CC BY
334. Geno- i fenotipicheskaya kharakteristika shtammov bacill-komponentov endosporina [Geno- and phenotypic characteristic of Bacillus strains-components of endosporin], [Article in Russian] / LASafronova [et al.] // Mikrobiologicheskiy zhurnal. - 2012. - Vol. 74, № 5. - P. 55-66.
5. Mazmanian, S.K. A microbial symbiosis factor prevents inflammatory disease / S.K.Mazmanian, J.L.Round, D.Kaspe // Nature. - 2008. - Vol. 453. - P. 620-625.
6. Morelli, L. FAO/WHO guidelines on probiotics: 10 years later/LMorelli, L.Capurso//J. Clin. Gastroenterol. -2012. -Vol.46 (Suppl).-P. 1-2.
7. Probiotics, gut microbiota, and their influence on host health and disease / B.Sanchez [et al.] // Mol. Nutr. Food Res. - 2017. - Vol. 61, №1. - P. 58-69.
8. Probiotics, their health benefits and applications for developing healthier foods: A review / R.Nagpal [et al.] // FEMS Microbiol. Lett. - 2012. - Vol. 334, № 1. - P. 1 -15.
9. Mazankova, L.N. Probiotiki: kharakteristika preparatov i vybor v pediatricheskoy praktike [Probiotics: characterization of drugs and choices in pediatric practice] / L.N.Mazankova, E.A.Lykova // Det. Infekcii. - 2004. - № 1,-P. 18-23.
10. Spore probiotics / I.G.Osipova [et al.] //Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunol. - 2003. - Vol.3. - P. 113-119.
11. Smirnov, V.V. Bakterii roda Bacillus - perspektivnyy istochnik biologicheski aktivnykh veshchestv [Bacteria of genus Bacillus is a prospective source of biologically active substances] / V.V.Smirnov, I.B.Sorokulova, I.V.Pinchuk // Mikrobiol. zhurn. - 2001. - Vol. 63, № 1. - P. 72-78.
12. Sorokulova, I. Preclinical testing in the development of probiotics: regulatory perspective with bacillus strains as an example / I.Sorokulova / Clin. Infect. Dis. - 2008. - № 46. - P. 92-95.
13. Sapego, V.I. Biologicheski aktivnye veshchestva i estestvennaya rezistentnost telyat [Biologically active substances and natural resistance of calves] / V.I.Sapego, E.V.Bernik // Veterinariya. - 2002. - № 5. - P. 44-46.
14. Marchenko, F. Kompleksny podkhod k primeneniyu kormovogo probiotika BioPlus2B v sochetanii s antibiotikoterapiey [An integrated approach to the use of the feed probiotic BioPlus2B in combination with antibiotic therapy] / F.Marchenko, A.Sungurov, O.Bashkirov// Efektivne ptakhivnictvo ta tvarinnictvo. - 2004. - № 3. - P. 29-30
15. Preobrazhenskiy, L.N. Farmakodinamicheskie osnovy i perspektivy primeneniya fermentnykh preparatov v zhivotnovodstve [Pharmacodynamic basics and prospects for the use of enzyme preparations in animal husbandry] / LN.Preobrazhenskiy//Veterinariya selskokhozyaystvennykh zhivotnykh. - 2006. - № 1. - P. 71 -75.
16. Avdeeva, L.V. Biosintez cellyulaz probioticheskimi shtammaml Bacillus subtilis pri sovmestnom vyrashchivanil [Biosynthesis of cellulases by probiotic strains Bacillus subtilis at joint cultivation] / LVAvdeeva, A.I.Osadchaya, M.A.Kharkhota// Mikrobiologiya i biotekhnologiya. - 2010. - № 4. - P. 80-89.
17. Rodionova, N.A. Ksilanaznaya sistema i faktory, stimuliruyushchie biosintez ee komponentov [Xylanase system and factors stimulating the biosynthesis of its components] / N. A. Rodionova, I.V.Itomlinskiy // Mikrobiologiya i nauchno-tekhnicheskiy progress: tez. dokl. 4 syezda Vsesoyuz. mikrobiol. Obshchestva [Microbiology and scientific and technological progress: proceedings from the 4 conference of the All-Union Microbiological society]. - Minsk: Nauka i tekhnika, 1971.-P. 133-134.
УДК: 619:616.98:579.873.21:636.2
РОЗЕТКООБРАЗУЮЩИЕ ЛИМФОЦИТЫ В ОЦЕНКЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
М. О. Баратов - доктор ветеринарных наук, зав.лабораторией.
