CC BY
42
РОЛЬ САЛЬМОНЕЛЛ В БИЛИАРНОМ ЛИТОГЕНЕЗЕ *
Диденко Л. В., Андреевская С. Г., Тиганова И. Г., Смирнова Т. А., Романова Ю. М.
ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН, Москва
Диденко Любовь Васильевна E-mail: lyubov-didenko@mail.ru
РЕЗЮМЕ
В экспериментальной модели «желчь — бактерии» методами световой микроскопии и иммуноцитохимии были изучены этапы взаимодействия сальмонелл с корпускулярными компонентами желчи. Установлено, что в результате этого взаимодействия происходит образование бактериально-желчных сладжей. Показано, что в механизме сладжирования желчи ведущая роль принадлежит жгутикам и синтезируемому бактериями экзоклеточному мукополисахаридному матриксу.
Ключевые слова: желчнокаменная болезнь, билиарный сладж, сальмонелла.
SUMMARY
By the methods of light microscopy and immunocytochemistry studies of interaction between S. typhimurium and corpuscular biliary components was investigated in experimental model «bile-bacteria» It was shown that the results of this interaction was bacterial-biliary sludge formation. Bacterial extracellular mucopolysaccharides matrix and flagella's play crucial role in mechanism of sludge formation.
Keywords: cholelithiasis, Biliary sludge, salmonella
Многочисленные исследования, посвященные выяснению причин формирования литогенной желчи, билиарных сладжей и желчных конкрементов, акцентированы на нарушениях, связанных с изменениями коллоидного равновесия в желчи, в свою очередь, обусловленных различными биохимическими изменениями.
В качестве основных причин, приводящих к образованию холестериновых сладжей и конкрементов, рассматривается совокупность факторов: перенасыщение желчи холестерином, уменьшение концентрации солюбилизирующих его соединений (желчных кислот и фосфатидилхолина), изменение соотношения про- и антинуклеаторов, избыточный синтез эпителиоцитами муцина, внутрипузырный стаз желчи при гипомоторном типе дискинезии желчного пузыря [1].
В современных классификациях желчных конкрементов, основанных на их химическом составе, различают холестериновые, пигментные и смешанные камни.
Холестериновые камни состоят из холестерина, скрепленного муцином. Холестерин, подобно высшим жирным кислотам, представляет собой нерас-
творимое в воде соединение, которое сохраняется в желчи в растворенном состоянии лишь благодаря присутствию в ней солей желчных кислот и фосфатидилхолина. При недостатке желчных кислот холестерин выпадает в осадок, и при этом могут образовываться камни. Секретируемая эпителиальными клетками желчного пузыря слизь содержит муцин, который ускоряет процесс кристаллизации холестерина. Муцин является основой образования своеобразного каркаса для микрокристаллов и обеспечения формирования ядра будущего конкремента. Этому способствует и дефицит факторов, препятствующих нуклеации кристаллов холестерина. В просвете желчного пузыря формируется так называемый «билиарный сладж», или сгусток желчи, состоящий из муцина и кристаллов холестерина с включениями билирубината кальция. Его появлению способствуют внутрипузырный стаз желчи (редкие приемы пищи) на фоне нарушения сократительной функции желчного пузыря или его дискинезии. В этих условиях постепенно происходит агрегация и уплотнение (при участии слизи) микрокристаллов холестерина и образование конкрементов. При застое желчи встречаются
Иллюстрации к статье — на цветной вклейке в журнал.
in
*
#
камни, содержащие 90-95% холестерина. Скорость роста конкрементов составляет в среднем около 1 - 2мм в год.
Пигментные конкременты подразделяются на черные и бурые.
Черные пигментные образуются вследствие гемолиза и состоят из пигментного полимера (билирубина), фосфатных и карбонатных солей кальция.
В состав бурых камней входят билирубинат кальция и кальциевые мыла (пальмитиновое и стеариновое). В камнях, содержащих желчные пигменты, имеется внутреннее ядро белковой природы. Чаще всего встречаются камни, у которых ядро окружено чередующимися слоями холестерина и били-рубината кальция. Такие камни содержат до 80% холестерина [2, 3].
В желчном пузыре у практически здоровых людей микроорганизмы не обнаруживаются, поскольку желчь обладает антибактериальными свойствами.
Наибольшую устойчивость к бактерицидному действию желчи демонстрируют бактерии семейства Enterobacteriacea [4-6].
При воспалительных процессах гепато-били-арной системы и панкреато-дуоденальной зоны из желчи высеваются бактерии, относящиеся к семейству Enterobacteriacea (кишечная палочка, сальмонеллы, клебсиеллы, энтеробактер), энтерококки, клостридии, пептококки, анаэробные бактерии — бактероиды и пропионбактерии [7, 8].
