CC BY
20
УДК: 616. 097. 053. 2
Маслянко РЛ., д.б.н, професор Олексюк 1.1., к.б.н., доцент Божик Л.Я., к.в.н., асистент Лье1еський нащональний утеерситет еетеринарног медицины та бютехнологт
¡мет С.З. Гжицького
РОЛЬ В-Л1МФОЦИТ1В ПРИ 1МУНОДЕФ1ЦИТАХ
У статт1 дана характеристика В-л1мфоцит1е р1зного фенотипу та гх роль у теарин I людини з ¡мунодефщитним станом. Встаноелено, що у быьшост1 хеорих теарин еияелено значне зниження усгх субпопуляцш В-лгмфоцитге, особлиео В-клтин пам'ят1. При дослгдженнг клтгчних прояе1е ¡мунодефщиту е залежност1 е1д зниження В-клтин пам 'ят1 показана схож1сть цього феномену з аутогмунною патолог1ею та ¡ншими л1мфоденопат1ями.
Ключо^^ слова: В-л1мфоцити, В-клтини пам 'ят1, ¡мунодефщит
Комплексний iмунодефiцит (К1Д) - один iз найбшьш поширених iмунодефiцитiв, серед рiзних захворювань тварин [7, 11, 13]. Такий iмунодефiцитний стан людини i тварин об'еднуе групу дефщиив природно! резистентности антитшоутворення, гетерогенну як за патогенезом, так i за клмчними та лабораторними ан^зами. Цей iмунодефiцит характеризуемся зниженням рiвня iмуноглобулiнiв рiзних класiв, яким передуе недостатнiсть Т- i В- кл^инних ланок iмунiтету, що призводить до розвитку рецидивуючих iнфекцiйних захворювань. Найхарактершшою клiнiчною ознакою такого iмунодефiциту е рецидивуючi шфекци дихально! системи. При цьому у значно! кшькост хворих розвиваються розлади шлунково-кишкового тракту, супутш лiмфопролiферативнi та аутоiмуннi патологи [1, 5, 17]. У тварин з К1Д нормальна або знижена кшьюсть В^мфоциив у периферичнiй кровi часто поеднуеться з з дефектом !х диференщацп у вiдповiдь на рiзноманiтнi стимули. Результатом дефекту диференщацп В-клiтин е вiдсутнiсть плазмоцидiв у лiмфоlдних органах i порушення синтезу специфiчних антитiл [6,7,21].
Активацiя та диференщащя В-клiтинами вимагають взаемоди !х з Т-клiтинами, в процес яко! обидвi клiтини передають сигнали як через безпосереднiй контакт рецепторiв з лiгандами, так i через видшення цитокiнiв. Взаемодiя мiж В-кл^инами рецептором СД 27+ та його л^андом СД 70 на активованих Т-лiмфоцитах - гелперах е критичною для диференщацп В-лiмфоцитiв у плазматичш клiтини, якi представляють собою «мшроскошчш фабрики по виробництву iмуноглобулiнiв (антитш)». Вiдомо, що СД 27+ е маркером В-клiтин пам'ятi - субпопуляци В-клiтин, якi при активацп антигеном швидко трансформуються спочатку у бластш клiтини, а потiм у плазмоцити. Молекули СД 27+ належать до групи рецепторiв фактора некрозу пухлин (ФНП), що контролюють диференщащю В- лiмфоцитiв [12,16,23].
139
Шсля цього - незалежного стану розвитку в юстковому мозку (КМ) В-лiмфоцити залишають КМ i створюють популяцiю первинних «незайманих» СД 27+ В-лiмфоцитiв (naive B-cells).
Пiсля стимуляци лiмфоiдних В^мфоцити прямують в центри розмноження вторинних лшощних органiв (лiмфовузлiв, селезiнки) i диференцiюються у плазматичнi клiтини, або В-кл^ини пам'ятi. В-клiтини пам'ятi беруть участь у вториннш iмуннiй вщповвд на вакцинацiю чи спонтанне зараження конкретним збудником шфекцп (табл. 1).
