CC BY
40
тастазирующих опухолей [3 ].
Все перечисленные штаммы могут быть представлены заинтересованным организациям группой метаста-зирования ОНЦ РАМН.
© Коллектив авторов, 1993 УДК 616-006-092
В.И. Рябкова, И.А. Карпов, В.К. Соколова,
А. Локшин
РОСТ ТРАНСПЛАНТАТА ОПУХОЛИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ВВЕДЕНИИ ПЕЧЕНОЧНОЙ ТКАНИ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫМ МЫШАМ
НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей
Известно, что печень является комплексным органом с очень широким функционально-метаболическим профилем, который тесно связан с различными биологическими и специфическими иммунными защитными реакциями организма [1, 12]. В гепатоцитах вырабатываются различные факторы, которые могут как активировать супрессорные клетки [9 ], так и блокировать пролиферативный ответ лимфоцитов человека [19], что в конечном результате может способствовать инвазии и пролиферации опухолевых клеток. Возможно, что с этими факторами и связано то "микроокружение", которое создает благоприятные условия для выживания метастазов опухолей в самой печени. Поэтому появление опухоли в печени, либо первоначальной, либо в виде метастаза, часто означает плохой прогностический признак для пациента.
Простая модель для изучения роли этих факторов в опухолевом процессе in vivo может обеспечить эффективный способ выяснения сложных взаимодействий между этим витальным органом и злокачественным новообразованием. Ранее мы показали возможность создания такой модели, индуцировав толерантность к клеткам меланомы человека у иммунокомпетентных мышей путем их летального облучения и защиты клетками эмбриональной мышиной печени [2 ]. В данной работе влияние факторов печени изучалось по оценке скорости роста опухоли человека, имплантированной под капсулу почки (ПКП) мышей [5, 8 ].
Известно, что введение субклеточных препаратов печени позволяет увеличить продолжительность выживания аллотрансплантатов у мышей [11 ], а также почечных алло- или ксенотрансплантатов у кроликов [16]. Причем индуцированная печенью иммуносупрессия эффективна даже среди филогенетически далеких организмов. Так, W. Baldwin и соавт. [7 ] показали на саламандрах возможность значительного увеличения выживае-
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Сенин В.М., Бунцевич А.М., Афанасьева А.В., Киселева Н.С//Экспер. онкол. — 1983. — Т. 5, № 6. — С. 35—39.
2. Сенин В.М., Иванов А.В., Афанасьева А.В., Бунцевич АМ.//Вестн. АМН СССР. — 1984. — № 5. — С. 85—91.
3. Ebralidze A., Tulchinsky Е., Grigorian М. el al.//Genes and development. — 1989. — Vol. 3. — P. 1086—1093.
Поступила 27.05.92. / Submitted 27.05.92.
V.I. Ryabkova, I.A. Karpov, V.K. Sokolova,
A. Lockshin
GROWTH OF HUMAN TUMOR XENOGRAFTS AFTER INOCULATION OF LIVER TISSUE INTO IMMUNOCOMPETENT MICE
Research Institute of Experimental Diagnostics and Therapy of Tumors
The liver, a complex organ with a broad range of metabolic functions, plays an important and diverse role in the organism’s biological and immune defense mechanisms [1, 12]. Hepatocytes generate factors which activate suppressor cells [9 ] and block lymphocyte proliferation [19], thereby promoting tumor cell invasion and growth. These factors also may help to create the microenvironment which enables liver meta-stases to form. Tumor in the liver, whether arising from the organ itself or from metastases, generally signifies a poor patient prognosis.
A simple in vivo model for studying the role of hepatic factors in malignancy would facilitate a closer examination of the complex inter-relationships between this vital organ and cancer. Earlier, we demonstrated that immunological tolerance to an implanted human melanoma could be induced in immunocompetent mice by inoculating embryonic liver cells in animals previously given lethal whole-body irradiation [2 ].
