Научная статья на тему 'Роль различных субпопуляций В-клеток в иммунном ответе на т-независимые антигены 2-го типа'

Роль различных субпопуляций В-клеток в иммунном ответе на т-независимые антигены 2-го типа Текст научной статьи по специальности «Биология»

CC BY
210
45
Поделиться
Журнал
Медицинская иммунология
Scopus
ВАК
Область наук
Ключевые слова
В-КЛЕТКИ / АНТИТЕЛА / ТН-2 АНТИГЕНЫ / ИММУНОГЛОБУЛИНЫ

Аннотация научной статьи по биологии, автор научной работы — Гаврилова М. В., Чернышова И. Н., Сидорова Е. В.

Исследована роль субпопуляций В-клеток в поликлональной активации В-лимфоцитов, индуцированной Т-независимыми антигенами 2-го типа (ТН-2 антигены). Из суспензий спленоцитов мышей, иммунизированных поливинилпирролидоном или б(1ЃЁ3) декстраном, выделяли CD5-BB-1-клетки. Числа антитело(АТ) и Ig-продуцентов определяли методом ELISPOT. Количество продуцентов неспецифических Ig рассчитывали по разности между количествами Igи АТ-продуцентов; число неспецифических Ig-продуцентов, индуцированных ТН-2 антигенами, вычисляли по разности между числами неспецифических Ig-продуцентов в опыте и контроле. В опытах с CD5и CD5субпопуляциями спленоцитов появление продуцентов АТ и увеличение числа клеток, синтезирующих неспецифические Ig, зависело от CD5B-клеток. Эти данные подтверждены определением количеств АТ и Ig-продуцентов в субпопуляциях, содержащих В-2и В-1-лимфоциты (получены с помощью набора Dynal). Несмотря на значительное преобладание числа В-клеток в В-2 фракции (91% против ~13в В-1 фракции) количества продуцентов АТ и индуцированных ТН-2 антигенами неспецифических Ig в обеих фракциях были примерно одинаковы. При расчете на 106 В-клеток фракция В-1 содержала в 67 раз больше клеток, синтезирующих АТ, и поликлонально активированных Ig-продуцентов, чем фракция В-2. Таким образом, как специфический, так и поликлональный иммунный ответ на поливинилпирролидон и декстран зависит, главным образом, от В-1-клеток. Одновременное введение двух ТН-2 антигенов не приводило к суммации числа клеток, продуцирующих индуцированные неспецифические Ig, несмотря на то, что введение каждого из этих антигенов порознь вызывало отчетливое увеличение количества этих клеток в В-1 фракции. Заключается, что поликлональная активация В-1-клеток ТН-2 антигенами рестриктирована. Рестрикция зависит либо от размера способного к активации пула В-1-клеток, либо от количества неспецифических стимулирующих факторов.

Похожие темы научных работ по биологии , автор научной работы — Гаврилова М.В., Чернышова И.Н., Сидорова Е.В.,

Role of different B cell subpopulations in immune response to t-independent type 2 antigens

The role of different B-cell subpopulations in polyclonal B-cell activation induced by T-independent antigens type 2 (TI-2) was under studies. CD5-B/B-1 cells were isolated from the spleens of mice immunized with polyvinyl pirrolidone, or б(1ЃЁ3) dextran. The numbers of antibody (Ab) and Ig-producers in CD5-B/B-1 splenocytes were determined by ELISPOT. The number of cells producing unspecific Ig was calculated as a difference between the numbers of Igand Ab-producers; the numbers of nonspecific Ig-producing splenocytes induced by TI-2 immunization were determined as differences between their contents in immunized and control animals. In experiments with CD5and CD5splenocytic populations, the development of Ab-producers and increased numbers of cells producing unspecific Ig was dependent on the CD5B-cells. These data were confirmed in experiments with subpopulations of B-1 and B-2 lymphocytes obtained with Dynal separation kit. In spite of sufficient predominance of B-cells in B2 fraction (91% vs ~13% in B-1 fraction), the numbers of Ab and TI-2-induced nonspecific Ig-producers were аnearly similar for the both cell fractions. Taking into account relative contents of B-cells, the numbers of Aband unspecific Igproducers in B-1 fraction were 6to 7-fold higher than in B-2 fraction. Thus, dependence on the B-1 cells exists both for polyclonal immune reactions to polyvinylpirrolidone and dextran, and specific response. Simultaneous injection of two TI-2 antigens did not induce additive effects upon the numbers of unspecific Ig-producers in B-1 fraction, in spite of marked increase in amounts of these cells after separate immunization with either of these antigens. It is concluded that polyclonal activation of B-1 cells by TI-2 antigens is subject to restriction which may depend either on the size of B-cell pool available for activation, or on insufficiency of appropriate stimulating factors.