Таблиця 1
Участь В-л1мфоцит1в у первиниш i вториннш 1муннш вщповщ1
Властивоси Первинна вiдповiдь Вторинна вiдповiдь
Клiтини, що беруть участь Первиннi «незаймаш» В-лiмфоцити В-лiмфоцити пам'ятi
Пiсля контакту з антигеном ( активащя) 4-7 днiв 1-3 дш
Час появи iмунiтету 10-14 дшв 8-10 годин
Напруженiсть iмунiтету Залежить вiд антигену У 100-1000 разiв вища, нiж при первиннiй iмунiзацii
Продукщя iзотопiв антитiл Дом^е IgM Домiнуе IgG
Тип антигену Т-залежнi i Т-незалежнi Т-залежнi
Афшшсть антитiл Низька Висока
В-клiтини пам'ятi (СД 27 ) розподiляються на двi субпопуляци: В-кл^ини пам'ятi СД 27+ IgД+ (марпнально! зони селезiнки та бiльш диференцшоваш СД 27+ IgД- В-клiтини пам'ят центрiв розмноження фолiкулiв лiмфатичних вузлiв [22]. СД 27+ IgД+ беруть участь у Т- незалежнш iмуннiй вiдповiдi, а СД 27+ ^Д- - у Т-залежнiй iмуннiй вщповвд органiзму на антиген i характеризуются здатнiстю переключення синтезу антитiл класу IgM на IgG (switched memory В cells) [4, 12, 19].
При наявност К1Д значно порушуеться розвиток плазматичних клiтин, В-клiтин пам'яи, що вказуе на дефект стади диференцiацii В-лiмфоцитiв [10,18,24]. За даними [9, 11, 15], клЫчш прояви у пащенив з К1Д корелюють зi ступенем порушення В-клiтин пам'ят1
Матерiали i методи дослщжень. Визначення фенотипу В^мфоциив у кровi телят з К1Д, якi належали навчально-науково-виробничому центру (ННВЦ) «Комарнiвський» Львiвського нащонального унiверситету ветеринарноi медицини та бютехнологш iменi С.З. Гжицького, проведено на кафедрi епiзоотологii цього ж ушверситету. Дослiди проводились на двох групах телят раннього в^ (дослiдна, в кшькост 12 голiв - з наявними ознаками К1Д i контрольна - 8 голiв - клмчно здоровi тварини). Дiагноз К1Д встановлено на пiдставi аналiзу клiтинних проявiв та iмунологiчних порушень
140
згщно з критерiями ВООЗ та Свропейського товариства первинних iмунодефiцитiв.
У вЫх пщдослщних телят визначали рiвень iмуноглобулiнiв у сироватщ кровi за методом Манчiнi та осадження розчином сульф^ натрiю (Na2SO3) за Р.П. Маслянко та ш. (2001).
Подальше iмунологiчне обстеження включало визначення кшькосп лiмфоцитiв та !х субпопуляцiй (СД 3+, СД 4+, СД 8+, СД 19+) за допомогою методу проточно! цитометрii (FACS can, "Becton Dickinson"). Визначення кшькост субпопуляцii В-лiмфоцитiв проводили шляхом трикольорово! проточно! цитофлуорометрii за B.L. Ferry et.al. (2005).
Принцип методу полягае в тому, що 50 мл гепаринiзованоi кровi обробляють сумiшшю моноклональних антитiл СД 27-FITC (BD- Biosciences, USA), анти- IgD-Biotin (BD-Biosciences, USA) та СД 19-PE ( BD-Biosciences, USA) протягом 30 хв. при юмнатнш температурi у темному мющ. Потiм лiзують еритроцитарну масу за допомогою 1,5 мл розчину FACS lyse (BD-Biosciences, USA) протягом 10 хв. у затемненому мющ. Клiтини двiчi вiдмивають забуференим фосфатами фiзiологiчним розчином (PBS) по 5 хв. при 500д. Вiдмитi кл^ини вiдмивають i ресуспензують в 400 мл 1 % - розчину формальдепду. Зчитування результатiв проводять на проточному цитометрi FACS саn не тзшше 24 год. пiсля зафарбування.
Результати досл1дження. Першi симптоми захворювань телят у виглядi дiареi з'явились вже на другу добу життя. Середнш вiк встановлення дiагнозу КЩ - 14 днiв (3-18 дшв).
При дослiдженнi iмуноглобулiнiв всiх трьох клаав у сироватцi кровi було вияснено, що найбiльш вираженого зниження зазнавали IgG у хворих телят на К1Д 1,8±0,05 г/л, при нормальному рiвнi 2,9±0,1 г/л. Рiвень IgA був в межах норми тшьки у одного хворого теляти, вс iншi дослiднi тварини мали нижчий вмiст цього секреторного iмуноглобулiну у сироватцi кровi, у п'яти iз дванадцяти телят вiн був менше 0,2 г/л. Нормальний вмют IgM (бiльше 0,4 г/л) спостер^али у семи обстежених телят дослщно! групи.
