CC BY
252
ИММУНОЛОГИЯ
© коллектив авторов, 2015 УДК 616.36-002.2-022-078.33
Семенов А.В.1, 3, Арсентьева Н.А.1, Любимова Н.Е.1, Тюленев С.В.1, Басина В.В.2, Эсауленко Е.В.2, Тотолян А.А.1, 3
РОЛЬ ЦИТОКИНОВ И ХЕМОКИНОВ В ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ХРОНИЧЕСКОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С
1ФБУН «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера», Роспотребнадзор, 197101, г. Санкт-Петербург, Россия; 2ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава РФ, 194100, г. Санкт-Петербург, Россия; 3Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава РФ, 197022, г. Санкт-Петербург, Россия
Хронический вирусный гепатит С (ХВГС) является широко распространенным заболеванием с длительной персистен-цией вируса и стертой клинической картиной. Существующие методы диагностики степени фиброза печени и прогноза течения заболевания имеют ряд недостатков, поэтому актуальной задачей является поиск надежных, малоинвазивных методов на основе биомаркеров крови. В качестве биомаркеров могут выступать цитокины/хемокины - медиаторы хронического воспаления, непосредственно участвующие в иммунопатогенезе ХВГС. Цель исследования - комплексный анализ содержания цитокинов/хемокинов в периферической крови больных ХВГС на разных стадиях заболевания, инфицированных различными генотипами вируса гепатита С. В плазме крови больных ХВГС (n = 73) и условно здоровых доноров (n = 37) определяли концентрацию цитокинов/хемокинов: IFNa, IFNy, ШШ/К28а, TNFa, ССL2/MCP-l, CCL3/ MIP-la, CCL4/MIP-1P, CCL5/RANTES, CCL8/MCP-2, CCL20/MIP-3a, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCLll/ITAC с помощью мультиплексного анализа по технологии xMAP. В плазме крови пациентов с ХВГС выявлено повышение уровня TNFa, Са2/МСР-1, CCL4/MIP-1P, СС18/МСР-2, CCL20/MIP-3a, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10 и CXCL11/ITAC по сравнению с контрольной группой. Уровни изученных интерферонов IFNa, IFNy, IFNШL28а не различались в изучаемых группах. По мере прогрессирования ХВГС и фиброзирования печеночной ткани значительно возрастали концентрации TNFa, ССL2/ MCP-1, CCL20/MIP-3a, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10 и CXCL11/ITAC. Концентрации хемокина СХа11/ПЯС может быть использована в качестве информативного показателя для дифференциальной диагностики ранних стадий фиброза печени. В зависимости от генотипа вируса гепатита С у больных ХВГС обнаружено изменение содержания CCL8/MCP-2. Таким образом, определение в плазме крови больных ХВГС концентрации некоторых цитокинов/хемокинов методом мультиплексного анализа позволяет получать дополнительную информацию о степени фиброза печени, активности процесса повреждения ткани печени при ХВГС, косвенно указывает на генотип вируса гепатита С.
К л ю ч е в ы е с л о в а: хронический вирусный гепатит С; фиброз печени; цитокины; хемокины.
Для цитирования: Клиническая лабораторная диагностика. 2015; 60 (8): 45-51. SemenovA.V.13, ArsentievaN.A.1, LubimovaN.E.1, TulienevS.V.1, Basina V.V.2, EsaulenkoE.V.2, TotolyanA.A.13
the role of cytokines and otemokines in laboratory diagnostic of chronic viral hepatitis c
1The Pasteur research institute of epidemiology and microbiology of Rospotrebnadzor of Russia, 197101 St. Petersburg, Russia; 2The St. Petersburg state pediatric medical university of Minzdrav of Russia, 194100 St. Petersburg, Russia; 3The academician I.P. Pavlov First St. Petersburg state medical university of Minzdrav of Russia, 197022 St. Petersburg, Russia
The chronic viral hepatitis C is widely prevalent disease with prolonged persistence ofvirus and obliterated clinical picture. The present techniques of diagnostic of degree of fibrosis of liver and prognosis of course of disease have particular .shortcomings. Hence, .search of safe low invasive methods based on blood biomarkers is an actual task. The cytokines/сhemokines (mediators of chronic inflammation) directly involved into immunopathogenesis of chronic viral hepatitis C can act in the capacity of biomarkers. The study was carried out to comprehensively analyze content of cytokines/сhemokine.s in peripheral blood of patients with chronic viral hepatitis C at various stages of disease and infected by different genotypes of virus of hepatitis C. The concentration of cytokines/сhemokines was identified in blood plasma ofpatients with chronic viral hepatitis C (n=73) and conditionally healthy donors (n=37): IFNa, IFNy, IFNML28a, TNFa, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1a, CCL4/MIP-1P, CCL5/RANTES, CCL8/MCP-2, CCL20/MIP-3a, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCL11/ITAC. The multiplex analysis using technology xMAP was applied. The increasing of level of TNFa, CCL2/MCP-1, CCL4/ MP-1P, CCL8/MCP-2, CCL20/MIP-3a, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCL11/ITAC was established in blood plasma of patients with chronic viral hepatitis C as compared with control group. The levels of analyzed interferons IFNa, IFNy, IFNML28a had no difference in studied groups. As far as chronic viral hepatitis C progresses and fibrosis of hepatic tissue develops the concentrations of TNFa, CCL2/MCP-1, CCL20/MIP-3a, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCL11/ITAC increased significantly. The concentrations ofhmokine CXCL11/ITAC can be used as informative indicatorfor differentiating diagnostic ofearly stages of liverfibrosis. Depending on genotype of virus of hepatitis C, in patients with chronic viral hepatitis C change in content of CCL8/MCP-2 was established. Hence, detection in blood plasma of patients with chronic viral hepatitis C concentration of particular cytokines/сhemokines using multiplex analysis technique permit analyzing additional information concerning degree of liverfibrosis, activity ofprocess of damage of hepatic tissue under chronic viral hepatitis C that indicates indirectly on genotype of virus of hepatitis C.
Keywords: chronic viral hepatitis C; liver fibrosis; cytokines; ohemokines.
Citation: KlinicheskayaLaboratornayaDiagnostika. 2015; 60 (8): 45-51. (in Russ.)