Не можете найти то что вам нужно? Попробуйте наш сервис подбора литературы.

Текст научной работы на тему «Роль различных субпопуляций В-клеток в иммунном ответе на т-независимые антигены 2-го типа»

Медицинская Иммунология 2007, Т. 9, № 1, стр. 39-46 © 2007, СПб РО РААКИ

Оригинальные статьи

Роль различных сувпопуляций В-клЕток в иммунном ответе на т-независимые антигены 2-го типа

Гаврилова М.В., Чернышова И.Н., Сидорова Е.В.

ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, Москва

Резюме. Исследована роль субпопуляций В-клеток в поликлональной активации В-лимфоцитов, индуцированной Т-независимыми антигенами 2-го типа (ТН-2 антигены). Из суспензий спленоци-тов мышей, иммунизированных поливинилпирролидоном или а(1^3) декстраном, выделяли CD5+B/ В-1-клетки. Числа антитело- (АТ) и ^-продуцентов определяли методом ELISPOT Количество продуцентов неспецифических ^ рассчитывали по разности между количествами ^- и АТ-продуцентов; число неспецифических ^-продуцентов, индуцированных ТН-2 антигенами, вычисляли по разности между числами неспецифических ^-продуцентов в опыте и контроле. В опытах с CD5+ и CD5- субпопуляциями спленоцитов появление продуцентов АТ и увеличение числа клеток, синтезирующих неспецифические ^, зависело от CD5+ В-клеток. Эти данные подтверждены определением количеств АТ и ^-продуцентов в субпопуляциях, содержащих В-2- и В-1-лимфоциты (получены с помощью набора Dynal). Несмотря на значительное преобладание числа В-клеток в В-2 фракции (91% против ~13% в В-1 фракции) количества продуцентов АТ и индуцированных ТН-2 антигенами неспецифических ^ в обеих фракциях были примерно одинаковы. При расчете на 106 В-клеток фракция В-1 содержала в 67 раз больше клеток, синтезирующих АТ, и поликлонально активированных ^-продуцентов, чем фракция В-2. Таким образом, как специфический, так и поликлональный иммунный ответ на поливинил-пирролидон и декстран зависит, главным образом, от В-1-клеток. Одновременное введение двух ТН-2 антигенов не приводило к суммации числа клеток, продуцирующих индуцированные неспецифические ^, несмотря на то, что введение каждого из этих антигенов порознь вызывало отчетливое увеличение количества этих клеток в В-1 фракции. Заключается, что поликлональная активация В-1-клеток ТН-2 антигенами рестриктирована. Рестрикция зависит либо от размера способного к активации пула В-1-клеток, либо от количества неспецифических стимулирующих факторов.

Ключевые слова: В-клетки, антитела, ТН-2 антигены, иммуноглобулины

Gavrilova M.V., Chernyshova I.N., Sidorova E.V.

role of different b cell subpopulations in immune response to t-independent type 2 antigens

Abstract. The role of different B-cell subpopulations in polyclonal B-cell activation induced by T-independent antigens type 2 (TI-2) was under studies. CD5+B/B-1 cells were isolated from the spleens of mice immunized with polyvinyl pirrolidone, or a(1^3) dextran. The numbers of antibody (Ab) and Ig-producers in CD5+B/B-1 splenocytes were determined by ELISPOT The number of cells producing unspecific Ig was calculated as a difference between the numbers of Ig- and Ab-producers; the numbers of nonspecific Ig-producing splenocytes induced by TI-2 immunization were determined as differences between their contents in immunized and control animals. In experiments with CD5+ and CD5- splenocytic populations, the development of Ab-producers and “Г; “ increased numbers of cells producing unspecific Ig

Адрес для перышки: was dependent on the CD5+ B-cells. These data were

Гаврилова Марина Викторовна , . . . ,

confirmed in experiments with subpopulations of B-1

ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

П5088 Москва Ул 1-я ЛУбровСкаЯ д 15 and B-2 lymphocytes obtained with Dynal separation

_Z _Z iWi/t-A'DW* _Z УЬ l/Cx о С*/С • \J • _Z ^ . j • л pp* * j 1 * л

Не можете найти то что вам нужно? Попробуйте наш сервис подбора литературы.