За кiлькiстю В-лiмфоцитiв у кровi телята з вираженою дiареею поступалися тваринам контрольно! групи, !х вiдносне число наближалося до нижньо! межi нормального рiвня, характерного для клмчно здорових тварин (10,9±0,8% проти 12,3±1,1%).
Щодо абсолютного числа В^мфоциив у кровi, то воно також було меншим у хворих телят, вщповщно 246±21 мм3 проти 318±24 мм3 (Р<0,01).
Циркулююча в кровi кiлькiсть В-лiмфоцитiв в одному дослщженш представлена двома рiзними субпопуляцiями й розподш цих субпопуляцiй вiдображае антиген-залежну та антиген-незалежну диференцiацiю В-клiтин у первинних i вторинних лiмфоiдних органах. Дослщження експозицii молекул СД 27 та IgD дозволяе вiдрiзнити первинш «незайманi» СД 27- та IgD+ В-лiмфоцити вiд СД 27+IgD+ активних В-лiмфоцитiв маргiнальноi зони селезшки та СД 27+ IgD- В^мфоциив з переключеним синтезом iмуноглобулiнiв iзотипiв IgG та IgA (табл. 2).
141
Таблиця 2
Субпопулящ!' В-л1мфоцит1в у кров1 телят iз К1Д
№ тварини СД 19+, % Лiмфоцит и, мм3 СД 27+ ВД+27-, % В-кл^ин ВД+27+, % В-кл^ин ВД27+, % В-кл^ин
72 11,2 1094 3,8 83,4 1,4 2,8
136 12,3 1310 5,4 79,6 2,3 2,2
76 10,7 1784 5,7 87,2 3,1 5,1
112 14,3 2310 6,7 84,4 2,6 1,2
64 13,8 1968 1,2 81,7 1,1 1,1
69 14,5 2943 2,7 89,6 2,7 0,6
70 17,8 1762 3,4 74,4 2,3 0,7
73 8,4 2752 3,9 90,5 2,6 2,1
80 10,7 3105 2,5 89,6 7,1 1,4
117 11,5 1925 5,7 73,1 2,9 0,9
78 9,4 2112 11,4 76,7 3,3 1,5
81 9,5 1877 10,5 68,8 2,6 1,7
Як видно iз таблиц 2, у хворих телят з К1Д були зниженi рiвнi вЫх субпопуляцiй В-лiмфоцитiв циркулюючо! кровi.
Ан^з експреси молекули СД 27 на СД 19+ В^мфоцитах кровi телят показав, що кiлькiсть В-клiтин, фенотипу СД 19+ СД 27+ знижена у хворих тварин порiвняно з контрольною групою (Р<0,05). Кiлькiсть В-кл^ин пам'ятi СД 27+ була меншою у восьми iз дванадцяти тварин в середньому на 13,6±0,9% (Р<0,05). Подiбне зниження В-клiтин пам'ятi у д^ей з наявнiстю загального варiабельного iмунодефiциту вказують також роботи шших авторiв [10, 21].
Результати дослщжень показали, що майже у вах телят К1Д (9 iз 12 -78,8%) спостер^алось зниження рiвня СД 27+IgД- В-лiмфоцитiв з переключеним синтезом iмуноглобулiнiв (8,6±0,3%) вiд загально! кiлькостi В-лiмфоцитiв, загальне число 8±0,1 мм3 порiвняно з телятами групи контролю -9,2±0,1 мм3 (Р<0,05) - табл. 3.
1з таблицi 3 видно, що достовiрне зниження В- клiтин телят дослщно! групи супроводжуеться значним (майже у два рази) зменшенням рiвня вЫх субпопуляцiй В-лiмфоцитiв пам'ятi. 1снують даш, що кiлькiсть СД 27+ ^Д + В-клiтин з переключеним синтезом iмуноглобулiнiв вiдображае функцiю центрiв розмноження лiмфоlдних органiв, порушення яко! спостерiгаеться майже у всiх хворих на К1Д [16, 20, 21].
Аналiз Т-лiмфоцитiв показав нормальну кшьюсть СД 3+ Т-клiтин' хоча вщносне !х число було достовiрно вище у телят iз К1Д порiвняно з тваринами контрольно! групи (77,5±1,9 та 68,2±2,1 вiдповiдно). Кiлькiсть СД 4+ Т-гелперiв (750±2,3 мм3, 35,6±2,2%), але число СД 8+ Т-кл^ин було достовiрно вищим у телят iз К1Д (780±63 мм3, 24,1±1,2) (Р<0,01). Пiдвищення активностi СД 8+ Т-
142
супресорiв у телят iз К1Д також тдтверджують пращ шших авторiв в дослiдах на дрiбних лабораторних тваринах [22].
