CC BY
44
autphytosozological index proposed by the scientists of the institute of ecology of Carpathians of NAS of Ukraine used for characteristic of nature-conservation status of species. Basic reasons, the negatively influencing durability populations are examined. Identify directions for nature-conservation measures of reduction in the risk of the real threat of the disappearance of the separate localities of H. purpurascens in Ukraine.
Keywords: plant material of Ukraine, Helleborus purpurascens, nature populations, sozological analyze.
УДК582.916.16:631.532/535:581.143.6 Acnip. О.М. Баюра1;
ст. наук. ствроб. М.В. Небиков2, канд. с.-г. наук; ст. наук. ствроб. В.Ф. Собченко3, канд. с.-г. наук
РОЗМНОЖЕННЯ ЯСЕНА ЗВИЧАЙНОГО
(FRAXINUS EXCELSIOR L.) IN VITRO
Дослщжено метод розмноження рослин Fraxinus excelsior L. в умовах культури in vitro. Проаналiзовано залежшсть морфогенно! активност тканин i оргашв вщ гормонального складу живильних середовищ.
Ключовi слова: Fraxinus excelsior, in vitro, живильне середовище, експланти, стерилiзацiя, морфогенез.
Вступ. Ясен звичайний (Fraxinus excelsior L.) е одшею з важливих лис-тяних деревних порщ у низщ европейських кра!н. Його широко використову-ють для виробництва деревини та озеленення. За останш роки цши на деревину збшьшилися, внаслщок чого й тдвищився попит на саджанщ цього виду [7]. Для великомасштабного виробництва в розсадниках, F. excelsior розмно-жують насшням, яке для подолання спокою повинно пройти довготривалу стратифжащю (32 тижш), а в деяких випадках - до 6 роюв [15, 17, 19]. У раз1 вегетативного розмноження живцями - укоршюються дуже погано, особливо у перюд1 генеративно! стиглосп [13], але ефективно укоршюються живщ, от-римаш з рослин, як перебувають у ювеншьному сташ [18, 20]. Щеплення пе-реважно використовують для селекцп декоративних форм [10].
Вегетативне розмноження, на в1дм1ну вщ насшного, забезпечуе збере-ження спадкових ознак у вегетативних поколшнях. З-пом1ж способ1в вегетативного розмноження на особливу увагу заслуговують технологи in vitro. Мжроклональне розмноження е одним 1з перспективних метод1в отримання садивного матер1алу, генетично щентичного вихщнш рослиш [2, 3]. Способи мжроклонального розмноження розроблено для багатьох вид1в рослин. Для культивування деревних рослин in vitro використовують р1зш живильш сере-довища, що мютять макро- i мжроелементи, амшокислоти, в1тамши, вугле-води та регулятори росту, як сприяють диференщацп пагошв, утворенню меристем або розвитку коренево! системи [1].
Методи мжроклонального розмноження рослин F. excelsior нараз1 роз-роблеш недостатньо. Публжацп, в яких описано окрем1 етапи культивуван-
1 Уманський нацiональний ушверситет садовництва;
2 Вщцш фiзiолоrií, генетики, селекцп та бютехнологл рослин НДП "Софпвка" НАН Укра'ни;
3 Вщцш дендрологи, штродукцл, паркобyцiвництва та екологл рослин НДП "Софйвка" НАН Укра'ни
ня F. excelsior in vitro, не дають змоги розробити завершену технолопю прис-кореного розмноження ще1 щнно1 рослини [6, 8, 9, 11, 12, 16].
Мета роботи - удосконалення базових живильних середовищ для от-римання in vitro генетично-щентичного садивного матерiалу F. excelsior.
Об'ект дослщження - методи мiкроклонального розмноження F. excelsior.
Предмет досл1дження - особливосп росту i розвитку F. excelsior у культурi in vitro.
Практична щншеть полягае в тому, що розробленi методи стерилiза-цп та мiкророзмноження F. excelsior в умовах культури in vitro можуть широко використовуватись для масового розмноження у лабораторiях культури тканин.