Для корреспонденции: Арсентьева Наталья Александровна, [email protected]
For correspondence: ArsentievaN.A., [email protected]
Введение. По данным ВОЗ на сегодняшний день в мире вирусом гепатита С (ВГС) инфицировано 130-150 млн человек [1]. ВГС вызывает как острую, так и хроническую инфекцию. Острый вирусный гепатит С в абсолютном большинстве случаев протекает без патогномоничных симптомов либо с неспецифической симптоматикой. Примерно 15-25% инфицированных лиц самопроизвольно избавляются от вируса в течение 6 мес после заражения без всякого лечения. У остальных 75-85% развивается хронический вирусный гепатит С (ХВГС), для которого характерны длительная пер-систенция возбудителя, риск развития цирроза, рака печени и тяжелых внепеченочных проявлений хронического гепатита
[2]. У большей части больных ХВГС формирования цирроза и рака печени не происходит на протяжении всей жизни, однако у 15-20% пациентов существует риск развития цирроза и рака печени в течение 20-30 лет от момента инфицирования
[3]. Именно эти пациенты относятся к группе максимального риска по неблагоприятному прогнозу развития заболевания. С другой стороны, современные успехи противовирусной терапии ХВГС, в том числе появление препаратов нового поколения (ингибиторов протеазы ВГС и т. п.), позволяют эффективно лечить пациентов и предотвращать неблагоприятные последствия ХВГС даже на поздних стадиях фиброза/цирроза печени. Максимально раннее выявление лиц из группы риска по фиброзу/циррозу печени малоинвазивными лабораторными методами - актуальная задача диагностики и терапии ХВГС.
Наиболее достоверным методом определения степени фиброза/цирроза печени остается гистологическое исследование материала, получаемого при проведении пункционной биопсии печени. Гистологическое исследование позволяет уточнить причину заболевания печени, а также оценить стадию фиброза и индекс гистологической активности, принять решение о тактике ведения больного, оценить естественное течение или эффективность проведенного лечения. Общепринятыми являются полуколичественные способы оценки выраженности индекса фиброза по шкале МЕТАVIR [4]. Согласно этой шкале выделяют 5 стадий фиброза (Г0, 1, 2, 3, 4), где Р0 соответствует отсутствию фиброза, а Р4 - циррозу печени. К сожалению, биопсия печени, оставаясь золотым стандартом определения стадии фиброза, все-таки является инвазивным методом с определенным процентом осложнений вплоть до летальных исходов. Результаты гистологического исследования по объективным причинам не всегда отражают реальную картину, поскольку объем биоптата очень мал (обычно это 1/50 000 часть ткани органа), который при наличии неравномерно-диффузного поражения печени, может иметь разные стадии фиброза и индекс гистологической активности. Сравнение результатов парных биопсий, полученных из правой и левой доли печени пациентов, инфицированных ВГС, показало, что расхождения на 1 балл индекса гистологической активности отмечались в 25% случаев; у 14,5% пациентов, у которых по биоптату из одной доли печени был поставлен цирроз печени, по биоптату из другой доли - выраженный фиброз. Динамическое наблюдение за фиброзом печени с помощью биопсии затруднено ввиду ин-вазивности метода.
Лабораторная диагностика вирусного гепатита основана на специфических (выявление антител к возбудителю или его антигенов, нуклеиновых кислот) и неспецифических (общеклинических и аппаратно-инструментальных) методах исследования. Основным скрининговым специфическим методом диагностики ХВГС является определение антител/ антигенов ВГС методом твердофазного иммуноферментно-го анализа, обладающего достаточно высокой чувствительностью, специфичностью и простотой исполнения. Скри-нинговое лабораторное исследование позволяет установить диагноз гепатита С, но, к сожалению, не позволяет оценить степень повреждения ткани печени.
Современный этап лабораторной диагностики вирусного гепатита С характеризуется широким применением
молекулярно-биологических методов выявления РНК ВГС. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет определить РНК ВГС как в качественном, так и в количественном варианте, что особенно важно для назначения, мониторинга и оценки эффективности применяемой терапии. При обнаружении РНК ВГС определяют принадлежность ВГС к определенному генотипу и субтипу [5]. Генотипирование ВГС имеет большое значение в определении стратегии интерфероно-терапии ХВГС. У больных, инфицированных генотипом 1Ь ВГС, течение инфекции более тяжелое, и они хуже отвечают на лечение по стандартной схеме противовирусной терапии препаратами пегилированного интерферона и рабавирина. Полагают, что одним из механизмов персистенции ВГС является подавление иммунного ответа вирусными белками. До сих пор не существует однозначного ответа на вопрос о механизмах влияния различных генотипов вируса гепатита С на тяжесть течения ХВГС, равно как и понимание взаимосвязи между количеством внепеченочного пула вирусных частиц (определяемого методом количественной ПЦР или "вирусная нагрузка") и степенью поражения печеночной паренхимы и активностью инфекционного процесса [6].
Определение уровня АЛТ и АСТ как непрямых маркеров поражения паренхимы печени и гепатоцеллюлярного некроза является неспецифическим тестом при лабораторной диагностике ХВГС. Тем не менее эти маркеры более информативны при оценке степени фиброза печени, чем вирусная нагрузка или определение генотипа ВГС. Интересно, что уровень АСТ отражает степень фиброзирования печеночной ткани более точно, чем уровень АЛТ, а соотношение АСТ/АЛТ > 1 является достоверным показателем выраженной стадии фиброза печени, в том числе цирроза печени [7].
Применяемые для оценки стадии заболевания печени аппаратно-инструментальные методы исследования (УЗИ, МРТ) позволяют оценить форму, размеры, структуру органа, наличие или отсутствие объемных образований, провести исследования для косвенной оценки плотности и эластичности ткани печени. Одним из наиболее перспективных методов оценки степени фиброза печени является ультразвуковая эластометрия (эластография) печени. Метод позволяет оценить наличие фиброза печени, генерируя вибрационные импульсы, и по результатам компьютерного анализа судить об изменении эластических свойств печени и темпов про-грессирования фиброза/цирроза. Однако даже эластография печени, позволяющая с высокой точностью дифференцировать выраженные и тяжелые степени фиброза/цирроза печени (Г3-Р4), не обладает достаточной чувствительностью при определении и дифференцировании ранних стадий фиброза (Р0-Р2) при ХВГС умеренной и низкой активности, а также не всегда адекватно отражает активизацию процесса.
Перечисленные выше ограничения разных методических подходов (несмотря на их очевидные достоинства) в диагностике повреждения ткани печени, вызываемой ХВГС, обусловливают необходимость дальнейшего поиска надежных, малоинвазивных методов диагностики фиброза печени как при первичном обследовании, так и при последующем наблюдении с использованием биомаркеров сыворотки крови.