Inoculation of subcellular liver fractions can increase the survival of allogeneic explants in mice [11 ] as well as allogeneic and xenogeneic renal transplants in rabbits [16]. Liver-induced immunosuppression has been observed even for phylogenetically distant species. Baldwin et al. [7] demonstrated that survival of skin allotransplants was enhanced by inoculating the host with liver fragments obtained from the donor species.
Here we report that inoculation of mouse liver components promotes the growth of human tumors implanted in the sub-renal capsule (SRC) of immunocompetent mice [5, 8 ].
Materials and Methods: Hybrid (CBA x C57BL/6)F1 and BALB/c mice, bred in the Cancer Research Center vivarium, were used at the age of 2 — 3 months. The day before tumor implantation, the mice were irradiated (7 Gy) whole-body using a Cs source (0.087 Gy/s).
мости аллотрансплантата кожи при дополнительном введении кусочков печени того же донора.
В настоящей работе нами показана возможность увеличения продолжительности жизни ксенотранс-плантата опухоли человека ВЯО, подсаженной ПКП у нормальных мышей.
Материалы и методы. Использовали мышей гибридов (СВАхС57ВЬ/6)Р1 и линии ВаЬВ/с в возрасте 2—3 мес разводки вивария ОНЦ РАМН. Живдтных тотально облучали в дозе 7 Гр на радиационной установке Се (мощность 0,087 Гр/с) за сутки до трансплантации опухолей. При использовании цитозара ("иррИп") препарат вводили за 2 сут до облучения [18].
Меланома человека ВЯО [14] была использована после серийного пассирования каждые 14 дней на иммунодепрессированных мышах, подвергавшихся иммунодепрессии при облучении либо 7 Гр, либо
8,5 Гр после введения цитозара [6]. ПКП подсаживали жизнеспособную часть опухоли размером около 1 мм . Операцию по имплантации опухоли ПКП проводили, как описано ранее [4]. Измеряли два взаимно перпендикулярных диаметра в день трансплантации и через определенный срок после операции, когда мышей забивали.
Печень и мышцы голени измельчали и вводили внутрибрюшинно за 1 день до трансплантации опухоли. Гепарин (Минмедбиопром) и супернатант от клеток печени после центрифугирования (5 мин, 3000 в) также вводили внутрибрюшинно.
В каждой группе ВИО использовали по 6 мышей. Опыты были повторены хотя бы дважды. Статистическую обработку проводили с использованием критерия 1/-1ез1. Для цитологического изучения материала применяли стандартные методы.
Результаты и обсуждение. В табл. 1 представлены данные о влиянии внутрибрюшинной имплантации кусочков печени на рост меланомы В1Ю ПКП у иммунокомпетентных мышей. Кусочки печени, полученные как от сингенных, так и от аллоген-ных доноров, давали значительный (р < 0,02 ) рост опухоли по сравнению с таковыми у мышей, не подвергавшихся иммунодепрессии. После введения 500 мг сингенной печени средний объем опухоли увеличивался через 11 дней по сравнению с исходным примерно в 200 раз. Снижение массы наблюдалось лишь у мышей, получивших аллогенную печень от донора ВаЬВ/с, и составило 9 % (р<0,07 по сравнению с мышами, не подвергавшимися иммунодепрессии).
При цитологическом исследовании трансплантата меланомы ВЯО от мышей, подвергнутых введению сингенной печени, обнаружено большое количество полиморфных злокачественных клеток с крупными ядрами неправильной формы. Отмечаются множественные нуклеолы и встречается амитотическое деление. Цитоплазма клеток базофильная, мелковакуоли-зированная. Пигмента нет; макрофагов не обнаружено. В целом цитологическая картина соответствовала описанным ранее характеристикам меланомы ВЯО [3 ]. У мышей же, которым, кроме имплантации ПКП меланомы ВЯО была введена печень от аллогенного донора ВаЬВ/с, были обнаружены такие же злокачественные клетки, но их количество было небольшим по сравнению с лимфоидными элементами.