Тел ■ (495) 674-08-42 kit. In spite of sufficient predominance of B-cells in B-

гъ //na ^ c'7 m 2 fraction (91% vs ~13% in B-1 fraction), the numbers

Факс: (495) 674-57-10 ' о • ,i -ст а

E-mail: Sidorova@bio.ru of Ab and TI-2-induced nonspecific Ig-producers were

nearly similar for the both cell fractions. Taking into account relative contents of B-cells, the numbers of Ab-and unspecific Ig- producers in B-1 fraction were 6- to 7-fold higher than in B-2 fraction. Thus, dependence on the B-1 cells exists both for polyclonal immune reactions to polyvinylpirrolidone and dextran, and specific response. Simultaneous injection of two TI-2 antigens did not induce additive effects upon the numbers of unspecific Ig-producers in B-1 fraction, in spite of marked increase in amounts of these cells after separate immunization with either of these antigens. It is concluded that polyclonal activation of B-1 cells by TI-2 antigens is subject to restriction which may depend either on the size of B-cell pool available for activation, or on insufficiency of appropriate stimulating factors. (Med. Immunol., 2007, vol. 9, N1, pp 39-46)

Введение

Введение антигена индуцирует не только появление антителообразующих клеток (АОК), но и увеличение числа клеток, образующих так называемые неспецифические иммуноглобулины (НИГОК). Увеличение числа НИГОК при введении Т-зависимых антигенов (ТЗ антигены) в основном обусловлено действием неспецифических стимулирующих Т-факторов; увеличение числа НИГОК под действием Т-независимых антигенов

1-го типа (ТН-1) зависит от внутренне присущей им митогенной активности; увеличение числа НИГОК под влиянием ТН-2 антигенов до сих пор не нашло объяснения. Не изучено влияние на этот процесс разных ТН-2 антигенов, не выяснена роль в нем различных клеточных популяций, не установлены механизмы, ответственные за наблюдаемую поликлональную активацию.

В настоящее время В-лимфоциты подразделяют на 4 субпопуляции: В-1а(CD5+), В-1Ь (CD5-), MZ-B и В-2 [3]. Известно, что в специфическом иммунном ответе на ТН-2 антигены в основном участвуют две субпопуляции В-лимфоцитов: В-1-клетки и В-лимфоциты маргинальной зоны селезенки (MZ-B клетки) [3, 9]. Следовало выяснить, каким субпопуляциям В-клеток принадлежит основная роль в поликлональной активации под действием ТН-2 антигенов: тем же самым, что и отвечающим за специфический иммунный ответ, т.е. В-1 и MZ-B клеткам, или В-2 лимфоцитам. С этой целью мышам BALB/c вводили различные ТН-2 антигены, порознь или в различных сочетаниях, и исследовали образование АОК и НИГОК в суспензиях тотальных и разделенных на субпопуляции В-клеток селезенки.

Материалы и методы

Животные, антигены, иммунизация

В опытах использовали мышей BALB/c, самок, 16-18 г весом, полученных из питомника «Столбовая» (Москва, Россия). В качестве ТН-2 антигенов использовали поливинилпирролидон с мол. массой 350 кДа (ПВП), альфа (1^3) де-кстран (Декс), полисахарид пневмококка ^Ш) и фиколл (Фик); в качестве ТЗ антигена использовали водорастворимый антиген бараньих эритроцитов (ВРАБЭ), полученный по методу [13].

Мышей иммунизировали 2 мкг ТН-2 антигенов, вводимых внутривенно, порознь или совместно, или введением 50 мкг ВРАБЭ вместе с 2 мкг ПВП. Селезенку извлекали на 4 сутки после иммунизации и в моноклеточной суспензии спленоцитов методом ELISPOT определяли количества АОК и клеток, образующих иммуноглобулины (ИГОК). Число НИГОК на 106 спленоцитов рассчитывали по разности между количествами ИГОК и АОК; число индуцированных антигеном НИГОК (инНИГОК) определяли по разности между количествами НИГОК в иммунных и нормальных суспензиях спленоцитов.

Для определения числа АОК нитроцелллю-лозные плашки (МАНА№510, МйИроге, №А) сенсибилизировали ТН-2 антигенами (10-50 мкг/лунку); для определения числа ИГОК плашки сенсибилизировали козьими антителами к иммуноглобулинам мыши (Ю^ USA; 5 мкг/ мл). Свободные места связывания блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА).