Таблиця 3
Показники Дослiдна група (К1Д) Контрольна група (здоровi)
Вж телят, дш 2-30 2-30
Лiмфоцити, мм3 2600±320 2170±230
СД 19+, % лiмфоцитiв 11,20±1,2 15,75±1,1*
СД 27+, % В-кттин 7,8±0,4 13,6±1,1**
СД 27- IgД+ мнезайманiм лiмфоцити, % В-кл^ин 73,4±3,6 72,6±3,1
СД 27+ IgД + В-лшфоцити, % В-клiтин 3,6±0,2 6,7±0,3*
СД 27+ ^Д- В-лiмфоцити пам'ятi, % В-кл^ин 4,3±0,2 7,9±0,4**
На даний час завершуеться дослщження "ЕиКОс1а88" з удосконаленням класифшацп К1Д з урахуванням патогенетичних i клiнiчних аспектiв iмунодефiциту. На думку багатьох вчених цей вид iмунодефщиту слiд представити як загальний варiабельний iмунодефiцит (ЗВ1Д).
Основним класифiкацiйним параметром залишаються В-клiтини пам'ятi з переключеним синтезом iмуноглобулiнiв, оскiльки вони вщображають порушення функцп центрiв розмноження, що характерно для бiльшостi тварин i людей з гiпоiмуноглобулiнемiями.
Таким чином, можна прийти до висновку, що у бшьшосп хворих з наявшстю К1Д виявлено суттеве зниження рiвня всiх субпопуляцiй В-лiмфоцитiв пам'ят1 Виявлено кореляцiю клiнiчних проявiв дефщипв зi зниженням числа В-клiтин пам'ят1
Дослiдження В-клiтин пам'ятi може свщчити про ступень порушення гуморально! ланки iмунноl системи у хворих на К1Д. Кiлькiсть Т-лiмфоцитiв пам'ятi мае прогнозуюче значення для перебiгу iмунодефiциту i вказуе на необхiднiсть посиленого мошторингу у тварин з низькими показниками iмунологiчноl пам'ятi.
Л1тература
1. Кравщв Р.Й. Iмунологiчна пам'ять - основа специфiчного iмунiтету / Р.Й. Кравщв, Р.П. Маслянко // Наук. вкник ЛАВМ - 2005 - Т.7 (26) - С.80-86.
2. Кравщв Ю.Р. Т- i В^мфоцити рiзних субпопуляцiй у кровi корiв i !х телят / Ю.Р. Кравщв // 3б. наук. статей до 100^ччя ЛАВМ - 1997 - С. 337-339.
143
3. Кравщв Р.Й. Т- i В^мфоцити i ïx регуляторш функцп / Р.Й. Кравщв, Р.П. Маслянко // Наук. вкник ЛНАВМ - 2007 - Т.9(44) - С. 67-72.
4. МаслянкоР.П. Взаeмодiя клiтин з процесi iMyHoreHe3y / Р.П. Маслянко, Ю.Р. Кравщв // Бюлопя тварин - 2001 - Т. З (1) - С. 18-23.
5. Маслянко Р.П. Специфiчний набутий iмyнiтет у телят рiзного вшу: дозрiвання iмyнокомпетентниx лiмфоцитiв / Р.П. Маслянко, Т. С. Матвишин // Наук. вiсник ЛНУВМ - 2004 - Т.6 (3) - С.64-68.
6. Маслянко Р.П. Формування iмyнноï вiдповiдi органiзмi телят / Р.П. Маслянко, Т.С. Матвишин // Вет. бютехнолопя. - 2005 - №7. - С. 121-128.
7. . Agamatsu K., Futatatni T., Hakibara S. et al. Absence of memory B-cells memory compartment in common variable immunodeficiency // Clin. Immunol. - 2002 - v. 103. - P.34-42.
8. Alaehkar H., Taubenhaeim N., Haeney M. et al. Memory switched B-cells percentage and not serum immunoglobulin concentration is associated with clinical complications in children and adults with specific antibody deficiency and common variable immunodeficiency // Clin. Immunol - 2006. - v. 120 - P. 310-318.