Методика дослщжень. Для введення у стерильш умови живцi F. excelsior 1,0-1,5 см завдовжки з аткальною меристемою нарiзали у другiй дека-дi травня - у перюд початку росту пагонiв.
У робот використано методи культури рослинних тканин та шдукцп морфогенних процесiв in vitro. В експеримент використовували модифжова-не середовище Ллойда i Мак Коуна (WPM) [14]. Пасажування на свiже жи-вильне середовище проводили через 25-30 дiб. Культивування експланпв вiдбувалося у кiмнатi з кондицшованим повiтрям на скляних стелажах за температури 25±1оС, вщносно1 вологостi повiтря 70-75 %, фотоперiоду 16 годин i штучного освiтлення iнтенсивнiстю 3-5 тис. люкс. Посуд, матерiали, шструменти та живильнi середовища готували зпдно зi загальноприйнятими методиками [3-5].
Результати досл1джень. Необхщним етапом, пiд час введення в культуру рослинного матерiалу е стерилiзацiя, що сприяе вивiльненню його вщ епiфiтних мiкроорганiзмiв та грибiв [3]. З цiею метою для F. excelsior проведено пiдбiр стерилiзаторiв, а також визначено вщповщш концентрацп та ек-спозицп.
У дослщах було випробувано воднi розчини рiзних хiмiчних реаген-тiв, зокрема 2,5 % ппохлориту натрiю, 0,1 % дихлориду ртутi та 1,0 % штра-ту срiбла за рiзних експозицiй. Для бiльш ефективно! ди до кожного iз ре-агентiв додавали емульгатор "Твiн 80". Пюля оброблення реагентом експлан-ти промивали три рази дистильованою стерильною водою протягом 10-15 хв, тсля цього висаджували на безгормональне живильне середовище WPM. Уп-родовж 7 дiб у кожному з варiантiв визначали ефективнiсть стерилiзацil, тд-раховуючи вiдсоток стерильних та iнфiкованих експланпв. Життездатнiсть введених експлантiв оцiнювали через 25 дiб (рис. 1).
Аналiз кiлькостi стерильних та iнфiкованих експланпв показав, що найменш ефективним стерилiзатором виявився гiпохлорит натрiю. Внаслiдок застосування (експозищя 2-10 хв) отримали 3,1-42,4 % стерильних експлан-тiв. Найбшьший вiдсоток стерильних мiкропагонiв (65,2-86,0 %) отримано вiд стерилiзацil у 0,1 % HgCl2, з них 46,2-73,4 % були життездатними, в яких спостер^али явище прямого органогенезу. Пюля дл нiтрату срiбла цей показ-ник становив 21,5-38,9 %, а для гшохлориду натрiю - 0,0-39,4 %.
1. Лiсове та садово-паркове господарство
27
I реагента та ix експозици Рис. 1. Ефективнгсть стеримзаци експлантгв F. excelsior залежно вгд форми стерилгзатора та експозици
Найвищий вщсоток стерильних та життездатних експлантiв одержано внаслiдок використання дихлориду ртутi з експозицiею 7 хв (рис. 3, А). Необ-хщно зазначити, що 3i збшьшенням часу ди HgCl2 понад 10 хв експланти втра-чали свою життездатнють i були непридатнi для подальшого культивування.
Стерильш, життездатнi експланти пересаджували на живильнi середо-вища WPM. З метою оптимiзацil живильного середовища для мжроклонуван-ня вивчили залежшсть рiзних концентрацiй 6-бензиламiнопурину (БАП) i Р-шдолилмасляно1 кислоти (1МК) на морфогенний потенцiал у експланпв F. excelsior (табл.).
Табл. Концентраци фгтогормонгв для стимуляци регенеративних процесгв у
експлантгв F. ехсеЫог
Регулятори росту Варiанти концентрацш, мг/л
БАП 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0
1МК 0 0,01 0,05 0,1 0,5
На вшх варiантах середовищ через 3 тижш було вiдзначено iндукцiю регенерацп пагонiв (рис. 2), однак штенсившсть пролiферацil до кiнця суб-культивування була рiзною i залежала вщ концентрацп регуляторiв росту в живильному середовищi.