Гетерогенность клинических проявлений ХВГС и темпов прогрессирования фиброза печени усложняет определение индивидуального прогноза заболевания и выбор тактики лечения больных. Уже более двух десятилетий ведутся поиски предикторов исхода терапии ХВГС, так как более половины пациентов, инфицированных ВГС 1-го генотипа, не достигают устойчивого вирусологического ответа на терапию пегилиро-ванным интерфероном и рибавирином. Причины, по которым терапия неэффективна, не очень хорошо изучены. Полиморфизм гена цитокина И-28В, возможно, объясняет не менее половины случаев отсутствия ответа на противовирусную терапию. Стоит учитывать влияние других факторов как вируса, так и самого организма носителя инфекции. Установлено, что повышение уровня хемокина СХСЫ0/1Р-10 (белок 10, индуцируемый интерфероном гамма) в сыворотке крови пациентов
является показателем негативного исхода стандартной противовирусной терапии (пегилированный интерферон и рибави-рин) при ХВГС, вызванном ВГС 1-го генотипа [8].
Цитокины - белковые или полипептидные факторы, продуцируемые преимущественно активированными клетками кроветворной и иммунной системы и опосредующие межклеточные взаимодействия при кроветворении, воспалении, иммунных процессах и межсистемных коммуникациях, это самая многочисленная и универсальная в функциональном отношении группа гуморальных факторов системы иммунитета. Цитокины играют ключевую роль как в нормальных, так и в патологических процессах в организме [9]. Среди ци-токинов в особое семейство выделяют хемокины - небольшие белки с мол. массой 8-12 кДа, основная функция которых состоит в контроле клеточной миграции. Кроме того, хемокины участвуют в тканевом гомеостазе, развитии ткани, в частности в продукции коллагена, ангиогенезе, процессах пролиферации и репарации [10]. Основными источниками хемокинов в печени являются активированные моноциты, клетки Купфера, эндотелиальные клетки и гепатоциты, которые синтезируют хемокины С, СС, СХС, СХ3С в ответ на инфекцию [11]. Хемокины участвуют в процессах воспаления, продукции коллагена и активации фиброза при развитии ХВГС [12], поэтому их можно рассматривать как дополнительные биомаркеры активности фиброгенеза.
Применение мультиплексного анализа для количественной оценки содержания цитокинов/хемокинов в плазме крови больных ХВГС позволяет в короткие сроки комплексно проанализировать большой спектр биомаркеров, что может дать информацию об иммунопатогенезе заболевания, его течении и прогнозе. Целью настоящего исследования стал комплексный анализ содержания цитокинов/хемокинов в периферической крови больных ХВГС на разных стадиях заболевания, инфицированных различными генотипами ВГС.
Материалы и методы. Пациенты. В исследование включено 73 пациента (51% мужчин, 49% женщин), проходивших стационарное лечение на кафедре инфекционных болезней взрослых и эпидемиологии ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургского государственного педиатрического медицинского университета» Минздрава РФ с диагнозом хронический вирусный гепатит С. Постановку диагноза, клинический осмотр больных, УЗИ органов брюшной полости, клинический анализ крови и мочи, биохимическое исследование крови, пункционную биопсию и эластоме-трию печени осуществляли врачи указанного медицинского учреждения. Диагноз ХВГС был подтвержден обнаружением в периферической крови пациентов суммарных антител к ВГС и выявлением РНК вируса в крови с последующим генотипированием ВГС. Всем пациентам была проведена пункционная биопсия печени или эластометрия печени. Распределение больных по стадиям заболевания проводилось на основании оценки выраженности фиброза в соответствии со стандартизированной системой «METAVIR». В связи со сложностью четкого разграничения стадий фиброза печени и небольшой выборкой мы решили разделить пациентов на 3 группы: Р0-1 -отсутствие/слабовыраженный фиброз, Р2 -умеренный (с порто-портальными септами) и Р3-4 - тяжелый (с порто-центральными септами)/цирроз. На основании молекулярно-генетического исследования больные с ХВГС были разделены на 2 группы в зависимости от генотипа ВГС: с 1-м генотипом (1Ь и 1а) и с не 1-м генотипом (3 а и 2).
Контрольную группу составляли условно здоровые лица (п = 37), у которых отсутствовали какие-либо клинико-лабораторные и морфологические признаки поражения печени, а также соматические заболевания.
Материалом исследования служила периферическая кровь. Образцы крови забирали в вакуумные пробирки с антикоагулянтом К2 ЭДТА, центрифугировали при 1500 об/ мин в течение 10 мин для отделения плазмы. Плазму отбирали в пробирки типа Эппендорф, замораживали и хранили при -80°С. На проведение данного исследования было получено
согласие Этического комитета ФБУН "Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера".
Проведение анализа. Концентрации цитокинов/хемоки-нов: IFNa, IFNy, 1РЖ/1Ь28а, TNFa, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1a, CCL4/MIP-1ß, CCL5/RANTES, CCL8/MCP-2, CCL20/ MIP-3a, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCLll/ITAC - определяли с помощью мультиплексного анализа по технологии xMAP (Luminex, США), с использованием коммерческих тест-систем Milliplex MAG Human Cytokine/Hemokine Panel I-III (Millipore, США), основанных на магнитных микросферах Milliplex Mag, согласно инструкциям производителя. Регистрацию и анализ данных проводили на приборе Luminex MAGPIX (Luminex, США).
Статистическая обработка. Статистическую обработку осуществляли с применением программы GraphPad Prizm 6 и Statistica 8. Для оценки выборок использовали методы непараметрической статистики, в том числе критерий Манна-Уитни, коэффициент корреляции Спирмена, однофакторный дисперсионный анализ ANOVA. Достоверными считали различия между группами при р < 0,05. Результаты представлены в виде медианы (Ме) и межквартильного размаха (Q25-Q75). Для сравнения двух различных диагностических тестов и выбора значения оптимальной точки разделения проводили анализ кривых операционной характеристики (ROC-curve) и вычисляли площадь под кривой операционной характеристики (ППК).
Результаты и обсуждение. В плазме крови больных ХВГС значительно повышены концентрации TNFa и ряда хемокинов: С^МСР-Р CCL4/MIP-1ß, CCL5/RANTES, ССL8/MCP-2, CCL20/MIP-3a, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCL11/ITAC по сравнению с группой условно здоровых доноров (рис. 1).