Супернатант, полученный от клеток печени, обеспечивал рост ксенотрансплантата, но в небольшой степени. Однократное введение гепарина также стимули-
The human melanoma BRO [14] was serially passaged every 14 days in mice immunosuppressed either by 7 Gy irradiation alone or by
8.5 Gy irradiation preceded by a single injection of 200 mg/kg cyta-rabine (Upjohn) [18]. Fragments of viable tumor approximately 1 mm in volume were implanted SRC [4]. Two perpendicular diameters of each tumor were measured immediately after implantation and after the mice were sacrificed.
Murine liver and muscle tissue were minced and inoculated i.p. the day following tumor implantation. Heparin (Minmedbioprom) was injected i.p. as was a soluble extract obtained after centrifugation (3,000 g x 5 min) of homogenized liver cells.
Each experimental group consisted of 6 mice, and experiments were conducted at least twice. The Mann-Whithey U-test was used to compare statistical differences. Standard cytological procedures were used to examine tomor specimens.
Results and Discussion. Table 1 shows that inoculated liver fragments promote the growth of BRO melanoma tumors implanted SRC in immunocompetent mice. There was extensive tumor growth in mice inoculated with either syngeneic or allogeneic liver tissue (p < 0.02 in comparison to untreated control mice). A mean tumor volume increase of 200-fold was obtained eleven days after inoculating 500 mg of syngeneic liver tissue. Of all the treatment groups, only mice receiving 250 mg of allogeneic liver fragments experienced weight loss (9%) (p < 0,07 compared to control mice).
Cytological examination of BRO tumors obtained from mice inoculated with syngeneic liver revealed an abundance of polymorphic malignant cells with prominent irregular nuclei. There were numerous nucleoli and occasional amitotic division. Small vacuoles were present in the basophilic cytoplasm. No intracellular pigment was detected, and macrophages were absent. The morphology of these cells corresponds to that described earlier for the BRO melanoma [3]. A similar cytological picture was observed for tumors obtained from mice given allogeneic liver, although a large number of lymphoid elements also were present.
Injection of soluble liver cell extract also promoted the growth of xenotransplanted tumor, albeit to a lesser degree. A single injection of heparin likewise stimulated BRO tumor growth, whereas inoculation of minced muscle tissue had no effect (table 2).
In order to determine how long BRO cells remained viable in Fi mice inoculated with syngeneic liver (500 mg), tumor fragments obtained after 12, 15 or 19 days growth were implanted SRC in previously irradiated mice and also were cultured in vitro. Cells obtained 12 days after tumor implantation grew well both in vivo and in vitro, whereas cells obtained after 15 days could be cultured in vitro but formed tumors in only one-half of the new recepient mice. Only tumor remnants were found in mice 19 days after implantation, although cells from these tumors also grew in culture.
The idea of inoculating liver tissue to induce immunosuppression is not new. To our knowledge, however, ours is the first report of a murine model for studying the promotion by liver factors of human tumor growth
Таблица 1 Table 1
Влияние введения печеночной ткани на рост опухоли BRO, имплантированной ПКП мышам (CBAxC57BI/6)Fl, через 11 сут после трансплантации
Effect of inoculated liver tissue on the growth of BRO tumors implanted in the SRC of (CBA x C57BL/6)Fi mice, 11 days after implantation
Вид иммуносупрессии Мыши-доноры Масса введенной печеночной ткани, мг Степень увеличения объема опухоли*
Облучение, 7 Гр Radiation (7 Gy) — — 264
Печеночная ткань Liver tissue (CBAxC57BL/6)F1 500 242
Печеночная ткань Liver tissue (CBAxC57BL/6)F1 250 104
Печеночная ткань Liver tissue BaLB/c 250 104
Без иммуносупрессии / No treatment 1
Treatment Donor mice Liver mass inoculated, mg * Tumor volume Increase
*
Здесь и в табл. 2 по сравнению с исходным объемом.