2 3 4 5
Концентрат я ЕАП. мг/л Рис. 2. Кглькгсть мгкроклонгв залежно вгд концентрацш БАП - 1МК
У кращих варiантах з оптимально пiдiбраними сшввщношеннями фь тогормошв, як вiдiграють основну роль у регуляцп росту, впродовж 3445 дiб спостерiгали прямий морфогенез, за якого внаслщок активацп мерис-темних тканин, починали формуватись вiд двох до шести додаткових пагошв, якi вiдрiзнялись активним ростом (рис. 3, Б). Найбшьш ефективним був варь ант, у якому до середовища додавали 3,0 мг/л БАП та 0,01мг/л 1МК.
Однак треба зазначити, що висока концентращя БАП спричиняе утво-рення в^ифжованих пагонiв, а за концентрацп менше 1,0 мг/л пагони мали досить малi розмiри, якi були не придатш для подальшого культивування. У разi додавання високих доз 1МК (0,05-0,1 мг/л) на базальних частинах паго-нiв утворювався неморфогенний калюс.
Отже, при культивуваннi F. excelsior на живильних середовищах з pi3-ним вмютом регуляторiв росту встановлено !х велике значення для регенера-цп експлантiв in vitro, пролiферацп пагонiв залежно вiд сшввщношень та концентрацiй цих бiологiчно активних сполук.
Висновки:
1. Внаслщок поверхнево! стерилiзацп 0,1 %-им розчином дихлориду ртутi впродовж 7 хв отримано найбшьший вiдсоток стерильних експлантiв (86 %). Життездатними було 73,4 % стерильних експланпв, у яких спостерь гали явище прямого органогенезу.
2. Для розмноження F. excelsior in vitro найбшьш ефективним е моди-фжоване живильне середовище за базовим прописом Ллойда i Мак Коуна (WPM) з додаванням 3,0 мг/л БАП та 0,01 мг/л 1МК, на якому кшьюсть ново-утворених пагошв дорiвнювала у середньому 6 шт.
1. Биотехнология растений: культура клеток : пер. с англ. В.И. Негрука; с предисл. Р.Г. Бутенко. - М. : Агропромиздат, 1989. - 280 с.
2. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений / Р.Г. Бутенко. - М. : Изд-во "Наука",1964. - 272 с.
а) ~ 6)
Рис. 3. Морфогенез F. excelsior:
а - на 20-ту добу культивування; б - 70-ту добу культивування
Л1тература
1. .¡сове та садово-паркове господарство
29
3. Калинин Ф.Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений / Ф.Л. Калинин, В.В. Сарнацкая, В.Е. Полищук. - К. : Вид-во "Наук. думка", 1980. - 487 с.
4. Кунах В.А. Бютехнолопя лжарських рослин. Генетичш та фiзiолого-бiохiмiчнi осно-ви / В.А. Кунах. - К. : Вид-во "Логос", 2005. - 730 с.
5. Черевченко Т.М. Биотехнология тропических и субтропических растений in vitro / Т.М. Черевченко, А.Н. Лаврентьева, Р.В. Иванников. - К. : Вид-во "Наук. думка", 2008. - 560 с.
6. Микроразмножение и регенерация адвентивных побегов ясеня обыкновенного (Fraxi-nus excelsior L.) в культуре in vitro / В.Г. Лебедев и др. // Проблемы лесоведения и лесоводства: сб. научных трудов. - Гомель, 2008. - Вып. 68. - С. 239-244.
7. Capuana M. Plant regeneration of common ash (Fraxinus excelsior L.) by somatic embryogenesis / M. Capuana, G Petrini, A. Marco, R. Giannini // In Vitro Cellular & Development Biology - Plant. - 2007. - Vol. 43. - N. 2. - Р. 101-110.