Спленоциты интактных и иммунизированных мышей наносили на подготовленные таким образом фильтры (по 100х103 клеток/лунку для выявления АОК и по 10х103 клеток/лунку для выявления ИГОК) и культивировали в среде RPMI 1640 с 1% фетальной сыворотки и другими необходимыми добавками в течение 16 ч при 37°С в СО2-инкубато-ре. По окончании культивирования клетки из лунок удаляли и обрабатывали фильтры последовательно кроличьей антисывороткой к ц-цепям мышиного ^М и пероксидазным конъюгатом бараньих антител к иммуноглобулинам кролика (усиливающая сыворотка и конъюгат получены в лаборатории). В качестве субстратного буфера использовали Трис-буфер рН 7.8, содержащий 1,4-хлорнафтол и перекись водорода. Реакция развивалась в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин и останавливалась добавлением воды. Единичные клетки, продуцирующие антитела и иммуноглобулины, выявлялись в виде синих пятен, подсчет которых проводили под микроскопом.

Не можете найти то что вам нужно? Попробуйте наш сервис подбора литературы.

Разделение спленоцитов на ^5+ и CD5- В-клеточные фракции

Для разделения В-спленоцитов на субпопуляции использовали два подхода. В первом из них получали суспензии, обедненные и обога-

щенные CD5+ В-лимфоцитами, а во втором — фракцию, содержащую В-2 клетки, и фракцию, обогащенную В-1-клетками («В-1»). В первом случае суспензии клеток селезенок интактных и иммунных мышей после лизиса эритроцитов инкубировали с магнитными бусами panT (Thy 1.2) (Dynal, Norway) на ротаторе при +4°С в течение 30 мин при соотношении бусы/клетки 4:1) и образующиеся розетки, содержащие Т-клет-ки, удаляли с помощью магнита. Не связавшиеся с бусами спленоциты обрабатывали 30 мин при +4°С моноклональными крысиными антителами к CD5 мыши (53-7.3, Pharmingen) и инкуби -ровали 30 мин при +4°С на ротаторе с магнитными бусами, содержащими антитела к крысиным IgG (Dynal). Образовавшиеся розетки отделяли на магните.

Разделение суспензии клеток селезенок на В-2 и «В-1» субпопуляции проводили при помощи набора (Dynal, Mouse B Cell Negative Isolation Kit) согласно инструкции фирмы. Суспензии клеток селезенок интактных и иммунных мышей обрабатывали 20 мин при +4°С коктейлем крысиных антител к CD43, CD4 и Ter-119 мыши. Затем клетки отмывали и инкубировали с магнитными бусами, содержащими антитела к крысиным IgG, 15 мин при комнатной температуре на ротаторе. В результате получали свободную от магнитных бус В-2 клеточную популяцию и «В-1» клетки в виде розеток с магнитными бусами, содержащими также Т-клетки, макрофаги и другие лейкоциты.

Для высвобождения клеток из розеток последние инкубировали 7 мин при 37°С при постоянном помешивании с 0,2% трипсином (Gibco) и отмывали средой RPMI 1640 при центрифугировании.

Функциональную активность В-лимфоци-тов, не связавшихся с бусами (CD5/8-2 клетки) и выделенных из розеток с помощью трипсина (CD5+/«В-1» клетки), исследовали методом ELISPOT.

Фенотипическая характеристика клеток

Для фенотипического анализа выделенных клеток использовали бараньи антитела к IgG, IgM мыши (Boenhringer Mannheim Biochemica, Germany), меченные FITC, и крысиные антитела к CD5 мыши, меченные фикоэритрином (PE) (Pharmingen).

Клетки инкубировали с антителами 30 мин при +4°С в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) c добавлением 1% БСА и 0,02% NaN3, дважды отмывали и фиксировали 1% параформальдегидом в ФСБ. Цитофлуориметрический анализ проводили на COULTER EPICS XL, данные были проанализированы в программе EPICS XL SYSTEM II.

Результаты

В 1-й серии опытов исследовали влияние иммунизации ТН-2 антигенами на специфический и поликлональный иммунный ответ. Введение ТН-2 антигенов индуцировало как появление АОК, так и нарастание общего числа иммуно-гобулин-образующих клеток (ИГОК) и, соответственно, появление инНИГОК (рис. 1). Количества АОК, индуцированных разными ТН-2 антигенами, колебались от 70/ млн спленоцитов (для Фик) до 364/млн спленоцитов (для ПВП), а количества инНИГОК — от 810/млн (для Фик) до 1874/млн (для Декс).