Недостаточно изучены свойства бактерий, которые позволяют им преодолевать неблагоприятное влияние желчи. В литературе имеются данные о формировании биопленок в желчи [8]. Известно, что по сравнению с вегетативными формами бактерий биопленки обладают большей устойчивостью к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды [9].
По данным L. Stewart и соавт., бактерии, продуцирующие слизь, в-глюкоронидазу и фосфолипазу, определяют формирование пигментных камней (билирубинат кальция), бактерии, продуцирующие только в-глюкоронидазу и фосфолипазу — смешанных, а бактерии, продуцирующие только слизь, — холестериновых. Увеличение в-глюкуронидазной активности желчи приводит к расщеплению конъюгатов билирубина, и образовавшийся в результате билирубин служит субстратом для образования камней. [10, 11].
В экспериментальных исследованиях было показано, что грамотрицательные бактерии активно колонизируют поверхность уже сформированных желчных конкрементов, взаимодействуя с пигментными компонентами камня [12].
Малоизученными остаются стартовые механизмы взаимодействия бактерий с компонентами желчи, которые могут привести к потенцированию литогенных свойств желчи и формированию желчных сладжей.
Цель настоящего исследования: в экспериментальной модели «желчь — бактерии» изучить процессы взаимодействия сальмонелл с компонентами желчи.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальная модель «желчь — бактерии»
15 г стерильной сухой бычьей желчи (Serva) растворяли в 100 мл стерильного питательного Л-бульона. Соотношение сухого вещества и жидкой фазы соответствовало соотношению таковых в нативной желчи.
В раствор желчи инокулировали 100 мкл клинического изолята Salmonella typhimurium штамм C 53 (S. typhimurium), концентрация бактерий составляла 1010 в мл, инкубацию образцов проводили в течение 24, 48, 96 и 144 часов при 37 оС при непрерывном встряхивании.
Контрольные препараты:
• стерильный 15%-ный раствор сухой бычьей желчи в Л-бульоне, инкубированный при 37° С, при непрерывном встряхивании в течение 24, 48, 72 и 144 часов;
• 24-часовая планктонная культура S. typhimurium штамм С 53 в питательном Л-бульоне;
• культура S. typhimurium штамм С 53 в питательном Л-бульоне, инкубированная при 37° С, в течение 24, 48, 72 и 144 часов в чашках Петри.
Световая микроскопия
Для исследования образцов в режиме проходящего света в световом микроскопе Axiotarplus c флуоресцентной приставкой (Karl Zies) были приготовлены мазки опытных и контрольных образцов на обезжиренных предметных стеклах. При съемке препаратов использовали объективы х40 и х100, затем фотографии увеличивали для детального изучения.
Препараты окрашивали алциановым синим по методу Стидмена (рН раствора 2,5), который позволял выявлять кислые и сульфатированные мукополисахариды.
При рН рабочего раствора алцианового синего 2,5 кислые мукополисахариды окрашиваются в светло-голубой цвет, сульфатированные — в бирюзовый [13].
Метод прямой иммунофлуоресценции с использованием коммерческих антител к Н-антигену сальмонелл, коньюгированных с флуорохромом изоти-оцианатом (FITZ), был применен для оценки роли жгутиков сальмонелл в процессах взаимодействия бактерий с компонентами желчи.
В препаратах, обработанных коньюгатами антител к Н-антигену сальмонелл, каждое поле
экспериментальная гастроэнтерология
experimental gastroenterology
зрения фотографировали и в режиме проходящего света, и в ультрафиолетовом свете.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При исследовании препаратов мазков бычьей желчи, окрашенных по методу Стидмена, в проходящем свете были визуализированы следующие структуры:
• аморфные массы, окрашивавшиеся алциановым синим в бирюзовый цвет;
• светло-желтые и светло-коричневые кристаллоподобные структуры, не окрашивавшиеся алциановым синим;
• мелкие каплевидные неокрашенные структуры, вокруг которых иногда выявлялся бирюзовый ободок (рис. 1).
Сопоставление полученных морфологических и гистохимических характеристик компонентов желчи позволило сделать следующее заключение: неокрашенные алциановым синим кристаллоподобные структуры являлись желчными пигментами, каплевидные — холестерином, окрашивавшиеся алциановым синим аморфные массы — слизью, бирюзовый цвет окраски которых указывал на присутствие в слизи сульфатированных мукополисаха-ридов. Кислые мукополисахариды в контрольных образцах желчи не выявлялись.