8. Chalupa V. European Hardwoods / V. Chalupa. In: Bonga J.M. & Durzan D.K. [eds.] // Cell and tissue culture in forestry: growth and developments. - Dordrecht : Martinus Nijhoff, 1987. -Vol. 2. - Р. 224-246.
9. Chalupa V. Micropropagation of hornbeam (Carpinus betulus L.) and ash (Fraxinus excelsior L.) / V. Chalupa // Biologia plantarum. - 1990. - Vol. 32. - N. 5. - Р. 332-338.
10. Dirr M.A. The reference manual of woody plant propagation from seed to tissue culture: [a pract. working guide to the propagation of over 1100 species, varieties and cultivars] / M.A Dirr, C.W Heuser. - Athens: Varsity Press, 1987. - 239 p.
11. Hammatt N. Micropropagation of common ash (Fraxinus excelsior L.) / N. Hammatt, M.S. Ridout // Plant Cell Tissue Organ Culture. - 1992. - Vol. 31. - N. 1. - Р. 67-74.
12. Hammatt N. Fraxinus excelsiorL. (common ash) / N. Hammatt. In: Y.P.S. Bajaj [eds.] // Biotechnology in agriculture and forestry. - Berlin - New York: Springer-Verlag, 1996. - Vol. 35. - Р. 172-193.
13. Le bouturage de feuillus divers / D. Cornu, J. Garbaye, Y. Laplace [et al.] // Revue Forestière Française. - 1977. - Vol. 29. - N. 4. - Р. 278-284.
14. Lloyd G. Commercialy feasible micropropagation of mountain laurel Kalmia latifolia by use of shoot-tip culture / G. Lloyd, B. McCown // Proceedings of the International Plant Propagators' Society. - 1980. - Vol. 30. - Р. 421-427.
15. Milev M. Sowing materials from broad-leaved species / M. Milev, P. Alexandrov, K. Pet-kova, N. Iliev. - Sofia : Videnov & son, 2004. - 437 р.
16. Nougarede A. In nature dormant buds and in vitro dormant-like buds of Fraxinus excelsior L / A. Nougarede, C.E. Silveira, P. Rondet // Protoplasma. - 1996. - Vol. 190. - N. 1-2. - Р. 16-24.
17. Piotto B. Effects of temperature on germination of stratified seeds of three ash species / B. Piotto // Seed science and technology. - 1994. - Vol. 22. - N. 3. - Р. 519-529.
18. Spethmann W. Steckling vermehrung von Laubbaumarten. Versuche mit Ahorn, Esche, Eiche, Buche, Kirche, Linde, Birke / W. Spethmann // Allgemeine Forst- und Jagdzeitung. - 1982. -Vol. 153. - N. 1/2. - Р. 13-24.
19. Suszka B. Seeds of forest broadleaves: from harvest to sawing / B. Suszka, M. Bonner-Ma-simbert, C. Muller. - Paris : INRA, 1996. - 294 р.
20. Vegetative Propagation Techniques for oak, ash, sycamore and spruce / D. Thompson, F. Harrington, G. Douglas et al. - Dublin : Coford, 2001. - 54 р.
Баюра А.М., Небыков М.В., Собченко В.Ф. Размножение ясеня обыкновенного (Fraxinus еxcelsior) in vitro
Исследован метод размножения растений Fraxinus excelsior L. в условиях культуры in vitro. Проанализирована зависимость морфогенной активности тканей и органов от гормонального состава питательных сред.
Ключевые слова: Fraxinus excelsior, in vitro, питательная среда, экспланты, стерилизация, морфогенез.
Bayura О.M, NebykovM.V., Sobchenko V.F. Reproduction of European ash (Fraxinus excelsior) in vitro
Investigated by the method of reproduction plants Fraxinus excelsior L. in culture conditions in vitro. The dependence of the morphogenesis activity of tissues and organs of the hormonal composition of nutrient mediums.
Keywords: Fraxinus excelsior, in vitro, nutrient medium, explants, sterilization, morphogenesis.