В плазме крови пациентов с ХВГС содержание TNFa было значительно выше, чем в контрольной группе (р < 0,0001). TNFa как полифункциональный медиатор воспаления с выраженной плейотропностью играет ключевую роль в развитии местных и системных патологических процессов, а также регулирует интенсивность воспаления, иммунного ответа, активирует клетки иммунной системы, опосредует гепато-токсический эффект, принимает участие в апоптозе поврежденных (в том числе вирусом) клеток. Кроме того, выявлена положительная корреляционная связь между содержанием в плазме крови TNFa и хемокинов: ССL2/MCP-1 (r = 0,35;
CXCL11/ITAC CXCL10/IP-10 CXCL9/MIG CCL20/MIP-3a CCL8/MCP-2 CCL5/RANTES CCL4/MIP-1ß CCL3/MIP-1a CCL2/MCP-1 TNFa IFNWIL28a IFNy IFNa
'//////////////////////////////////////////z
'//////////////////////////////\ *
'///////////////////////////////////////7777.1 ***
100 ХВГС
200
300
Контроль
Рис. 1. Относительное изменение содержания цитокинов/ хемокинов в плазме крови больных ХВГС по сравнению с контролем.
За 100% принимали концентрацию аналитов в контрольной группе; * -р < 0,05; ** -р < 0,01; *** -р < 0,001.
Зависимость между степенью фиброза печени и уровнем цито-кинов и хемокинов плазмы крови
Цитокин Коэффициент корреляции со степенью фиброза, r Достоверность корреляции, р
IFNa 0,075 0,4532
IFNy 0,12 0,2368
IFNX/IL28a 0,05 0,6273
TNFa 0,47 < 0,0001
CCL2/MCP-1 0,40 < 0,0001
CCL3/MIP-1a 0,07 0,4731
CCL4/MIP-1P 0,18 0,0774
CCL5/RANTES 0,01 0,9734
CCL8/MCP-2 0,10 0,3315
CCL20/MIP-3a 0,38 0,0002
CXCL9/MIG 0,38 0,0001
CXCL10 /IP-10 0,70 < 0,0001
CXCL11/ITAC 0,52 < 0,0001
р = 0,002), CCL4/MIP-1P (r = 0,31; р = 0,007), CXCL9/MIG (r = 0,28; р = 0,017), CXCL10/IP-10 (r = 0,35; р = 0,003), CXCL11/ ITAC (r = 0,33; р = 0,005). Известно, что TNFa является мощным активатором продукции различных молекул, в частности хемокинов: MCPs, MIPs и СХС [13], что подтверждают результаты и нашего исследования.
Анализ полученных данных свидетельствует о существенном повышении в плазме крови пациентов с ХВГС уровня хемокинов CXCL9/MIG (р = 0,001), CXCL10/IP-10 и CXCL11/ITAC (р<0,0001). Данные хемокины являются IFNy-зависимыми лигандами рецептора CXCR3. Их функция -привлечение в очаг воспаления мононуклеарных клеток, в основном активированных лимфоцитов, преимущественно ТЫ-клеток, несущих на своей поверхности хемокиновый рецептор CXCR3, и ингибирование ангиогенеза [14]. В то же время содержание интерферонов (IFNa, IFNy, ШПХЛЪ28а) в крови больных ХВГС не отличалось от такового в контрольной группе.
Концентрация CCL2/MCP-1 оказалась выше в плазме крови больных ХВГС по сравнению с таковой в группе условно здоровых доноров (р = 0,0008). CCL2/MCP-1 обладает хемотаксической активностью в отношении моноцитов/ макрофагов, базофилов, но не нейтрофилов и эозинофилов. CCL2/MCP-1 вовлечен в патогенез заболеваний, связанных с инфильтрацией очага воспаления макрофагами, таких как псориаз и ревматоидный артрит. Кроме того, уровень некоторых СС-хемокинов (CCL4/MIP-1j3, CCL8/MCP-2 и CCL20/ MIP-3a) был значительно повышен у пациентов с ХВГС по сравнению с контролем (р < 0,05).
При анализе связи между уровнем вирусной нагрузки и содержанием цитокинов/хемокинов в плазме крови больных ХВГС корреляции не выявлены. Положительная корреляция была обнаружена между степенью фиброза печени и уровнем вирусной нагрузки (r = 0,75; p < 0,0001) у лиц, инфицированных ВГС. Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что при прогрессировании ХВГС наблюдается тенденция к нарастанию вирусной нагрузки.
АЛТ и АСТ являются широко используемыми маркерами поражения паренхимы печени и гепатоцеллюлярного некроза. В нашем исследовании в плазме крови больных ХВГС содержание АЛТ и
АСТ в 2,7 и 1,7 раза (p < 0,0001) превышало эти же показатели у здоровых доноров. Корреляционный анализ связей между уровнями АЛТ и АСТ и содержанием цитокинов/хемокинов в плазме крови больных ХВГС выявил прямую положительную связь только между концентрацией АСТ и уровнем хемокина CXCL9/MIG (r = 0,48; p = 0,002). АСТ синтезируется внутри-клеточно, и в норме лишь небольшая часть этого фермента попадает в кровь. При повреждении печени в результате цитолиза (разрушения клеток) этот фермент попадает в кровь, при возрастании уровня АСТ наблюдается тенденция к увеличению концентрации хемокина CXCL9/MIG.
При анализе взаимосвязей содержания цитокинов/хемо-кинов в плазме крови и тяжести фиброза печени установлено, что по мере фиброзирования печеночной ткани значительно возрастают концентрации TNFa, С^МСР-! CCL20/MIP-3a, CXCL9/MIG (r = 0,47, р < 0,0001; r = 0,40, р < 0,0001; r = 0,20, р = 0,0002; r = 0,38, р = 0,0001 соответственно; см. таблицу). Стоит отметить, что концентрации TNFa и IFNy в группе больных с выраженным фиброзом/циррозом печени (F3-F4) значительно увеличивались (р<0,05) по сравнению с группой с умеренным фиброзом (F2). Медианные значения TNFa и IFNy в группе F3-F4 составили 15,23 (10,25-18,49) и 15,61 (6,02-28,77) пг/мл, в группе F2 - соответственно 9,00 (7,10-13,35) и 5,41 (2,36-8,36) пг/мл.
Обнаружена прямая зависимость между уровнями CXCL10/IP-10 и CXCL11/ITAC (r = 0,68, р < 0,0001; r = 0,52; р < 0,0001 соответственно) в плазме крови и степенью фиброза печени (рис. 2). Функции CXCL10/IP-10 и CXCL11/ITAC сводятся к привлечению и удержанию в очаге воспаления клеток, экспрессирующих хемокиновый рецептор cxcR3 -в основном активированных Т-лимфоцитов, Т- и В-клеток памяти, обладающих эффекторными функциями.
