CC BY
7
средств вызывает большой интерес. Однако применение естественных МВ ограничивает сложная процедура выделения и небольшой выход. Был предложен способ получения МВ в повышенном количестве с использованием вещества цитохалазина В. При этом количественная оценка стабильности индуцированных МВ в растворе изучена недостаточно. Поэтому целью нашей работы стала оценка стабильности иМВ МСК при различных условиях хранения в течение 112 дней.
Микровезикулы получали обработкой МСК 10 мкг/ мл цитохалазина В, как описано ранее. Цитохалазин В является агентом дезорганизации клеточного цитоскелета и большого выхода МВ. Полученные МВ ресуспендирова-ли в физиологическом растворе и хранили в различных условиях: при 37°С, 4°С, -20°С, 25°С, лиофилизировали и хранили при -20°С. Количество МВ анализировали с помощью проточной цитометрии с усиленным детектором светорассеяния (BD FACS Aria III BD Bioscience, США).
Впервые нами было обнаружено, что хранение при 37°С в течение 7 дней позволяет сохранить лишь 30% целых МВ от первоначального числа. Хранение при 25°С в течение 28 дней позволило сохранить только 47% исходного количества, тогда как хранение при 4°С позволило продлить срок годности МВ до 112 дней с сохранением 59% МВ. Лиофилизация привела к получению 49% интактных МВ. В то время как при замораживании МВ, ресуспендированных в физиологическом растворе при -20°С, сохранялось 79,5% МВ.
Таким образом, хранение иМВ МСК в физиологическом растворе при -20°С является наиболее подходящим условием хранения МВ в течение не менее 112 дней. Работа выполнена в рамках Программы стратегического академического лидерства Казанского федерального университета (ПРИ0РИТЕТ-2030) и за счет гранта Российского научного фонда № 21-75-10035.
УРОКИНАЗНЫЙ РЕЦЕПТОР И ТКАНЕВОЙ АКТИВАТОР ПЛАЗМИНОГЕНА КАК ГЕНЫ РАННЕГО ОТВЕТА ПРИ ФОРМИРОВАНИИ КОГНИТИВНЫХ ФУНКЦИЙ
П.С. Климович1, 2, В.С. Бойченко1,
К.А. Рубина1, О.И. Ивашкина3, К.А. Торопова3,
К.В. Анохин3, 4, Е.В. Семина1
1 Факультет фундаментальной медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Институт экспериментальной кардиологии, НМИЦ Кардиологии им. Чазова Минздрава России, Москва, Россия
3 Институт перспективных исследований мозга, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
4 НИИ Нормальной Физиологии им. ПК. Анохина, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: когнитивная нагрузка, память, урокиназ-ная система, урокиназный рецептор, гены раннего ответа, система активаторов плазминогена.
Память представляет собой одну из основных функций головного мозга, необходимую для хранения и извлечения информации, и которая составляет основу всего постна-тального когнитивного развития человека. На клеточном уровне формирование памяти обусловлено возникновением de novo синаптических связей за счет активации генов раннего ответа и реконфигурации ГАМКинтернейронов в гиппокампе и ассоциативной области коры [1].
Одной из основных систем, участвующих в когнитивном развитии организма, является система активаторов плазминогена, состоящая из протеазы урокиназы uPA (ген PLAU), ее рецептора uPAR (ген PLAUR), ингибитора урокиназы PAI-1 (ген SERPINE1) и тканевого активатора плазминогена tPA (PLAT). В нервной ткани урокиназная система опосредует миграцию нейронов в эмбриогенезе и онтогенезе, рост и регенерацию аксонов нейронов, регуляцию генов, связанных с апоптозом. Полиморфизмы генов PLAU и PLAUR ассоциированы с рядом неврологических патологий, нейродегенеративных и психических расстройств (н-р, с болезнью Альцгеймера), что предполагает их участие в процессах, связанных с когнитивными функциями в головном мозге [2].