В контрольных препаратах желчи также были выявлены сладжи, состоявшие из каплевидных структур (холестерина), пигментных частиц и слизи (рис. 2). Наличие сладжей в контрольных препаратах сформированных агрегатов, состоявших из компонентов желчи, являлось недостатком экспериментальной модели. В дальнейшем, при интерпретации морфологических изменений, происходивших в системе «желчь — бактерии», нами учитывались исходные морфологические параметры контрольных образцов желчи.
В мазках планктонных культур 5. typhimurium, инкубированных без добавления в питательную среду желчи, вокруг клеток выявлялось светло-голубое окрашивание в виде ободка, что свидетельствовало о наличии в капсуле бактерий кислых мукополисахаридов (рис. 3).
Для оценки влияния сальмонелл на формирование желчных сладжей был проведен сравнительный морфологический анализ контрольных препаратов желчи и препаратов желчи, инкубированных с сальмонеллами в динамике на сроках инкубации 24, 48, 72 и 144 часа.
На указанных сроках инкубации в контрольных препаратах желчи без сальмонелл не произошло существенных изменений морфологической картины по сравнению со свежеприготовленным препаратом раствора сухой желчи в Л-бульоне.
В препаратах желчи, инкубированных с сальмонеллами, выявлено взаимодействие бактерий с корпускулярными компонентами желчи, которое выражалось в формировании агрегатов, в составе которых обнаруживались бактерии, слизь, холестерин и пигментные частицы (рис. 4 а, б). Образованные агрегаты можно рассматривать как билиарные сладжи, в состав которых были включены сальмонеллы.
В агрегатах бактерии формировали особую структуру, морфологические характеристики которой соответствовали описанной ранее структуре биопленки, образуемой сальмонеллами на абиотических поверхностях [14].
Количество планктонных (свободных) бактерий в препаратах «желчь — сальмонеллы» уменьшалось с увеличением сроков инкубации, и на сроке 144 часа практически все бактерии были объединены в биопленку.
В контрольных препаратах культуры сальмонелл, инкубированных только в питательном бульоне на чашках Петри, происходило образование биопленки, но окраска экзоклеточного матрикса с увеличением срока наблюдения существенно не менялась (рис. 4).
В модели «желчь — бактерии» относительно мелкие бактериально-желчные агрегаты образовывались на ранних сроках наблюдения (24 часа), их размеры прогрессивно увеличивались к более поздним срокам (48 и 72 часа), достигая максимальной величины к 144 часам инкубации, при этом окраска агрегатов менялась от светло-бирюзовой к сине-фиолетовой (рис. 5 а, б).
Для выяснения роли жгутиков сальмонелл в процессе их взаимодействия с компонентами желчи был использован иммуноцитохимический метод визуализации Н-антигена (жгутикового) сальмонелл.
В контрольных препаратах планктонной культуры сальмонелл, меченных коньюгатами антител к Н-антигену с FITZ, было выявлено специфическое свечение вокруг бактерий, что свидетельствовало о наличии у них значительного количества жгутиков (рис. 6).
В контрольных препаратах желчи было отмечено неспецифическое свечение, в основном связанное с каплевидными (холестериновыми) структурами (рис. 7). В литературе есть указания на неспецифическое связывание с флуорохромами жиросодержащих соединений, в том числе содержащихся в желчи липидов, холестерина и жирных кислот [15].
В препаратах «желчь — сальмонеллы», обработанных мечеными антителами к Н-антигену сальмонелл, было обнаружено специфическое свечение, связанное с бактериально-желчными агрегатами (сладжами) и планктонными бактериями. Размеры агрегатов и интенсивность их свечения последовательно увеличивались от ранних к поздним срокам
in
т
#
Г-v
наблюдения, при этом уменьшалось количество свободных каплевидных структур (холестерина) и планктонных бактерий. На сроке 144 часа инкубации выявлялись крупные негомогенные интенсивно светящиеся агрегаты с четкими контурами, соединенные между собой флуоресцирующими мелкоячеистыми структурами, а планктонные бактерии и каплевидные структуры (холестерин) не обнаруживались (рис. 8).
На основании полученных данных процесс формирования сладжей и желчных конкрементов в системе «желчь — бактерии» можно представить следующим образом.
Первый этап — посредством жгутиков бактерии направленно мигрируют и адгезируют на корпускулярных компонентах желчи.
Второй этап — бактерии колонизируют частицы желчи и начинают формировать на их поверхности биопленку. Реализация этого этапа обеспечивается жгутиками и синтезируемым бактериями экзопо-лисахаридным матриксом. Экзополисахаридный матрикс является природным биополимером, адгезивные свойства которого обеспечивают плотный контакт бактерий с колонизируемой поверхностью. Одновременно экзополисахаридный матрикс служит защитой бактерий от неблагоприятного воздействия желчи [9, 14].