Определение степени фиброза печени на ранних стадиях заболевания достаточно проблематично, поэтому наибольший интерес представляют показатели, с помощью которых можно дифференцировать ранние стадии фиброза (F0-F1 от F2). Данные проведенного ROC-анализа (рис. 3) свидетельствуют о том, что среди исследованных нами цитокинов/хемокинов наиболее информативен СХСЬПЛТАС для разделения больных ХВГС со стадиями фиброза F0-F1 и F2 (чувствительность 64,3; специфичность 63,8; ППК = 0,71; критерий > 166,5 пг/мл; р = 0,02). Медианные значения концентрации СХСИ1/ ITAC в группе F0-F1 составили 137,30 (79,63-215,70) пг/мл, в группе F2 - 223,90 (130,90-443,60) пг/мл. Диагностическая значимость вирусной нагрузки была несколько ниже и составила: чувствительность 69,2; специфичность 62,8; ППК = 0,69; критерий >1 500 000 копий/мл; р = 0,04; медианные значения в группе F0-F1: 800 000 (42 000-3 400 000) копий/мл, F2: 3 600 000 (624 000-534 0000) копий/мл.
У больных ХВГС обнаружено изменение концентрации CCL8/MCP-2 в зависимости от генотипа ВГС (рис.4). Так, в плазме крови больных, инфицированных ВГС 1-го генотипа, значительно возрастало содержание ccL8/Mcp-2 по сравнению с контрольной группой и группой больных, инфицированных другими генотипами ВГС (2 и 3а) (р = 0,0003 и
2500-1
CXCL10/IP-10
CXCL11/ITAC
¡2
20001500-
1000-
500-
1000-,
re о.
800600-
400-
200-
Рис. 2. Зависимость между содержанием СХСЫ0/1Р-10 и СХСЫ1/1ТАС в плазме крови и степенью фиброза печени у больных ХВГС.
CXCL11/ITAC
Вирусная нагрузка
ЮОп
л
ь
0 х л
1
s m
S
m T
ЮОп
о о
X
л
s
80-
60-
о m >. Т
100
40-
20-
1-Специфичность, %
20 40 60 80 1-Специфичность, %
100
Рис. 3. ГОС-кривые, характеризующие зависимость чувствительности и специфичности СХСЫ1/1ТАС и вирусной нагрузки при сравнении групп больных ХВГС Р0-Р1 и Р2.
р = 0,01 соответственно). Таким образом, содержание CCL8/ МСР-2 возрастало только в группе пациентов, инфицированных 1-м генотипом ВГС.
Комплексный анализ содержания цитокинов/хемокинов в плазме крови показал возрастание уровня провоспалительных цитокинов и хемокинов у больных ХВГС по сравнению с таковым у здоровых доноров. Повышение концентрации TNFa, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1a, CCL4/MIP-1P, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCL11/ITAC отражает развитие общей воспалительной реакции и наблюдается при различных патологиях.
При корреляционном анализе выявлена прямая зависимость между концентрацией TNFa и степенью фиброза печени; таким образом, при прогрессировании фиброза наблюдается возрастание уровня TNFa в плазме крови. Полученные в настоящем исследовании результаты согласуются с данными литературы [15]. TNFa является универсальным медиатором воспаления, его роль в фиброгенезе противоречива: с одной стороны, TNFa необходим для естественной пролиферации гепатоцитов, с другой - он оказывает выраженное цитотоксическое действие [16]. TNFa активирует собственную продукцию по принципу положительной обратной связи, а также секрецию многих молекул, в том числе цитокинов и хемокинов. Этим объясняется обнаруженная нами прямая корреляционная связь между содержанием в крови TNFa и хемокинов CCL2/MCP-1, CCL4/MIP-1P, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10 и CXCL11/ITAC. Известно, что внутрипеченочные Т-клетки у лиц, инфицированных ВГС, производят более чем в 50 раз больше TNFa, что может приводить к TNF-зависимому апоптозу как инфицированных, так и неинфи-цированных ВГС гепатоцитов [17]. На основании полученных результатов представляется возможным сделать вывод о том, что определение содержания TNFa в крови больных в динамике развития ХВГС может быть использовано как дополнительный лабораторный критерий прогрессирования заболевания.
Нами выявлена прямая корреляция между концентрациями CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10 и CXCL11/ITAC в плазме крови и степенью фиброза печени у больных ХВГС. Хемокины CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10 и CXCL11/ITAC привлекают в очаг воспаления СХСГЗ-позитивные эффекторные клетки иммунной системы (активированные цитотоксические Т-лимфоциты, Th1, В-лимфоциты и NK-клетки). Источниками этих хемокинов в печени являются гепатоциты, звездчатые клетки, эндотелиоциты и лейкоциты [18]. Экспрессию хемоки-нового рецептора CXCR3 тесно связывают с Th1 и цитотокси-ческими Т-лимфоцитами, которые продуцируют IFNy и TNFa и стимулируют выработку лигандов CXCL9/MIG, CXCL10/ IP-10, CXCL11/ITAC, таким образом, формируется положительная обратная связь между уровнем экспрессии рецептора и концентрацией его растворимых лигандов.
Ранее нами было показано существенное увеличение в кро-
ви больных ХВГС содержания Th-клеток и В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности рецептор CXCR3 [19]. Инфильтрация печени эффектор-ными клетками приводит к ее повреждению и активации звездчатых клеток, что является ключевым моментом в запуске процесса фиброзирования печеночной ткани. Установлено, что CXCR3 на поверхности звездчатых клеток появляется под действием CXCL10/IP-10, при этом звездчатые клетки сами являются источником продукции провоспалительных хе-мокинов. При ингибировании CXCLIO/ IP-10 уменьшается воспаление печени и повреждение печеночной ткани [14]. Кажется противоречивым, что ангиоста-тические хемокины, которыми являются CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10 и CXCLll/ ITAC, должны в норме тормозить развитие фибротических процессов, но по данным настоящего исследования они потенцируют процесс повреждения печеночной ткани. Ответ на вопрос, почему СХСГЗ-положительные Т-клетки, привлеченные в печень хемокином CXCL10/IP-10, приводят к прогрес-сированию ХВГС, предложили A. Casrouge и соавт. [20]. Они обнаружили, что CXCL10/IP-10 в сыворотке крови находится в форме антагониста, который способен взаимодействовать с рецептором CXCR3, но без последующей передачи внутриклеточного сигнала. Установлено, что антагонистическую форму CXCL10/IP-10 при ХВГС, возможно в комбинации с другими протеазами, опосредует дипептилпептидаза IV (DPP4, CD26). Таким образом, рецептор CXCR3 и его лиганды способствуют усилению воспаления, опосредуют повреждение гепатоцитов и развитие фиброза. Несмотря на то что механизм фиброгенеза, опосредуемый лигандами CXCR3, остается неясным, определение в плазме крови хемокинов CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10 и CXCL11/ITAC может стать дополнительным лабораторным тестом при развитии ХВГС.