В исследовании анализировали экспрессию генов белков активаторов плазминогена в головном мозге мыши в условиях когнитивной нагрузки. Мышей помещали в серое открытое поле на 10 минут, после чего измеряли мРНК uPAR, tPA, uPA и PAI-1 в передней, задней коре и гип-покампе через определенные сроки после воздействия (1,3,6, 24 и 72 часа). Было обнаружено достоверное повышение экспресиии мРНК uPAR, tPA уже через час после когнитивной нагрузки во всех структурах головного мозга, что позволяет отнести их к генам раннего ответа. Более того наблюдался второй пик экспрессии через 24 часа (p<0,05). Ранняя индукция генов PLAUR и PLAT (1 час) свидетельствует об их вовлеченности в процессы, связанные с приобретением памяти (новизной), а вот более поздняя (24 часа) может объясняться формированием памяти — отставленным процессом, когда происходит перестройка нейрональной сети, консолидация памяти и перестройка.
Впервые в ответ на когнитивную нагрузку идентифицированы два новых гена раннего ответа: ген рецептора урокиназы и ген тканевого активатора плаз-миногена, что позволяет предположить их участие в формировании памяти и регуляции нейрональной пластичности. Исследование выполнено при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (грант No 075 15 2020 801).
Литература:
1. Schomaker J., Meeter M. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. — 2015. — № 55.- P. 268-279.
2. Riemenschneider M., Konta L., Hum Mol Genet. — 2006. — Vol.
15. — № 16. — P. 2446-2456.
РОЛЬ Т-КАДГЕРИНА В АДИПОГЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
П.С. Климович1, 2, С.Э. Мирзаева1, В.Ю. Сысоева1, Е.В. Семина1, К.А. Рубина1
1 Факультет фундаментальной медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Институт экспериментальной кардиологии, НМИЦ Кардиологии им. Чазова Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: адипоцитарная дифференцировка, ади-понектин, Т-кадгерин, мезенхимальные стромальные клетки, преадипоциты, дипептидилпептидаза-4, адипоциты.
Жировая ткань играет важнейшую эндокринную роль в организме помимо непосредственной функции запасания липидов. Важнейшим гормоном, продуцируемым зрелыми адипоцитами, является адипонектин, системно
регулирующий процессы метаболизма и обладающий противовоспалительным и антиатерогенным эффектами, а также способностью повышать чувствительность к инсулину. Рецептором высокомолекулярной формы адипонектина является Т-кадгерин, экспрессированный во многих органах и тканях, включая жировую ткань. Именно Т-кадгерин опосредует протективные эффекты адипонектина в сердце и сосудах, полимофризмы в гене Т-кадгерина ассоциированы с различными сердечно-сосудистыми заболеваниями. Механизм участия Т-кадгерина в продукции адипонектина жировой тканью, регуляции обновления и дифференцировки адипоцитов неизвестен [1].
В исследовании использовали человеческие МСК с различным уровнем экспрессии Т-кадгерина: контрольные МСК, МСК с гиперэкспрессией Т-кадгерина (МСК Т+) и клетки, трансдуцированные контрольным вирусом (МСК Квир). Клетки культивировали в среде для адипогенной дифференцировки или в стандартной среде в качестве контроля, после чего выделяли мРНК и анализировали экспрессию следующих генов-маркеров: мезенхималь-ных прогениторов (CD34, PDGFRa, THY1), перицитов (PDGFRß), интерстициальных предшественников (PI16, DPP4), преадипоцитов (CD36, ICAM, PPARG), маркеры белка амфирегулина (Areg) — CLEC11A, CD142 и маркеры вновь образованных адипоцитов (ADIPOQ and CAR3). Анализ полученных данных показал, что гиперэкспрессия Т-кадгерина приводит к повышению экспрессии DPP4 в 44 раза и адипонектина (ADIPOQ) в 2,6 раза в клетках, культивируемых в стандартной среде, что может указывать на их повышенный потенциал к спонтанной адипогенной дифференцировке. Одновременно в МСК Т+ клетках, культивируемых в стандартной среде, повышалась экспрессия маркеров зрелых адипоцитов: CD36 (в 13 раз) и ICAM (в 20 раз) по сравнению с контрольными клетками. Культивирование же клеток в среде для адипогенной дифференцировки приводило к снижению экспрессии DPP4 в клетках всех типов, однако этот эффект был выражен в 2 раза сильнее в клетках МСК Т+ по сравнению с клетками МСК Квир. Напротив, уровень экспрессии PDGFRß (маркера МСК и гладкомы-шечных клеток) был повышен в МСК Т+. В соответствии с нашими данными, мы предполагаем, что Т-кадгерин опосредует петлю отрицательной обратной связи и действует как регулятор в недифференцированных стволовых клетках и прогениторных адипоцитах, поддерживая недифференцированное состояние. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 20-015-00402.