ФГБНУ «Прикаспийский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт» филиал «Федерального аграрного научного центра республики Дагестан», г.Махачкала (367000, г.Махачкала, ул. Дахадаева, 88; e-mail: alama500@rambler.ru).
В статье представлены результаты изучения активности розеткообразующих лимфоцитов у зараженных, а также неспецифически реагирующих на ППД-туберкулин для млекопитающих животных. В исследования было включено 50 голов крупного рогатого скота. По результатам оценки аллергических и лабораторных методов исследования все животные были разделены на группы: 1 группа - больные туберкулезом с незначительными па-тологоанатомически выраженными изменениями в лимфатических узлах; 2 группа - вакцинированные вакциной БЦЖ; 3 группа - зараженные атипичными (нетуберкулезными) микобакгериями; 4 группа - зараженные M.bovis (штамм 637), специфически реагирующие на ППД-туберкулин для млекопитающих (исследования проведены
VA ЕТЕРННЛРНЫЙ
ВЕТЕРИНАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ, ВИРУСОЛОГИЯ, ЭПИЗООТОЛОГИЯ Jf РАЧ
через 2 мес после заражения) и 5 группа - здоровые животные. По результатам исследования установлена зависимость активности лимфоцитов к розеткообразованию с эритроцитами барана от развития туберкулезного процесса и характера сенсибилизации животных к ППД-туберкулину для млекопитающих. У больных туберкулезом животных число циркулирующих розеткообразующих лимфоцитов выше в сравнении со здоровыми (в среднем 325,40±7,63). Показатели у специфически сенсибилизированных животных не отличались. У вакцинированных и зараженных атипичными микобактериями животных число розеткообразующих клеток меньше 206-309 и 103-278, соответственно. В группе здоровых животных выявлена незначительная активность лимфоидных клеток, вызванная циркуляцией в крови коринебакгерий и наличим у них аллергизирующих свойств к туберкулину. Зависимость розеткообразующей активности сенсибилизированных к туберкулину лимфоцитов от положительной динамики туберкулезного процесса показали и результаты исследования по количественному содержанию присоединенных эритроцитов. Полученные результаты дают основание для использования данного метода при дифференциации неспецифических реакций у реагирующих на ППД-туберкулин для млекопитающих животных.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: розеткообразование, лимфоциты, туберкулез, дифференциация, микобакте-рии, атипичные, ППД-туберкулин, диагностика.
001:10.33632/1998-698Х.2019-3-24-28
Основная проблема туберкулеза крупного рогатого скота - прижизненная диагностика, в частности дифференциальная. Лабораторная диагностика, занимая центральное место среди других методов, в основном сводится к изолированию только классических форм микобакгерий, и не позволяет обнаружить измененные формы (Ьформы, фильтрующие формы, сферобласты, протопласты и тд.), которые при благоприятных условиях могут успешно реверсироваться в типичные клетки. Такое положение значительно снижает результативность лабораторного метода, ставит его в ряд узкопрофильных [1,4].
В этой связи клинически значимым механизмом при диагностике является определение функциональной и антигенной неоднородности лимфоцитов через изучение дефицита или активации иммунокомпетент-ных клеток и, в целом, оценка защитных механизмов организма [2].
Известно, что при некоторых заболеваниях, в том числе и при туберкулезе, изменяется содержание и взаимоотношение Т- и В-популяции лимфоцитов, число которых характеризует потенциальные возможности клеточного и гуморального иммунного ответа. Закономерный интерес к количественному изучению и функциональной активности Т- и В-лимфоцитов вызвано тем, что возможные сдвиги в звеньях иммунной системы могут быть обусловлены реакцией на антиген на ранней стадии течения туберкулезного процесса, выявление которых даст возможность определить в частности и специфичность реакций. Иммунологические методы, используемые в экспериментальных исследованиях и клинической практике, достаточно разнообразны [3,4,5,6,7].
Целью работы явилось изучение розеткобра-зования иммунными лимфоцитами у животных, находящихся на разных стадиях физиологической сопротивляемости к туберкулезному процессу, как возможного теста для распознавания причин сенсибилизации макроорганизма к ППД-туберкулину для млекопитающих.
Материалы и методы. Исследованию подвергли периферическую кровь больных туберкулезом, вакцинированных вакциной БЦЖ, зараженных атипичными микобактериями (avium-intracellulare), зараженных ми-кобакгериям (М.bovis № 637) с минимально активным туберкулезным процессом, а также здоровых животных (по 10 голов в каждой группе).