Общепринятая оценка активности патологического процесса в печени осуществляется по уровню ферментов АЛТ и АСТ, индексу гистологической активности, по результатам морфологического изучения биопсийного материала печени. Наше исследование показало, что концентрация хемокина CXCL9 прямо коррелирует с содержанием АСТ в плазме крови больных ХВГС. Таким образом, определение CXCL9/MIG может быть использовано в качестве дополнительного лабораторного теста наряду со стандартными биохимическими исследованиями, такими как определение АЛТ, АСТ.
CCL8/MCP-2
300-,
200-
га о.
â
100-
р=0,0003
р=0,01
••• . im
Зз як
I
Контроль
1а, 1b
2, За
Рис. 4. Концентрация ССЬ8/МСР-2 в плазме крови больных, инфицированных разными генотипами ВГС (1а, 1Ь и 2, 3а), по сравнению с контролем.
Среди исследователей нет единого мнения о том, насколько репликация ВГС связана с активностью патологического процесса в печени. По данным ряда авторов, репликация вируса возрастает по мере прогрессирования болезни [21], и более высокий уровень виремии коррелирует с более серьезными повреждениями печени [22]. В противоположность этому другими исследователями показано отсутствие прямой связи между количеством РНК ВГС и степенью активности патологического процесса [23]. В настоящем исследовании обнаружена прямая корреляционная связь между количеством ВГС в плазме крови и степенью фиброза печени. Определение концентрации CXCL11/ITAC в плазме крови может служить дополнительным дифференциальным показателем для разделения стадий фиброза печени F0-F1 и F2. При проведении ROC-анализа соответствия концентрации CXCL11 и стадий фиброза нами получен показатель ППК = 0,71, что согласно экспертной шкале оценки значений соответствует хорошей предсказательной ценности [24].
Нами выявлена прямая зависимость между содержанием CCL2/MCP-1 в плазме крови и степенью фиброза печени, что согласуется с данными литературы [25]. При развитии ХВГС значительно увеличивается содержание мРНК ccL2/Mcp-1 в ткани печени, уровень экспрессии мРНК CCL2/MCP-1 имеет достоверную тенденцию к нарастанию в зависимости от степени фиброза, при этом местный уровень экспрессии мРНК CCL2/MCP-1 достоверно превышает таковой в периферической крови [26]. Помимо привлечения моноцитов/макрофагов в очаг воспаления, CCL2/MCP-1 является хемоаттрактантом для звездчатых клеток, которые играют ключевую роль в процессах фиброгенеза. Работы на модельных крысах с острым повреждением печени продемонстрировали, что ингибирова-ние CCL2/MCP-1 приводит к уменьшению скорости прогрес-сирования фиброза. A. Casrouge и соавт. предполагают, что молекула ССL2/MCP-1 может (так же, как и CXCL10) находиться в форме антагониста, свойства которого она приобретает в результате действия металлопротеазы MMp2 и отщепления аминокислот от N-терминального конца [20]. С другой стороны, ССL2/MCP-1 привлекает в очаг воспаления в основном макрофаги и неспецифические Т-лимфоциты, которые оказывают неселективное повреждающее действие на ткань печени. Еще одной функцией ССL2/MCP-1 является способность вызывать пролиферацию и активацию киллерных клеток, действуя на них как IL-2, в результате чего у этого хемокина есть еще одно название - CHAK (CC-Chemokine-Activated Killer или CC-хемокин, активирующий клетки-киллеры).
Концентрация CCL20/MIp-3a в плазме крови больных ХВГС значительно возрастает по мере развития фиброза печени, что и показало настоящее исследование. Участие CCL20/MIP-3a хемокина в развитии процессов иммуноре-гуляции ткани печени известно давно. Традиционное название CCL20/MIP-3a - LARC (Liver Activation Regulated Chemokine или хемокин, регулирующий активацию печени) подчеркивает роль хемокина, который синтезируется преимущественно в печени, являясь лигандом рецептора CCR6, представленного на активированных Т-лимфоцитах, Т- и В-клетках памяти [18]. Т-регуляторные клетки и ТЫ7 в высокой степени экспрессируют на своей поверхности рецептор CCR6, от баланса этих клеток может зависеть ограничение или усиление развития аутоиммунных процессов. Источниками CCL20/MIp-3a при воспалении печени являются перипортальные дендритные клетки и макрофаги. Благодаря наличию того или иного набора хемокиновых рецепторов на поверхности клеток определяется направление их миграции, что может оказывать существенное влияние на распределение клеточных популяций в различных частях печени и влиять на развитие воспалительного процесса. В отличие от CXCR3-позитивных клеток, которые в основном обнаруживают в паренхиме печени, CCR6-положительные клетки располагаются по ходу желчных протоков.
Одним из механизмов персистенции ВГС является его способность модулировать иммунный ответ. Различные ва-
рианты поверхностных белков ВГС могут оказывать влияние на клеточный тропизм и иммунный ответ, например, на выработку эндогенных интерферонов, однако исследований, посвященных влиянию генотипов ВГС на секрецию хемокинов, встречается немного. Нами обнаружено, что CCL8/ MCP-2 в плазме крови возрастает только в группе пациентов, инфицированных 1-м генотипом ВГС. Исследования, касающиеся роли CCL8/MCP-2 в иммунопатогенезе ХВГС, малочисленны. S. Hellier и соавт. показали, что замена аминокислоты Q46K в CCL8/MCP-2 связана с выраженностью фиброза печени [27]. СС18/МСР-2 является хемотаксическим фактором в основном для моноцитов/макрофагов, Thl- и NK-клеток [18], кроме того, он обладает противомикробной активностью. ССЬ8/МСР-2 расщепляется под действием ме-таллопротеазы MMP-12. Источниками ССЬ8/МСР-2 являются различные клетки, включая фибробласты, эндотелиальные клетки, моноциты и макрофаги. СС18/МСР-2 опосредует направленную миграцию клеток в определенные отделы печени, в основном в область желчных протоков и портальных трактов, что в конечном итоге приводит к их повреждению. Возможно, повышенная выработка хемокина ССЬ8/МСР-2 является еще одним из механизмов повреждения печени, вызванного ВГС 1-го генотипа.
Таким образом, определение в плазме крови больных ХВГС концентрации TNFa, СС12/МСР-1, CCL3/MP-1a, CCL4/MP-1ß, CCL8MCP-2, CXCL9/MG, CXCL10/IP-10, CXCLll/ITAC методом мультиплексного анализа позволяет получать дополнительную информацию о степени фиброза печени, активности процесса повреждения ткани печени при ХВГС, косвенно указывает на уровень вирусной нагрузки и генотип ВГС.