Ранее было показано, что одновременное введение мышам ВРАБЭ (ТЗ антиген) и Уі-антигена (ТН-2 антиген) приводит к суммации числа инНИГОК, индуцированных этими антигенами. Тогда же было высказано предположение о том, что в неспецифическую активацию В-клеток ТЗ и ТН-2 антигенами вовлекаются разные субпопуляции В-лимфоцитов [1]. Было интересно определить, что происходит со специфическим и поликлональным ответами при совместном введении двух ТН-2 антигенов. Данные, полученные при совместном введении двух ТН-2 антигенов в разных комбинациях, представлены на рис. 2. Для сравнения приведены результаты опыта с одновременным введением ТЗ (ВРАБЭ) и ТН-2 антигена (ПВП).

Как видно из рисунка, совместное введение ВРАБЭ и ПВП приводило к появлению АОК на тот и другой антигены и увеличению числа инНИГОК. Последнее при этом практически равнялось сумме чисел инНИГОК, индуцируемых каждым из этих антигенов в отдельности. Так, количества АОК и ИГОК при иммунизации ВРАБЭ составляли 3808 и 14300 на 106 спленоцитов, а при иммунизации ПВП — 820 и 5870 на 106 спленоцитов. Соответственные количества ИГОК равнялись 10492 и 5050 на 106 клеток. В норме выявлялось в среднем 245 АОК и 3000 ИГОК на 106 спленоцитов, т.е. 2755 НИГОК на 106 спленоцитов. Таким образом, число инНИГОК, индуцированных ВРАБЭ, составило 7692 на 106 клеток, а число инНИГОК, индуцированных ПВП, — 2295 на 106 спленоцитов. Теоретически суммарное количество инНИГОК должно было бы составить 9987 на 106 спленоцитов. Обнаруженное при совместном введении ВРАБЭ и ПВП число инНИГОК равнялось 10536 на 106 клеток, т.е. практически соответствовало теоретическому значению.

Принципиально иная картина наблюдалась при совместной иммунизации двумя ТН-2 антигенами. Ни в одном случае суммации числа инНИГОК обнаружить не удалось (рис. 2). Обычно количество появляющихся инНИГОК не превышало их числа, индуцированного более имму-

5000

Не можете найти то что вам нужно? Попробуйте наш сервис подбора литературы.

4000

3000

2000

1000

0

5000

4000

3000

2000

1000

0

поливинилпирролидон (ПВП)

1

АОК ИГОК НИГОК инНИГОК а (1^3) декстран (Декс)

Не можете найти то что вам нужно? Попробуйте наш сервис подбора литературы.

АОК ИГОК НИГОК инНИГОК

нормальные

3 5000 § 4000 6 3000

1 2000

Ф

§ 1000

о

0

т 6000

о

! 5000

X

§ 4000

0

6 3000

Не можете найти то что вам нужно? Попробуйте наш сервис подбора литературы.

1 2000

і 1000

т

0

иммунные

фиколл (Фик)

АОК ИГОК НИГОК инНИГОК полисахарид пневмококка ^Ш)

±

АОК ИГОК НИГОК инНИГОК ■ инНИГОК

Рисунок 1. Иммунный ответ на ТН-2 антигены

12000

Рисунок 2. Число индуцированных НИГОК при введении ТЗ и ТН-2 совместно и порознь (1-5)

Примечание: 1 - ПВП, 2 - Фик, 3 - Декс, 4 - SШ, 5 - ВРАБЭ.

ногенным из 2-х использованных в паре ТН-2 антигенов.

Необходимо подчеркнуть, что совместное введение ТН-2 антигенов не влияло на образование специфических АОК: их количества оставались практически такими же, как при введении этих антигенов порознь, а иногда даже слегка увеличивались.

Не можете найти то что вам нужно? Попробуйте наш сервис подбора литературы.

Полученные данные еще раз показали, что в поликлональную активацию В-лимфоцитов ТЗ и ТН-2 антигенами вовлекаются разные пулы В-лимфоцитов. При этом было очевидно, что под действием ТН-2 антигенов в такой ответ вовлекается ограниченная в размерах субпопуляция клеток. Для выяснения роли различных В-клеточных субпопуляций в индуцируемой ТН-2 антигенами поликлональной активации В-клеток были проведены опыты по разделению В-спленоцитов на фракции CD5- и CD5+ клеток и определению иммунного ответа в каждой из фракций.

