин - гликопротеин с молекулярной массов 50 - 55 кДа, является ингибитором сериновых протеиназ.
ai - Протеиназный ингибитор и сериновые протеиназы взаимодействуют через протеолитическую атаку фермента на ингибитор как субстрат, в следствие чего происходит образование эфирных мостиков между свободными карбоксильными группами лизина, аргинина ai - антитрипсина и активным центром протеиназы [2, 3, 4].
Цель работы. Изучить изменение активности системы протеолиза при сахарном диабете II типа в плазме крови.
Материалы и методы. Исследовали in vitro плазму крови контрольной группы без клинического диагноза - сахарный диабет II типа, в количестве 30 проб и группу с данной патологией, в таком же количестве.
Активность ai-протеиназного ингибитора определяли по методу торможения аргинин-эстеразной активности трипсина. В качестве субстрата использовался N-бензоил-Ь-аргинин-этиловый эфир (БАЭЭ) [5].
Готовили две опытные пробы, первая содержала 1,9 мл 0.05 М трис-HCl буфера и 0,1 мл 0,01% раствора трипсина, а вторая - 1,8 мл 0,05 М трис-HCl буфера, 0,1 мл 0,01% раствора трипсина и 0,1 мл разведенной в 50 раз плазмы крови, выдерживали 5 минут при 250С, затем добавляли по 1 мл 1,5 мМ раствора БАЭЭ. Перемешивали и измеряли прирост оптической плотности при длине волны 253 нм в течение 3 минут. Активность выражали в ингибиторных единицах на 1 мл биологической жидкости (ИЕ/мл).
Активность трипсиноподобных протеиназ (КФ 3.4.21.4 - КФ 3.4.21.8) определяли с использованием синтетического субстрата N-бензоил-Ь-аргинин-этиловый эфир (БАЭЭ) [6, 7].
БАЭЭ-эстеразную активность трипсиноподобных протеиназ измеряли по приросту оптической плотности при 253 нм. К 0,1 мл плазмы крови, разведенной в 10 раз, добавляли 1,9 мл 0,05 М трис-НС1 буфера (рН=7,8), 1 мл 1,5 ммоль/л раствора БАЭЭ, измеряли оптическую плотность при 253 нм в течение 6 минут. Активность трипсиноподобных протеиназ выражали в нмоль БАЭЭ/мин на 1 мл биологической жидкости.
Активность эластазоподобных протеиназ (КФ 3.4.21.37 и КФ 3.4.21.11) измеряли по скорости гидролиза р-нитрофенилового эфира N бутилоксикарбонил-Ь-аланина (БАНЭ) при 347,5 нм [6,4].
В кювете спектрофотометра смешивали 0,2 мл плазмы крови разведенной в 10 раз и 2,7 мл 0,05 М натрий-фосфатный буфер, рН=6,5. Добавляли 0,1мл раствора 0,01М раствор БАНЭ в ацетонитриле, перемешивали и измеряли прирост оптической плотности в течение 5 минут при длине волны 547,5 нм. Активность выражали в нмоль БАНЭ/ мин на 1 мл биологического материала.
Оптическую плотностью измеряли с помощью спектрофотометра «СФ - 2000».
Статистическую обработку данных проводили в программном обеспечении SPSS Statistics 17.0.
Результаты исследования. По результатам проведенных исследований было установлено, что при сахарном диабете II типа происходит активация протеолитических ферментов.
Таблица 1. Активность протеиназ и а1 - протеиназного ингибитора в плазме крови больных сахарным диабетом II типа (Ме, Q1,Q3)
Показатель Контрольная группа n=30 Сахарный диабет II типа n=30
1 2
a1 - Протеиназный ингибитор, ИЕ/мл 30,0 (24,6;37,2) 35,7 (20,5;42,3) Р1,2=0,044
Трипсиноподобные протеиназы, нмоль БАЭЭ/мин*мл 58,2 (44,9;68,8) 86,9 (47,3;101,3) Р1,2=0,029
Эластазоподобные протеиназы, нмоль БАНЭ/мин*мл 52,4 (50,3;69,25) 85,6 (41,0;87,4) Р12=0,032
Активность а1-протеиназного ингибитора при сахарном диабете увеличилась незначительно.
Активность трипсиноподобных протеиназ увеличилась в 1,49 раза (р<0,05) по отношению к контрольной группе.
Также наблюдается увеличение активности эластазоподобных протеиназ в 1,63 раза (р<0,05).
Выводы. Результаты проведенных исследований показали, что при сахарном диабете II типа происходит увеличение активности протеолитических ферментов (трипсиноподобные протеиназы, эластазоподобные протеиназы), что приводит к дисбалансу в системе «протеолиз - антипротеолиз». Проведенный анализ результатов показал достоверное (р<0,05) увеличение показателей системы протеолиза.
Возможно, это обусловлено тем, что при сахарном диабете II типа наблюдается снижение интенсивности цикла трикарбоновых кислот (ЦТК), это связано с нарушением включения ацетил-СоА в ЦТК и его превращение в цитрат, т.к. инсулин является активатором и происходит уменьшение активности цитратсинтазы. Помимо этого, накапливается пальмитоил-СоА (ингибитор цитратсинтазы) в результате высокой активности липолиза. Это вызывает нарушения в энергетическом обмене, с целью повышения производительности цикла Кребса запускается усиленный протеолиз, который носит компенсаторный характер.
Список литературы
1. Веремеенко К.Н. Протеолиз в норме и при патологии / К.Н. Веремеенко, О.П. Голобородько, А.И. Кузин. К.: Здоровья, 1988. 199 с.
2. Веремеенко К.Н. Протеолитические ферменты и их ингибиторы. Новые области применения в клинике. / К.Н. Веремеенко // Врачебное дело, 1994. № 1. С. 8-13.
3. Суханова Г.А. Энзимология. Учебно-методическое пособие. Томск, 1983. 76 с.
4. He S.H. Inhibition of tryptase and chymase induced nucleated cell infiltration by proteinase inhibitors / S.H. He, H.Q. Chen, J. Zheng // Acta Pharmacol Sin., 2004. Vol. 25. № 12. Р. 1677-1684.
5. Нартикова В.Ф. Унифицированный метод определения активности альфа1-протеиназного ингибитора, альфа2-макроглобулина в сыворотке крови человека / В.Ф. Нартикова, Т.С Пасхина // Вопросы мед. химии, 1989. Т. 25. № 4. С. 494-9.
6. Богер М.М. Методы исследования поджелудочной железы. Новосибирск: Наука, 1988. С. 278.
7. Измерение активности трипсино- и эластазоподобных протеиназ полиморфноядерных лейкоцитов и уровня их кислотостабильных ингибиторов в бронхиальном секрете человека: метод. рекомендации / О.Г. Оглоблина, Л.В. Платонова, Т.С. Пасхина. Москва, 1984. 14 с.