Here and in table 2 in comparison with initial tumor volume.
ровало рост имплантированной опухоли, в то время как используемые в качестве контроля кусочки мышц не способствовали росту меланомы BRO (табл. 2).
Для определения времени жизнеспособности опухолевых клеток при внутрибрюшинном введении печени опухоль BRO извлекалась из-под капсулы почек мышей через 12, 15 и 19 дней после имплантации и была пассирована на новых мышах и в культуре. Так, опухоль, извлеченная через 12 дней, хорошо росла после пассажа и до 15 дней наблюдался рост опухоли у половины мышей, получивших ксенотрансплантат. Через 19 дней ПКП были только остатки опухоли, хотя клетки из них успешно выращивались in vitro.
Идея использования трансплантатов печени в качестве иммунодепрессанта не нова, однако попытки создания на этой базе мышиной модели для выращивания опухоли человека у иммунокомпетентных животных ранее не предпринимались. Поэтому нами первоначально была проведена оценка возможности создания такой модели и, как видно из табл. 1, был получен выраженный эффект как от гистосовместимого, так и от гистонесовместимого донора печеночных клеток. Степень иммуносупрессии, вызванной введением син-генной печени, зависела от дозы и при введении 500 мг была практически такой же, как и при тотальном облучении в дозе 7 Гр.
Как видно из табл. 2, иммуносупрессию можно частично отнести за счет гепарина, эффект которого представляется вероятно опосредованным и скорее всего через аг-макроглобулин, который проявляет свою активность в контролировании коагуляции крови, фибринолизе и в ограничении протеолитической активности факторов, выделенных из поврежденных тканей [10]. Известно, что очищенный препарат аг-макроглобулина ингибирует in vitro митогениндуциро-ванную стимуляцию лимфоцитов человека и животных [15]. Поэтому основной эффект иммуносупрессии у мышей — опухоленосителей ксенотранспланта-та можно отнести за счет других эндогенных субстан-
in immunocompetent animals. As shown in table 1, extensive tumor growth resulted after inoculating either histocompatible or non-histocompatible liver tissue. The degree of immunosuppression was dependent on the amount of liver inoculated, and the maximum observed growth was nearly equal to that obtained in mice receiving 7 Gy whole-body irradiation.
As shown in table 2, the immunosuppressive effect of liver may be attributed at least partially to heparin. This effect may be mediated through a-macroglobulin, which plays an important role in blood coagulation and fibrinolysis and which inhibits the activity of proteolytic factors released by damaged tissues [10]. Purified a-macroglobulin inhibits mitogen-induced stimulation of human and animal lymphocytes in vivo [15].
Immunosuppression of mice bearing xenotrans-planted tumors also may be attributed to other endogenous substances capable of activating suppressor cells. Artifical induction of liver ischemia, which causes weight loss, also leads to reduced thymus cellularity and an increase of suppressor T-lymphocytes (13). Various points of view have been advanced for the role of a-fetoprotein, which also may contribute to immunosuppression (17).
The model described in this report should prove useful in studying the growth-promoting effects of liver and liver factors on human tumors implanted in immunocompetent animals and in providing approaches to elucidating the mechanisms of action of these factors.
Acknowledgements. The authors thank M.F. Kyzmina and E.B. Lobacheva for assistance in performing these experiments.
ЛИТЕРАТУРА /REFERENCES
1. Арцимович Н.Г., Ломакин М.С., Казанский Д.Б., Настоящая Н.Н. II Успехи соврем, биол. — 1991. — Т. 3, № 6. — С. 932—947.
2. Богуш. Т.А., Локшин А., Смирнова Г.Б. и др. // Экспер. он-кол. — 1990. — Т. 12, № 5. — С. 59—62.
