CC BY
15
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Экспериментальные исследования
© И.А.Ракитяпская. Али Яхья Абдулла Аль-Шауш, I999 УДК 612.112.94.015.348:615.357
И.А.Ракитянская, Али Яхья Абдулла Aib-Шауш
РОЛЬ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЭРИТРОПОЭТИНА В СТИМУЛЯЦИИ СИНТЕЗА ДНК ЛИМФОЦИТОВ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO
I.A.Rakityanskaya, АН Yakhya Abdulla Al-Shawish
THE ROLE OF RECOMBINANT HUMAN ERYTHROPOIETIN IN STIMULATION OF LYMPHOCYTE DNA SYNTHESIS IN CULTURE IN VITRO
Научно-исследовательский институт нефрологии
Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова, Россия
РЕФЕРАТ
Проведено изучение пролиферативной активности лимфоцитов in vitro в реакции бласттранс-формации (РБТ) в присутствии разных доз рекомбинатного человеческого эритропоэтина (РЧЭПО). Показан выраженный депрессивный эффект препарата РЧЭПО на способность лимфоцитов к утилизации 3Н-тимидина в синтез ДНК. Выявлен также депрессивный эффект РЧЭПО на пролиферацию разных субпопуляций мононуклеаров в культуре in vitro, в том числе и на ранние предшественники лимфопоэза — TdT+-wieTKH.
Ключевые слова: лимфоцит, рекомбинантный человеческий эритропоэтин, реакция бласт-трансформации, иммунодепрессия.
ABSTRACT
Proliferative activity of lymphocytes in vitro in blasttransformation reaction was studied in the presence of different doses of recombinant human erythropoietin (RHEP). A pronounced inhibitory effect of RHEP upon the ability of lymphocytes to utilize 3H-thymidine in DNA synthesis was shown, as well as an inhibitory effect of RHEP on proliferation of different subpopulations of mononuclears in in vitro culture including the early precursors of lymphopoiesis — TdT+-cells.
Key words: lymphocyte, recombinant human erythropoietin, reaction of blasttransformation, immu-nodepression.
ВВЕДЕНИЕ
Эритропоэз — это сложный процесс образования клеток крови, протекающий преимущественно в костном мозге. Центральное место занимает в этом процессе эритропоэтин (ЭПО). Понимание и изучение прикладных и экспериментальных аспектов регуляции ЭПО невозможно без определения его влияния на клетки крови [5—7].
В последние годы стали широко использовать методы биотестирования ЭПО in vitro. Эти методы были разработаны совсем недавно, но, тем не менее, получили широкое распространение и признание.
Имеющиеся в настоящее время методы тестирования биоактивности ЭПО in vitro можно систематизировать следующим образом: I. Биологические методы: 1) метод суспензионных культур; 2) метод эритроидного колониеобразо-вания в культуре: 3) прочие методы. II. Иммунологические методы: 1) метод иммунодиффу-зии; 2) радиоиммунный метод; 3) тест ингиби-рования гемагглютинации.
Иммунологические методы в настоящее время очень широко используются для изучения биологической активности ЭПО in vitro. Метод иммунодиффузии, основанный на реакции преципитации между антигеном и антителом, имеет высокую чувствительность (1 мЕД/мл), но низкую специфичность, поэтому не нашел широкого применения.
Радиоиммунный метод впервые был предложен J.Tisher и соавт. в 1971 г. Для проведения такого исследования к тестируемой сыворотке добавляли определенное количество меченого 1311 или |251 ЭПО, что вызывало конкуренцию за участки связывания антител. Несвязанный антиген отделялся, и также определялась радиоактивность преципитата с предварительным построением калибровочной кривой [1]. Чувствительность этого способа очень высока (0,01 мЕД/мл) и он достаточно специфичен.