Третий этап — обрастание биопленкой поверхности частиц желчи. На этом этапе происходит увеличение массы экзополисахаридного матрикса.
Четвертый этап — увеличение объема бактериально-желчных агрегатов (сладжей). Ведущая роль в этом процессе принадлежит мукополисахаридам (бактериальным экзополисахаридам и мукополисахаридам слизи, вырабатываемой эпителиоцитами желчного пузыря). Адгезивные свойства мукополиса-харидов определяют присоединение к уже сформированному бактериально-желчному агрегату (сладжу) новых корпускулярных компонентов желчи, планктонных бактерий и биопленок.
Пятый этап — образование желчных конкрементов. На этом этапе происходит дальнейшее увеличение объема бактериально-желчных агрегатов, усугубляющих дисбаланс коллоидного равновесия в желчи. Итогом этих процессов является необратимое формирование желчных камней.
Таким образом, сальмонеллы могут играть ключевую роль в развитии желчнокаменной болезни. Сальмонеллы относятся к семейству Е^вгоЬа^епасеав, представители которого являются наиболее часто обнаруживаемыми бактериями в желчном пузыре при холециститах и желчнокаменной болезни. Представляется логичным предположение, что взаимодействие с желчью бактерий, представителей одного семейства, будет принципиально одинаковым в реализации процессов камнеобра-зования.
❖
ЛИТЕРАТУРА
1. Дадвани, С. А. Желчнокаменная болезнь/С. А. Дадвани, П. С. Вет-шев, А. М. Шулутко и др. — М.: Изд. дом «Видар-М», 2000. — 144 с.
2. Ильченко, А. А. Желчнокаменная болезнь/А. А. Ильченко. — М.: Анахарсис, 2004. — 200 с.
3. Лейшнер, У. Практическое руководство по заболеванию желчных путей: Пер. с нем/У. Лейшнер. — М.: ГЭОТАР-Мед, 2001. — 264 с.
4. Scott, A. J. Origin of bacteria in bile duct/A. J. Scott, G. A. Khan//Lan-cet. — 1967. — Vol. 2. — P. 790,
5. Dye, M. The bacterial flora of the biliary tract and liver in man/M. Dye, A. Macdonald, G. Smith//Br. J. Surg. — 2005. — Vol. 65, Issue 4. — P. 285 - 287.
6. Sattar, I. Frequency of infection in cholelithiasis/I. Sattar, A. Aziz, S. Rasul et al.//J. Coll. Physicians Surg. Pak. — 2007. — Vol. 17, № 1. — P. 48-50.
7. Shivaprakasha, S. Aerobic bacterial isolates from choledochal bile at a tertiary hospital: Indian/S. Shivaprakasha, R. Harish, K. R. Dinesh et al.//J. Pathol. Microbiol. — 2006. — Vol. 49, № 3. — P. 464-467.
8. Stewart, L. Gallstones containing bacteria are biofilms: bacterial slime production and ability to form pigment solids determines infection severity and bacteremia/L. Stewart, J. M. Griffiss, G. A. Jarvis et al.//J. Gastrointest Surg. — 2007. — Vol. 11, № 8. — P. 977-983.
9. Costerton, J. W. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections/J. W. Costerton, P. S. Stewart, E. P. Greenberg//Science. —
1999. — Vol. 284. — P. 1318-1322.
10. Stewart, L. Pigment gallstone pathogenesis: Slime production by biliary bacteria is more important than beta-glucuronidase production/L. Stewart, R. Ponce, A. L. Oesterk et al.//J. Gastrointest. Surg. —
2000. — Vol. 4, № 5. — P. 547-553.
11. Stewart, L. Biliary bacterial factors determine the path of gallstone formation / L. Stewart, J. M. Grifiss, G. A. Jarvis et al.//Am. J. Surg. —
2006. — Vol. 192, № 5. — P. 598-603.
12. Leung, J. W. Bacteriologic analyses of bile and brown pigment stones in patients with acute cholangitis/Joseph W. Leung, Yan-Lei Liu et al.//Gastrointest. Endosc. — 2001. — Vol. 54, № 3. — P. 340-345.
13. Пирс, Э. Гистохимия; пер. с англ./Э. Пирс. — М., 1962. — С.964.
14. Смирнова, Т. А. Электронно-микроскопическое изучение биопленок, образуемых бактериями Burkholderia cepacia/Т. А. Смирнова, Л. В. Диденко, А. Л. Андреев и др.//Микробиология. — 2008. — Т. 77, № 1. — С. 63-70.
15. Люминесцирующие антитела (в изучении патогенных микроорганизмов); под ред. М. Н. Мейселя. — М.: Медицина, 1972. — 141 с.
экспериментальная гастроэнтерология
experimental gastroenterology