9. Carsetti R. The loss of IgM memory B-cells correlates with clinical disease in common variable immunodeficiency / R. Carsetti, M. Rosado // J. Allergy Clin. Immunol. - 2005 - v. l 15 (2) - P. 412-417.
10. Casola S. Control of peripheral B-cell development / S. Casola // Curr Opin. Immunol. - 2007. - v. 19. - P. 143-150.
12Conley M.E. Molecular basis of immunodeficiency / M.E. Conley // Immunol. Rev. 2005. - v. 203. - P. 5-9.
12.Conley M.E. Getic analysis of patients with defects in early B-cell development / M.E. Conley, A. Broider // Immunol. Rev. - 2005 - v.203. - P.216-234.
13. Detkova D. Association between memory B-cells and lung diseases / D. Detkova // Chest. - 2007 - v. 19. - P. 137-143.
14. Ferry B.L. Measurement of peripheral B-cells subpopulations in common variable immunodeficiency using a whole blood method / B.L. Ferry., J. Jones, B.A. Bateman, et al // Clin. Exp. Immunol. - 2005 - v. 140. - P.532-539.
15. Fuxa M. Transcriptional regulation in early B-cell development / M. Fuxa, J.A. Skok // Curr. Opin. Immunol. - 2007 - v. 19. - P. 137-143.
16. Ko J. Immune competence and switched memory B-cells in common variable immunodeficiency / J. Ko., L. Radigan // Clin. Immunol. - 2005 - v. 116. -P. 37-41.
17. Kapper D. Regulation of B- and T-lymphoid cell development / D. Kapper // Curr. Opin. Immunol. - 2007 - v. 19. - P.113-116.
18. Nagumo H. The different process of class switching and somatic hypermutatlon: a novel analysis by CD27(-) naïve B-cells / H. Nagumo, K. Agematsu, W. Kabayashi, et al. // Blood. - 2002 - v.99. - P.567-575.
19. Notatrangelo L., Casanova PL., Conley M.E. et ah Primary immunodeficiency diseases: an update from the international Union of immunological Societies Primary immunodeficiency diseases Classification
144
Committee Meeting in Budapest. - 2005 / L. Notatrangelo , P.L. Casanova, M.E. Conley et al. // J. Allergy Clin. Immunol. - 2006. - v. 117. - P. 883-896.
20. Piqueras B. Common variable immunodeficiency patient classification based on impaired B-cells memory differentiation correlates with clinical aspen / B. Piqueras // J. Clin. Immunol. - 2003 - v. 23. - P. 385-400.
21. Tanque S.G. Human IgMCD27+ B-cells: memory B-cells or "memory B-cells / S.G. Tanque, K.L. Good // J. Immunol. - 2006 - v. 177. - P. 3728-373.
22. Vascotto F. Antigen presentation by B-cells: how receptor signaling direct membrane trafficking / F. Vascotto, D.L. Roux // Curr. Opin. Immunol - 2007 - v. 19. -P.93-99.
23. Vodjgani M. Analysis of class-switched memory B-cells in patients witn common variable immunodeficiency and its clinical implications / M. Vodjgani // J. Invest. Allerg. Clin. Immunol. - 2007 - v. 17. - P. 321-328.
24. Weller S. Human blood IgM "memory" cells are circulating splenic marginal zone B-cells harboring a prediverified immunoglobulin repertoire / S. Weller, N.C. Braun, B.K. Tan et al. // Blood. - 2004 - v. 104. - P. 3647-3654.
25. Wehr C. The EURO class trial: subgroups in common variable immunodeficiency / C. Wehr, T. Kivioja, C. Schmitt et al. // Blood. - 2008 - v. 111. -P. 77-85.
26. Williams M.A., Bevan M.J. Effector and memory CTL differentiation / M.A. Williams, M.J. Bevan // Annu Rev. Immunol. - 2007 - v. 25. - P. 171-193.
Summary
Masllanko R.P., Oleksjuk I.I., Bozhyk L.Ja.
Lviv national university of veterinary medicine and biotechnology named
of S.Z. Gzickyj
THE ROLE OF B-LYMPHOCYTES WITH IMMUNODEFICIENCY
The article analysis data of investigation of B-lymphocytes subpopulations in patients with common variable immunodeficiency (CV1D). The number of memory B-cells was markedly decreased of CVIB patients, the patients have decreased switched memory B-cells (CD27+IgD), as well as B-cells of marginal zone of spleen. Patients with decreased percentages of memory B-cells have lower levels of IgG/IgA and higher frequency of autoimmune and other.
Cmammx nadiumna do pedaxuii 21.09.2010
145