Для получения лейкоцитов периферическую кровь в количестве 10 мл брали из яремной вены в пробирки с раствором гепарина. Для отделения лейкоцитов от эритроцитов пробу крови осторожно наслаивали на раствор, содержащий смесь фиколл-верографин (плотность раствора 1,077 г/мл), и центрифугировали при 1500 об/мин. в течение 40-45 минут. При этом эритроциты оседали на дне пробирки, а лейкоциты, обладающие меньшей плотностью, оставались наверху в виде мутного кольца. Фракцию лейкоцитов осторожно отсасывали пипеткой и двукратно отмывали средой 199 путем центрифугирования в конечной концентрации 2х106 лейкоцитов в 1 мл среды.
Эритроциты барана трижды отмывали физиологическим раствором, центрифугировали при 1500 об/мин. Далее получили взвесь сенсибилизированных туберкулином эритроцитов. Для этого к 0,5 мл осадка эритроцитов добавили 9,5 мл туберкулина (PPD) в рабочем разведении 1:10 в среде 199, тщательно перемешали пробирки с эритроцитарной взвесью, поместили в термостат при 37°С на 2 часа. После инкубации, эритроциты трижды отмывали от несвязавшегося туберкулина, и из осадка готовили 0,5% взвесь сенсибилизированных эритроцитов в среде 199.
К 0,1 мл лейкоцитарной взвеси прибавляли 0,1 мл сенсибилизированных эритроцитов и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Далее клетки осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин. Затем розетки фиксировали 0,6% глю-таровым альдегидом при комнатной температуре в течение 20 мин, надосадочную жидкость отсасывали, каплю осадка пипеткой наносили на предметное стекло, готовили мазок, фиксировали в метиловом спирте
в течение 10 мин и окрашивали азур-М - эозином. Подсчитывали иммунные розетки в световом микроскопе под иммерсией (90x10). За розетку принимали лимфоцит, фиксировавший на своей поверхности 3 и более эритроцита. Абсолютное содержание розеток в 1 мкл крови определяли по формуле:
х=(А-В-С)/10000; где: х - содержание иммунных розеток в 1 мкл крови; А - общее количество лейкоцитов в 1 мкл крови; В - процентное содержание лимфоцитов; С - процентное содержание иммунных розеток.
Для исключения неспецифической агглютинации эритроцитов с лейкоцитами в каждом случае в отдельную пробирку к 0,1 мл лейкоцитарной взвеси прибавляли 0,1 мл 0,5% взвеси интакгных (не сенсибилизированных туберкулином) эритроцитов [6].
Результаты исследований. В периферической крови больных туберкулезом животных число циркулирующих розеткообразующих лимфоцитов повышено в сравнении со здоровыми в пределах от 289 до 353 в абсолютных цифрах (в среднем 325,40±7,63), с минимальным разбросом между минимальными и максимальными показателями (табл.).
Рассматривая данную группу животных, необходимо заметить, что при патологоанатомическом вскрытии макроскопические изменения величиной с просяное зерно были обнаружены в лимфатических узлах: в подчелюстном - у 2 голов, в подчелюстном и заглоточном - у 3 животных, в органах 5 убитых животных изменения туберкулезного характера не были обнаружены. У всех животных в данной группе диагноз на туберкулез подтвержден культуральным и биологическим методами.
Таблица
Число розеткообразующих лимфоцитов в периферической крови животных (п=10)
Источники лимфоцитов, животные Кол-во подсчитанных лимфоцитов из расчета на 1 гол Из них розеткообразующих Разброс между min/max показателями %
Число, min/max M±m %
Больные 1100 289-353 325,40+7,63 29,58 64 5,81
Вакцинированные (БЦЖ) 1100 206-309 297,10±2,73 27,00 103 9,36
Зараженные атипичными микобактериями (ашггчг№асе11и1аге) 1100 103-278 205,40±21,10 18,67 175 15,90
Зараженные М.Ьсмб (№637) 1100 256-332 309,80 ±8,76 28,16 76 6,90
Здоровые 1100 17-120 66,40+11,78 6,03 103 9,36
У вакцинированных и зараженных атипичными микобактериями животных (неспецифически реагирующие на ППД-туберкулин для млекопитающих) число розеткообразующих клеток меньше 206-309 и 103-278, соответственно, со значительным разбросом ро-зеткообразующей активности между минимальными и максимальными показателями (более чем 2 раза). Такой разброс розеткообразования иммунными лимфоцитами в этих группах, вероятно, связан с разной сенсибилизирующей лимфоциты активностью вакцинного штамма и атипичных микобактерий.