Литература:
1. Rubina, K.A.; Semina, E.V.; Kalinina, N.I.; Sysoeva, V.Y.; Balatskiy,
A.V.; Tkachuk, V.A. European Journal of Cell Biology 2021, 100,
151183.
РАНЕВЫЕ ПОКРЫТИЯ: ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ
И.И. Кобякова, М.Н. Егорихина, Д.Я. Алейник, Ю.П. Рубцова, И.Н. Чарыкова, Д.Д. Линькова
ФГБОУ ВО Приволжский исследовательский медицинский университет Минздрава России, Нижний Новгород, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: раневые покрытия, ожоги, цитотоксич-ность, адгезия, клеточная терапия.
Раневые покрытия много лет используются для местного лечения ожоговых и других дефектов кожи, препятствуя инфицированию ран, сохраняя влажную среду, стимулируя ангиогенез, синтез коллагена, формирование грануляционной ткани и др. Новым направлением лечения ран стали клеточные технологии, требующие подбора покрытий при их применении.
Цель работы — исследование раневых покрытий для оценки возможности использования их в сочетании с клеточной терапией.
Исследовано 4 вида используемых в клинике коммерчески доступных покрытий: № 1 — полимерная пленка на основе гидрофильных сополимеров винилацетата, № 2 — двуслойное гидроколлоидное покрытие на основе биополимеров и полиуретановой пленки, № 3 — гидроколлоидная матрица на полиуретановой основе, № 4 — гидро-гелевая повязка на основе гибрида полиуритана. Методы исследования: МТТ-тест, метод прямого контакта, световая и флуоресцентная микроскопия, рН-метрия, вискозиметрия. В качестве тестовой культуры использовали охарактеризованную культуру дермальных фибробластов человека.
Результаты МТТ-теста показали, что суточные экстракты образцов были не токсичны, а экстракты, выделенные на 7 сутки, токсичны. Покрытие № 2 на 7 сутки инкубации изменяло рН ростовой среды в кислую сторону. Показано, что покрытия № 2 и № 3 значительно увеличивают вязкость ростовой среды. При прямом контакте покрытия № 2 и № 4 ингибировали пролиферацию клеток, при сохранении жизнеспособности, а контакт с покрытием № 3 через 3 суток приводил к гибели клеток. При посеве клеток на покрытия оказалось, что на поверхность покрытия № 1 клетки не прикрепляются, на поверхности покрытия № 4 наблюдали адгезию только единичных клеток, а на поверхности покрытий № 2 и № 3 клетки хорошо распластывались.
Заключение. Исследованные покрытия не могут использоваться в качестве матриц-носителей для трансфера клеток. Для кратковременного использования при клеточной терапии ран различного генеза возможно применение покрытия № 1.
БИОИСКУССТВЕННАЯ НАДКОСТНИЦА НА ОСНОВЕ КЛЕТОЧНЫХ СФЕРОИДОВ, ПОЛУЧЕННАЯ МЕТОДОМ БИОПЕЧАТИ
А.В. Ковалев1, М.М. Сморчков1, Е.В. Кудан2, В.А. Миронов1
1 ФГБУ НМИЦ ТО им. Н.Н. Приорова МЗ РФ, Москва, Россия
2 НИТУ МИСиС, Москва, Россия e-mail: [email protected]
Ключевые слова: надкостница, кость, клеточный сфероид, тканевая инженерия, биопечать.
Надкостница проявляет костеобразующий потенциал при регенерации и трансплантации, однако ограниченная доступность этой важной костной оболочки актуализирует разработку персонифицированной биоискусственной надкостницы (БИН) для удовлетворения потребности в эффективном лечении костных дефектов. Клеточные сфероиды могут служить важной составляющей БИН, учитывая высокую плотность клеток внутри сфероидов и преимущества максимизации межклеточных взаимодействий.
Цель — разработать конструкцию БИН с остеоген-ным потенциалом на основе клеточных сфероидов