Однако методы, которые позволили бы изучить влияние ЭПО в культуре in vitro на клетки лимфопоэза — мононуклеары, в литературе не описаны.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
С целью изучения механизма действия РЧЭПО in vilro нами были проведены эксперименты с фракцией мононуклеаров периферической крови, очищенных от «прилипающей» компоненты, взятой у 10 здоровых доноров. Используя реакцию бласттрансформации лимфоцитов крови (по методу C.Schutt и соавт., 1978), в качестве модели пролиферативного процесса в лимфоидной ткани мы попытались изучить влияние ЭПО на интенсивность синтеза ДНК в стимулированной ФГА и в нестиму-лированной ФГА культуре лимфоцитов. Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТ) относится к числу неспецифических реакций лимфоидной ткани в ответ на различные стимуляторы, и первая фаза реакции всегда характеризуется превращением лимфоцита в незрелую, митотически активную клетку. При культивировании с митогеном фитогемагглютинином (ФГА) стимуляции всегда предшествует выраженный распад клеток, в том числе и лимфоцитов [4], следовательно, возможно протекание процесса реутилизации продуктов распада жизнеспособными клеточными элементами. Уро-
Таблица 1 Влияние РЧЭПО на утилизацию 3Н-тимидина лимфоцитами периферической крови здоровых доноров
Доноры лимфоцитов Контроль без РЧЭПО и ФГА Радиоактивность ДНК (имп./мин на фильтр)
В присутствии РЧЭПО 8 присутствии ФГА без РЧЭПО
10 мкл 20 мкл 40 мкл
1 112 119 121 114 4673
2 119 106 115 120 5146
3 113 129 127 125 1233
4 168 104 127 124 1159
5 260 162 115 141 5386
6 272 172 145 190 7795
7 324 103 152 181 10 696
8 334 107 131 190 11 186
9 147 178 120 125 2265
10 176 169 110 113 2108
вень стимуляции утилизации 3Н-тимидина под влиянием ФГА варьирует в широких пределах и зависит от индивидуальности доноров и может отражать либо различие в содержании в крови небольшой чувствительной к ФГА фракции лимфоцитов, либо разные концентрации выделяемых ими медиаторов [4J.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В результате проведенного исследования (табл. 1) в присутствии только рекомбинантно-го человеческого ЭПО (РЧЭПО) пролифера-тивный ответ лимфоцитов в культуре in vitro через 72 ч резко угнетается (см. табл 1, 2). При добавлении в культуру ФГА и РЧЭПО также резко падает интенсивность синтеза ДНК в лимфоцитах. Таким образом, ЭПО не только не способствует процессу пролиферации, но, наоборот, существенно подавляет его в присутствии митогена ФГА (см. табл. 2). Этот механизм действия препарата не зависит от вносимой в культуру дозы (10 мкл — 2 ЕД, 20 мкл — 4 ЕД, 40 мкл — 8 ЕД) на стандартное содержание мононуклеаров 2x10-1 в объеме культуральной среды, равном 200 мкл,содержащей среду RPMI-1640, эмбриональную телячью сыворотку («Sigma», США).
Одновременно было проведено изучение содержания отдельных субпопуляций лимфоцитов крови в культуре in vitro через 48 и 168 ч в присутствии разных доз РЧЭПО.
Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов в культуре проводилось с помощью набора моноклональных антител («Да-ко», «Sigma»). Выявлено, что содержание зрелых иммунокомпетентных клеток с маркером СД2 через 48 ч в присутствии РЧЭПО не изменяется при сравнении с контрольной пробой культуры мононуклеаров без РЧЭПО (табл. 3). Через 7 сут содержание лимфоцитов СД2 уменьшается, при этом наблюдается зависимость от
Таблица 2
Влияние РЧЭПО на утилизацию 3Н-тимидина лимфоцитами периферической крови здоровых доноров в присутствии и отсутствии фитогемагглютинина (ФГА)
Доноры лимфоцитов Радиоактивность ДНК (имп./мин на фильтр)
Контроль без РЧЭПО и ФГА В присутствии ФГА (15 мкл) В присутствии РЧЭПО (10 мкл) и ФГА (15 мкл) Влияние ЭПО на ФГА-стимуляцию В присутствии ЭПО (20 мкл) и ФГА (15 мкл) Влияние РЧЭПО на ФГА-стимуляцию
1 112 4673 195 23,96 120 38.94
2 119 5146 166 31,0 103 49.96
3 113 1233 193 6,39 274 4,50
4 168 1159 200 5,79 172 6,74
5 260 5386 240 22,44 141 38,20
6 272 7795 260 29,98 118 66,00
7 324 10 696 213 50,21 224 47,75
8 334 11 186 337 33,20 220 50,85
9 147 2265 103 21,90 119 19,03
10 176 2108 435 4,85 97 21,73
концентрации РЧЭПО - чем выше концентрация препарата, тем больше снижается уровень содержания в культуре С02-к леток (см. табл. 3). Содержание лимфоцитов хелперов СД4 в кул ьтуре в присутствии РЧЭПО через
Таблица 3
Изменение содержания мононуклеаров (X±m) в культуре in vitro через 48 ч (2 сут) и через 168 ч (7 сут) в присутствии различных концентраций РЧЭПО
Время исследования СД2-лимфоциты СД4-хелперы СД8-супрессоры В-лимфоциты ТдТ-клетки, %
Исходно 44,5±1,80 38,3±1,10 30,4± 1,14 18,0±1,10 3,66±0,40
Через 48 ч (2 сут): 2 ЕД (10 мкл) РЧЭПО 4 ЕД (20 мкл) РЧЭПО 8 ЕД (40 мкл) РЧЭПО Контроль без РЧЭПО 40,0±1,82 35,5±1,63 35,2±1,72 36,0±1,25 30,6±1,62 25,2±1,12 24,8±0,98 28,9±0,84 13,5+0,18 12,5±1,10 11,5±1,02 11,4±0,92 16,2±1,21 18,0±1,10 15,5±0,90 16,3±1,20 —
Через 168 ч (7 сут): 2 ЕД( 10 мкл) РЧЭПО 4 ЕД (20 мкл) РЧЭПО 8 ЕД (40 мкл) РЧЭПО Контроль без РЧЭПО 12,4+0,78« 10,3±0,80** 6,3±0,72" 18,6±0,90 6,84±0,62* 5,32±0,54" 4,20±0,60" 10,26+0,82 7,6+0,66** 6,3±0,54** 8,9±0,58** 13,9±0,98 6,3±0,64 7,2±0,58 6,4±0,59 6,2±0,5 0,34±0,02** 0,91±0,04** 0,33±0,012** 2,30±0,24
* р<0,01.