У зараженных микобактериями животных (5 группа) с минимально активным туберкулезным процессом розеткообразующие показатели лимфоцитов приближаются к значениям характерным больным туберкулезом животных. В данный период (до трех месяцев после заражения) у животных обычно не отмечается развития выраженного патологического процесса и значительных функциональных изменений в клеточном и гуморальном иммунитете.
Наличие некоторой активности лимфоидных клеток к присоединению эритроцитов в группе здоровых животных объясняется циркуляцией в крови микобактериоподобных микроорганизмов, в частности коринебактерий, которые способны вызвать кратковременную сенсибилизацию организма животных к туберкулину, что и было подтверждено проведенными нами в дальнейшем исследованиями [1, 3]. От 5 здоровых животных (5 группа) из яремной вены взяли пробы крови. В результате удалось выделить, в трех случаях Corynebacterium xerosis (№1911), C.unternice nontoxigen (7227) и C.bovis, из одной пробы Nocardia asteroides (ВКМ Ас 856), в одном случае результаты остались неопределенными.
Зависимость розеткообразующей активности сенсибилизированных к туберкулину лимфоцитов от положительной динамики туберкулезного процесса показали и результаты исследования по количественному содержанию присоединенных эритроцитов (рис.).
По оси ординат, количество присоединившихся эритроцитов.
Рис. Среднее количество эритроцитов присоединенных к лимфоцитам.
Исходя из приведенных данных, можно утверждать, что конъюгирующая способность сенсибилизированных к туберкулину эритроцитов барана к лимфоцитам животных зависит от характера сенсибилизации последних к туберкулину. В группах с больными и зараженными М.bovis активность выше в среднем 9 и 7 присоединенных эритроцитов соответственно.
У неспецифически реагирующих животных (2 и 3 группы) розеткообразующая активность ниже с минимальным разбросом 4 и 5 эритроцитов.
Заключение. Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что в крови здоровых животных содержание иммунных лимфоцитов сенсибилизированных к туберкулину значительно меньше, а в ряде случаев они не выявляются вовсе. Наличие незначительной активности объясняется иммунизирующей макроорганизм способностью мико-бактериоподобных микроорганизмов, имеющих с ми-кобактериями общие группоспецифические данные.
У больных туберкулезом содержание иммунных лимфоцитов высокое. Наличие минимального разброса между показателями есть отражение высокой активности к розеткообразованию.
Литература
Высокое содержание иммунных розеток у зараженных микобактериями животных по нашим данным является показателем значительно выраженной способности микобактерий к антигензависимой дифференцировке лимфоцитов в центральных органах иммунитета в короткие сроки после заражения. С помощью данного иммунологического теста можно легко установить наличие специфической сенсибилизации в организме зараженных микобактериями животных, на ранней стадии заражения.
У животных с неспецифической сенсибилизацией к туберкулину розеткообразующая способность выявляется практически повсеместно, но значительно в меньших количествах.
Предлагаемый нами метод определения иммунных розеток может быть, с успехом использован при диагностике туберкулеза, а также в дифференциальной диагностике при определении характера сенсибилизации организма животных к ППД-туберкулину для млекопитающих. Следует добавить, что данные по изучению иммунологического состояния животных могут способствовать корректировке противотуберкулезных мероприятий.
1. Сенсибилизирующие свойства коринебактерий к туберкулину / М.О.Баратов, М.М.Ахмедов, О.П.Сакиди-биров, Д.А.Девришов // Ветеринарная медицина. - 2011. - №1. - С. 31-33.
2. Ветшигора, А.Е. Основы иммунологии / А.Е.Ветшигора. - Киев: Вища школа, 1975. - 320 с.
3. Лискова, Е.А. Выделение коринебактерий из объектов животноводческих помещений / Е.А.Лискова, К-Н.Слинина, ААБлохин // Путь науки. - 2015. - № 12. - С. 31-32.
4. Радченков, В.П. Розеткообразующие лимфоциты крупного рогатого скота и рациональные методы их выявления / В.П.Радченков, И.И.Соколовская //Лечебное дело. -1980. - № 8. - С. 476-478.
5. Иммунофизиология / ВАЧерешнев, Б.Г.Юшков, В.Г.Климин, Е.В.Лебедев. - Екатеринбург: УРО РАН, 2002. -260 с.