Таблица 2 Table 2
Влияние введения компонентов печени на рост опухоли BRO, имплантированной ПКП мышам (СВА х C57BL/6)Fl, через 12 сут после трансплантации
Effect of inoculated liver components on the growth of BRO tumors implanted in the SRC of (CBA x C57BL/6)Fl mice, 12 days after implantation
Вид иммуносупрессии Масса введенной печеночной ткани, мг Степень увеличения объема опухоли*
Печеночная ткань Liver tissue 500 150
Супернатант от 500 мг печеночной ткани Soluble liver extract — 36
Гепарин, 120 ЕД Heparin (120 U) — 119
Гепарин, 60 ЕД Heparin (60 U) — 110
Мышечная ткань Muscle tissue 500 0,4
Без иммунодепрессии No treatment 0,3
Treatment Liver mass inoculated, mg Tumor volume Increase*
ций, которые способны активировать супрессорные клетки. Экспериментально такое предположение подтверждено путем искусственно вызываемой у крыс ишемии печени, которая приводит к снижению массы, клеточности тимуса и появлению супрессорных Т-лимфоцитов [13]. Что же касается а-фетопротеина, то, хотя и основная функция фактора — иммуносуп-рессивная, на этот счет имеются различные точки зрения [17].
Таким образом, нами показана принципиальная возможность изучения сложных влияний печени, ее факторов на рост человеческих опухолевых клеток у иммунокомпетентных животных и возможные подходы в этом направлении.
Авторы благодарят М.Ф. Кузьмину и Е.Б. Лобачеву за помощь в проведении исследований.
3. Локшин А., Богуш Т.А., Смирнова Г.Б. и др. // Вестн. АМН СССР. — 1988. — № 12. — С. 69—73.
4. Локшин А., Полянская Н.И., Машковщев Ю.В. и др. // Бюл. экспер. биол. — 1990. — № 7. — С. 88—89.
5. Локшин А., Полянская Н.И., Машковцев Ю.В., Дзюба-нов К.Г. II Там же. — 1991. — № 10. — С. 428—430.
6. Локшин А., Рябкова В.М., Соколова В.К. II Там же. — 1992.
— № 5. — С. 518—520.
7. Baldwin W.M., Cohen N. II Transplantation. — 1970. — Vol. 10, № 6. — P. 530—537.
8. Bogden A.E., Haskell P.M., LePage D.J. et al. // Exp. Cell Biol.
— 1979. — Vol. 47. — P. 281—293.
9. Divanyan H.B. II Докл. Болг. АН — 1985. — Vol. 38. — P. 719.
10. Fuchs H.E., Pizzo S.V. II J. clin. Invest. — 1983. — Vol. 72. — P. 2041.
11. Hilgert I., Kristofova H. 11 Folia biol. (Praha). — 1967. — Vol. 13. — P. 284.
12. Hume D.A., Doe W.F. II Immunology of the gastrointestinal tract and liver / Eds M.F. Heyworth, A.I. Jones. — New York, 1988.
— P. 23.
13. Lie Т., Nakayama Y., Hohike C., Nakano H. II Res. exp. Med.
— 1985. — Vol. 185. — P. 245.
14. Lockshin A., Giovanella B.C., Delpolyi P.D. et al. // Cancer Res. — 1984. — Vol. 45. — P. 345—350.
15. Miyanaga O., Okubo H., Kudo J. et al // Immunology. — 1982.
— Vol. 47. — P. 351.
16. Owen E.R. II Med. J. Aust. — 1969. — Vol. 1. — P. 354.
17. Shepard H.W., Sell S., Trefts P., Bahu R. Hi. Immunol. — 1974 . — Vol. 119. — P. 98.
18. Steel G.G., Courtenay V.D., Rostom A.Y. II Brit. J. Cancer. — 1978. — Vol. 37. — P. 224—230.
19. Su Her Lin, Huang Ho, Li Chia Li, Han Shou Huai II Immunol. Invest. — 1987. — Vol. 16. — P. 281.
Поступила 10.11.92./Submitted 10.11.92.