** р<0,001 в сравнении с группой контроля без РЧЭПО через 7 сут.
48 ч также не уменьшается при сравнении с контрольной пробой препарата, а через 7 сут культивирования выявляется достоверное снижение хелперов СД4 в зависимости от нарастания концентрации РЧЭПО в культуре по сравнению с контрольной пробой без препарата (см. табл 3). Абсолютно аналогичная картина отсутствия изменений наблюдается и с супрес-сорами СД8 через 48 ч под влиянием РЧЭПО и резкое уменьшение их содержания через 7 сут по сравнению с контрольной пробой (см. табл. 3). Не выявлены изменения содержания 13-лимфоцитов на разных сроках культивирования, независимо от концентрации РЧЭПО в культурачьной среде (см. табл. 3). Динамика изменений содержания в культуре мононуклеаров через 7 сут ранних недифференцированных ТдТ+-клеток представлена в табл. 3, из которой видно, что РЧЭПО также оказывает депрессивное действие и на уровень в культуре ТдТ+-лимфоидных предшественников (несущих маркерный фермент — терминальную де-зоксинуклеотидилтрансферазу).
ОБСУЖДЕНИЕ
Таким образом, при изучении нами влияния РЧЭПО на пролиферацию лимфоцитов in vitro было показано, что препарат не способствует интенсивности пролиферации, а наоборот, сильно подавляет ее, независимо от вносимой дозы препарата.
При длительном культивировании мононуклеаров in vitro в присутствии РЧЭПО выявлен иммунодепрессивный эффект препарата на лимфоциты с маркерами СД2, СД4, СД8, ТдТ+ -лимфоциты и В-лимфоциты. По-видимому, эффект РЧЭПО при приеме больными сводится к более быстрому созреванию лимфоидных клеток и переходу их в зрелые формы с последующим разрушением и гибелью, что мы и наблюдали
в культуре in vitro через 7 сут, когда ранние ТдТ+-клетки под влиянием РЧЭПО, пройдя путь дифференцировки в зрелые формы, гибнут.
При проведении исследований in vitro нами было показано, что депрессивный эффект на лимфоциты достигался при внесении в культуру разных доз, концентрация которых даже превышала фармакологические.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Итак, можно предположить, что при длительном приеме РЧЭПО у больных развивается глубокий иммуносупрессивный эффект. Следовательно, получающие РЧЭПО оказываются наиболее подготовленными к трансплантации почки. В литературе [2, 3] есть данные, свидетельствующие о снижении сенсибилизации больных, ожидающих трансплантацию в результате РЧЭПО.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Назаров С. Б. Методы биотестирования эритропоэти-на in vitro // Успехи соврем, биол.— 1986.—Т. 102, N2 (5).— С. 246-255.
2. Feldman L., Frazier J.G.,Sytkowski A.J. B-lymphocyte — derived burst-promoting activity is a pleiotropic erythroid colony-stimulating factor, E-CSF // Exp. Hematol.— 1992.—Vol. 20., №10.—P. 1223—1228.
3. Imiela J., Glapinski Т., Matecki R. et al. Immunomodulatory effects of rhEPO treatment // Abstr. XXIXth Congress of the EDTA, France. 1992.-P.192.
4. Ling N.R.(/lnHr H.P.) Стимуляция лимфоцитов,—M.: Наука, 1971,—288 с.
5. Maxwell А.P., Lappin T.R., Johnston C.F. et al. Erythropoietin production in kidney tubular cells // Brit. J. Haematol.— 1990,—Vol. 74, № 4,— P. 535—539.
6. Mayani H., Dragowska W., Lansdorp P. Cytokine-induced selective expansion and maturation of erythroid versus myeloid progenitors from purified cord blood precursor cells // Blood.— 1993.— Vol. 81, № 3.-P. 3252—3258.
7. Metcalf D. Haemopoietic growth factors // Med. J. Aust.— 1988,- Vol. 148 —P. 16—519.
Поступила и редакцию 17.01.99 r.