Поскольку метод мультиплексного анализа содержания хемокинов в плазме крови является простым в исполнении, малоинвазивным по способу получения клинического материала, быстрым по срокам исполнения и весьма информативным, его использование в качестве дополнительного лабораторного теста при оценке состояния и прогнозе течения заболевания ХВГС представляется очень перспективным.
ЛИТЕРАТУРА
1. ВОЗ. Информационный бюллетень № 164. Доступен на: http:// www.who.int/mediacentre/factsheets/fs164/ru/
2. Соринсон С.Н., Селиванов Н.А., Корочкина О.В. Гепатит С: механизмы многолетней персистенции вируса и фазы инфекционного процесса. Клиническая медицина. 1997; 75 (10): 27-30.
3. Alter H.J., Seff L.B. Recovery, persistence, and sequelae in hepatitis С virus. Seminars in liver disease. 2000; 20 (1): 17-35.
4. Poynard T., Bedossa P., Opolon P. Natural history of liver fibrosis progression in patients with chronic hepatitis С. The OBSVIRC, METAVIR, CLINIVIR and DOSVIRC groups. Lancet. 1997; 349 (9055): 825-32.
5. Михайлов М. И. Лабораторная диагностика гепатита С (Серологические маркеры и методы их выявления). Вирусные гепатиты: достижения и перспективы. 2001. Доступен на: http:// medi.ru/doc/08h1202.htm.
6. Sarobe P., Lasarte J.J., Zabaleta A., Arribillaga L., Arina A., Melero I., Borrás-Cuesta F., Prieto J. Hepatitis С virus structural proteins impair dendritic cell maturation and inhibit in vivo induction of cellular immune responses. Virology. 2003; 77 (20): 10 862-71.
7. Giboney P.T. Mildly Elevated liver transaminase levels in the asymptomatic patient. American Family Physician. 2005; 71 (6): 1105-10.
8. Apolinario A., Diago M., Lo Iacono O. Increased circulating and intrahepatic T-cell-specific chemokines in chronic hepatitis C: relationship with the type of virological response to peginterferon plus ribavirin combination therapy. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 2004; 19: 551-62.
9. Van Damme J., Mantovani A. From cytokines to chemokines. Cytokine & Growth Factor Reviews. 2005; 16: 549-51.
10. Esche C., Stellato C., Beck L.A. Chemokines: key players in innate and adaptive immunity. Investigative Dermatology. 2005; 125: 615-28.
11. Lechner F., Wong D.K., Dunbar P.R., Chapman R., Chung R.T., Dohrenwend P., Robbins G., Phillips R., Klenerman P., walker B.D. Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis C virus. Experimental Medicine. 2000; 191 (9): 1499-512.
12. Larrubia J.R., Benito-Martínez S., Calvino M., Sanz-de-Villalobos
sc
Е., Parra-Cid T. Role of chemokines and their receptors in viral persistence and liver damage during chronic hepatitis C virus infection. World Journal of Gastroenterology. 2008; 14: 7149-59.
13. Chomczynski P., Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols. 2006; 1: 581-5.
14. Mantovani A. The chemokine system: redundancy for robust outputs. Immunology Today. 1999; 20 (6): 469-73.
15. Simpson K.J., Henderson N.C., Bone-Larson C.L., Lukacs N.W., Hogaboam C.M., Kunkel S.L. Chemokines in the pathogenesis of liver disease: so many players with poorly defined role. Clinical Science. 2003; 104: 47-63.
16. Сысоев К.А., Чухловин А.Б., Шахманов Д.М., Жданов К.В., Тотолян А.А. Профиль цитокинов и хемокинов в плазме крови пациентов с хроническим гепатитом С. Инфекция и иммунитет. 2013; 3 (1): 49-58.
17. Fujiyoshi M., Ozaki M. Molecular mechanisms of liver regeneration and protection for treatment of liver dysfunction and diseases. Hepatobiliary Pancreatic Scienses. 2011; 18: 13-22.
18. Ahmad A., Alvarez F. Role of NK and NKT cells in the immunop-athogenesis of HCV-induced hepatitis. Leukocyte Biology. 2004; 76 (4): 743-59.
19. Oo Y.H., Shetty S., Adams D.H. The role of chemokines in the recruitment of lymphocytes to the liver. Immunology Liver Diseases. 2010; 28: 31-44.
20. Семенов А.В., Арсентьева Н.А., Елезов Д.С., Кудрявцев И.В., Эсауленко Е.В., Тотолян А.А. Особенности популяционного состава CXCRS-положительных лимфоцитов периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом С. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2013; 6: 69-76.
21. Casrouge A., Decalf J., Ahloulay M., Lababidi С., Mansour H., Vallet-Pichard A., Mallet V., Mottez Е., Mapes J., Fontanet A., Pol S., Albert M.L. Evidence for an antagonist form of the chemokine CXCL10 in patients chronically infected with HCV. Clinical Investigation. 2011; 121 (1): 308-17.
22. Cho S.W., Hwang S.G., Han D.C., Jin S.Y., Lee M.S., Shim C.S. In situ detection of hepatitis C virus RNA in liver tissue using a digox-igenin-labeled probe created during a polymerase chain reaction. Medical Virology. 1996; 48 (3): 227-33.
23. Dries V., Von Both I., Müller M., Gerken G., Schirmacher P., Odenthal M., Bartenschlager R., Drebber U., Meyer zum Büschenfeld K.H., Dienes H.P. Detection of hepatitis C virus in paraffin-embedded liver biopsies of patients negative for viral RNA in serum. Hepa-tology. 1999; 29 (1): 223-9.
24. Jang J.Y., Chung R.T. Chronic hepatitis C. Gut Liver. 2011; 5 (2): 117-32.
25. Fawcett T. ROC graphs: notes and practical considerations for researchers. Kluwer Academic Publishers. 2004; 12 (56): 1-38.
26. Marra F. Chemokines in liver inflammation and fibrosis. Frontiers of Bioscience. 2002; 7: 1899-914.
27. Жданов К.В., Гусев Д.А., Чирский В.С., Сысоев К.А., Якубовская Л.А., Шахманов Д.М., Тотолян А.А. Экспрессия хемокинов и их рецепторов в крови и ткани печени при хроническом гепатите С. Медицинская иммунология. 2007; 4: 379-88.
28. Hellier S., Frodsham A.J., Hennig B.J.W., Klenerman P., Knapp S., Ramaley P., Satsangi J., Wright M., Zhang L., Thomas H.C., Thursz M., Hill A.V. Association of genetic variants of the chemokine receptor CCR5 and its ligands, RANTES and MCP-2, with outcome of HCV infection. Hepatology. 2003; 38 (6): 1468-76.