6. Петров, Р.В. Основы иммунитета и иммунная биотехнология / Р.В.Петров, Р.М.Хаитов // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2000. - № 11. - С. 18-21.
7. Tizard, I.R Veterinary Immunology. An Introduction / I.R.Tizard W.B.Saunders. - USA, state Michigan: Michigan University, 2004.-494 p.
ROSETTING LYMPHOCYTES IN THE ASSESSMENT OF THE IMMUNOLOGICAL STATE IN BOVINE TUBERCULOSIS
Baratov M. 0. - Doctor of Veterinary Sciences.
FSBi "Caspian Zonal-Research Veterinary Institute" branch of the "Federal Agrarian Scientific Center of the
Republic of Dagestan" (e-mail: Alama500@rambler.ru).
The results of studying the activity of rosetting lymphocytes in infected, as well as non-specifically reacting to PPD-tuberculin for mammals are presented in the article. The research included 50 heads of cattle. According to the results of the evaluation of allergic and laboratory research methods, all animals were divided into groups: the 1 -st group - patients with tuberculosis, with minor pathologoanatomically pronounced changes in the lymph nodes; the 2-d group vaccinated with BCG vaccine; the 3-d gr. infected with atypical (non-tubercular) mycobacteria; the 4-th gr. infected with M.bovis( strain 637) specifically reacting to PPD-tuberculin for mammals (studies were conducted in 2 months after infecting) and the 5-th group healthy animals. According to the results of the study, dependence of the lymphocytes activity to rosette formation with sheep erythrocytes on the development of the tuberculous process and the nature of animal sensitization to PPD-tuberculin for mammals was established. In animals with tuberculosis the number of circulating rosetting lymphocytes is higher in comparison with healthy ones, (in an average of 325.40 ± 7.63). Parameters in specifically sensitized animals did not differ. In animals vaccinated and infected with atypical mycobacteria the number of rosetting cells is less than 206-309 and 103-278, respectively. In the group of healthy animals insignificant activity of lymphoid cells was revealed, caused by the circulation of corynebacteria in the blood and their allergenic properties to tuberculin. The dependence of the rosetting activity of lymphocytes sensitized to tuberculin on the positive dynamics of the tuberculosis process was also shown by the results of the study on the quantitative content of attached erythrocytes. The results obtained give reason to use this method for the differentiation of nonspecific reactions in reacting to PPD-tuberculin for mammals.
KEY WORDS: rosetting, lymphocytes, tuberculosis, differentiation, mycobacteria, atypical, PPD-tuberculin, diagnosis.
References
1. Sensibiliziruyushchie svoystva korinebakteriy k tuberkulinu [Sensitizing properties of corynebacteria to tuberculin] / M.O.Baratov, M.M.Akhmedov, O.P.Sakidibirov, D.A.Devrishov//Veterinarnaya medicina. - 2011. - № 1. - P. 31-33.
2. Vetshigora, A.E. Osnovy immunologii [Basics of Immunology] / A.E.Vetshigora. - Kiev: Vischa shkola, 1975. - 320 p.
3. Liskova, E.A. Vydelenie korinebakteriy iz obyektovzhivotnovodcheskikh pomeshcheniy [Isolation of corynebacteria from livestock facilities] / E.A.Liskova, K.N.SIinina, A.A.BIokhin // Put nauki. - 2015. - № 12. - P. 31-32.
4. Radchenkov, V.P. Rozetkoobrazuyushchie limfocity krupnogo rogatogo skota i racionalnye metody ikh vyyavleniya [Rosetting lymphocytes of cattle and rational methods for their detection] / V.P.Radchenkov, I.I.Sokolovskaya // Lechebnoe delo. -1980. № 8. - P. 476-478.
5. Immunofiziologiya [Immunophysiology] / V.A.Chereshnev, B.G.Yushkov, V.G.KIimin, E.V.Lebedev. - Ekaterinburg: URORAS.-2002.-260 c.
6. Petrov, R.V. Osnovy immuniteta i immunnaya biotekhnologiya [The basics of immunity and immune biotechnology] /R.V.Petrov, R.M.Khaitov//VestnikRossiyskoyakademii medicinskikh nauk. - 2000. - № 11. - C. 18-21.
7. Tizard, I.R Veterinary Immunology. An Introduction / I.R.Tizard W.B.Saunders. - USA, state Michigan: Michigan University, 2004.-494 p.