Поступила 14.05.15
REFERENCES
1. WHO. Newsletter № 164. Available at: http://www.who.int/media-centre/factsheets/fs164/ru/
2. Sorinson S.N., Selivanov N.A., Korochkina O.V. Hepatitis C: mechanisms of long-term persistence of the virus and the infection phase. Klinicheskaya meditsina. 1997; 75 (10): 27-30. (in Russian)
3. Alter H.J., Seff L.B. Recovery, persistence, and sequelae in hepatitis C virus. Seminars in liver disease. 2000; 20 (1): 17-35.
4. Poynard T., Bedossa P., Opolon P. Natural history of liver fibrosis progression in patients with chronic hepatitis C. The OBSVIRC, METAVIR, CLINIVIR and DOSVIRC groups. Lancet. 1997; 349 (9055): 825-32.
5. Mikhaylov M. Laboratory diagnosis of hepatitis C (serum markers and methods for their detection). Viral hepatitis: achievements and prospects. 2001. Available at: http://medi.ru/doc/08h1202.htm. (in Russian)
6. Sarobe P., Lasarte J.J., Zabaleta A., Arribillaga L., Arina A., Melero I., Borras-Cuesta F., Prieto J. Hepatitis C virus structural pro-
teins impair dendritic cell maturation and inhibit in vivo induction of cellular immune responses. Virology. 2003; 77 (20): 10 862-71.
7. Giboney P.T. Mildly Elevated liver transaminase levels in the asymptomatic patient. American Family Physician. 2005; 71 (6): 1105-10.
8. Apolinario A., Diago M., Lo Iacono O. Increased circulating and intrahepatic T-cell-specific chemokines in chronic hepatitis C: relationship with the type of virological response to peginterferon plus ribavirin combination therapy. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 2004; 19: 551-62.
9. Van Damme J., Mantovani A. From cytokines to chemokines. Cytokine & Growth Factor Reviews. 2005; 16: 549-51.
10. Esche C., Stellato C., Beck L.A. Chemokines: key players in innate and adaptive immunity. Investigative Dermatology. 2005; 125: 615-28.
11. Lechner F., Wong D.K., Dunbar P.R., Chapman R., Chung R.T., Dohrenwend P., Robbins G., Phillips R., Klenerman P., Walker B.D. Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis C virus. Experimentalmeditsine. 2000; 191 (9): 1499-512.
12. Larrubia J.R., Benito-Martínez S., Calvino M., Sanz-de-Villalobos E., Parra-Cid T. Role of chemokines and their receptors in viral persistence and liver damage during chronic hepatitis C virus infection. World Journal of Gastroenterology. 2008; 14: 7149-59.
13. Chomczynski P., Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols. 2006; 1: 581-5.
14. Mantovani A. The chemokine system: redundancy for robust outputs. Immunology Today. 1999; 20 (6): 469-73.
15. Simpson K.J., Henderson N.C., Bone-Larson C.L., Lukacs N.W., Hogaboam C.M., Kunkel S.L. Chemokines in the pathogenesis of liver disease: so many players with poorly defined role. Clinical Science. 2003; 104: 47-63.
16. Sysoev K.A., Chukhlovin A.B., Shakhmanov D.M., Zhdanov K.V., Totolyan A.A. Profile of cytokines and chemokines in the blood plasma of patients with chronic hepatitis C. Infektsiya i immunitet. 2013; 3 (1): 49-58. (in Russian)
17. Fujiyoshi M., Ozaki M. Molecular mechanisms of liver regeneration and protection for treatment of liver dysfunction and diseases. Hepatobiliary Pancreatic Scienses. 2011; 18: 13-22.
18. Ahmad A., Alvarez F. Role of NK and NKT cells in the immunop-athogenesis of HCV-induced hepatitis. Leukocyte Biology. 2004; 76 (4): 743-59.
19. Oo Y.H., Shetty S., Adams D.H. The role of chemokines in the recruitment of lymphocytes to the liver. Immunology Liver Diseases. 2010; 28: 31-44.
20. Semenov A.V., Arsent'eva N.A., Elezov D.S., Kudryavtsev I.V., Es-aulenko E.V., Totolyan A.A. Chemokine receptor CXCR3 expression on peripheral blood B-cell subsets in patients with chronic hepatitis C. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunologii. 2013; 6: 69-76. (in Russian)
21. Casrouge A., Decalf J., Ahloulay M., Lababidi С., Mansour H., Vallet-Pichard A., Mallet V., Mottez E., Mapes J., Fontanet A., Pol S., Albert M.L. Evidence for an antagonist form of the chemokine CXCL10 in patients chronically infected with HCV. Clinical Investigation 2011; 121 (1): 308-17.
22. Cho S.W., Hwang S.G., Han D.C., Jin S.Y., Lee M.S., Shim C.S. In situ detection of hepatitis C virus RNA in liver tissue using a digox-igenin-labeled probe created during a polymerase chain reaction. Medical Virology. 1996; 48 (3): 227-33.
23. Dries V., Von Both I., Müller M., Gerken G., Schirmacher P., Odenthal M., Bartenschlager R., Drebber U., Meyer zum Büschenfeld K.H., Dienes H.P. Detection of hepatitis C virus in paraffin-embedded liver biopsies of patients negative for viral RNA in serum. Hepatology. 1999; 29 (1): 223-9.
24. Jang J.Y., Chung R.T. Chronic hepatitis C. Gut Liver. 2011; 5 (2): 117-32.
25. Fawcett T. ROC graphs: notes and practical considerations for researchers. Kluwer Academic Publishers. 2004; 12 (56): 1-38.
26. Marra F. Chemokines in liver inflammation and fibrosis. Frontiers of Bioscience. 2002; 7: 1899-914.
27. Zhdanov K.V., Gusev D.A., Chirskiy V.S., Sysoev K.A., Yakubovs-kaya L.A., Shakhmanov D.M., Totolyan A.A. The expression of chemokines and their receptors in blood and liver tissue in chronic hepatitis C. Meditsinskaya immunologiya. 2007; 4: 379-88. (in Russian)
28. Hellier S., Frodsham A.J., Hennig B.J.W., Klenerman P., Knapp S., Ramaley P., Satsangi J., Wright M., Zhang L., Thomas H.C., Thursz M., Hill A.V. Association of genetic variants of the chemokine receptor CCR5 and its ligands, RANTES and MCP-2, with outcome of HCV infection. Hepatology. 2003; 38 (6): 1468-76.
Received 14.05.15