Ранее в опытах с разделением спленоцитов на CD5+ В-1 и CD5- В-2 клетки на клеточном сорте-ре было показано, что в иммунном ответе на ПВП за появление и АОК и инНИГОК ответственны в основном CD5+ В-клетки [15]. В настоящей работе роль CD5+ и СD5- В, а также — В-2 и «В-1» клеток, полученных с помощью иммуномагнитной сепарации, исследовали при ответе на ПВП и Декс.

При иммунизации ПВП число АОК во фракциях CD5- и CD5+ спленоцитов (клетки, не связавшиеся с бусами, и клетки, выделенные из розеток, соответственно), составило 563 и 2420 на 106 спленоцитов, а число инНИГОК — 1778 и 4008 на 106 спленоцитов соответственно. Таким образом, за появление как АОК, так и НИГОК отвечали в основном CD5+ В-клетки, что согла-

суется с данными, полученными ранее другим способом.

При иммунизации Декс удаление из суспензии CD5+В-клеток понижало число АОК ~ на 25%. Количество АОК в CD5+ В-клеточной популяци и при этом превышало число АОК в CD5- популяции ~ в 2-3 раза, что свидетельствовало об обогащении CD5+ фракции продуцентами антител. Однако, в отличие от опытов с ПВП, значительного увеличения числа инНИГОК в этой фракции обнаружить не удалось.

На следующем этапе количества АОК и инНИГОК определяли непосредственно в субпопуляциях «В-1» и В-2. При иммунизации ПВП во фракции «В-1», содержались большие их количества (1066/106 и 27 92/106), чем во фракции В-2 (754/106 и 1251/106 соответственно), а при иммунизации Декс числа АОК во фракциях «В-1» и В-2 оказались близкими по значению (537/106 и 468/106 соответственно).

Поскольку числа АОК и ИГОК рассчитывались на 106 клеток, а количества В-лимфоцитов в субпопуляциях В-2 и «В-1» могли сильно различаться, для оценки реального содержания В-клеток во фракциях В-2 и «В-1» использовали метод проточной цитофлуориметрии. Было установлено, что в В-2 фракции содержится ~ в 6 раз больше В-кле-ток, чем во фракции «В-1». CD5+ В-клеток в В-2 фракциии было выявлено 1-2%, а в «В-1» фракции — 47% (последняя включает Т-лимфоциты, макрофаги и др.) (рис. 3). Это означает, что количества АОК и ИГОК, а следовательно, и инНИГОК в субпопуляциях «В-1» В-лимфоцитов примерно в 6-7 раз превышают таковые в В-2 субпопуляции.

Наличие в В-2 субпопуляции значительных количеств АОК и ИГОК, особенно выраженное

Рисунок 3. Содержание В-лимфоцитов во фракциях В-2 (а) и В-1 (б)

Примечание: область С - В-лимфоциты, экспрессирующие 1д (окрашивание ФИТЦ-Ат к 1д мыши).

при иммунизации Декс, привело к предположению о том, что за это ответственны MZ-B лимфоциты, которые при использовании для разделения клеток коммерческого набора попадают в В-2 фракцию. С целью проверки этого предположения из В-2 лимфоцитов методом иммуно-магнитной сепарации (на бусах, сенсибилизированных анти-CD23 антителами) удаляли В-2 клетки и определяли количества АОК и инНИГОК в исходной и обедненной CD23+ В-клетками (В-2 и MZ-B клетки, соответственно) фракциях. Согласно предварительным данным, при введении Декс основная масса АОК и инНИГОК принадлежала CD23- В-клеткам: в В-2 субпопуляции число АОК составило 5 95/106 и инНИГОК 3538/106, а для MZ — 1480/106 и 80 00/106, соответственно.

Разработка метода высвобождения клеток из розеток и установление роли «В-1» клеток в поликлональной активации при ответе на ТН-2 антигены позволили прямо определить количества инНИГОК, во фракциях «В-1» и В-2 клеток при одновременной иммунизации двумя ТН-2 антигенами. Полученные данные приведены на рис. 4. Видно, что несмотря на четкое увеличение числа инНИГОК в «В-1» фракциях при раздельном введении ТН-2, их совместное введение ни к какой суммации количества инНИГОК не приводит. Таким образом, данные, полученные на тотальной суспензии спленоцитов, получили полное подтверждение.

Обсуждение

Много лет назад Бойд и Бернард обнаружили, что при иммунизации белковыми антигенами по-мимообразованияантителнаблюдаетсяувеличение содержания иммуноглобулинов, не реагирующих с введенным антигеном и названных ими неспецифическими иммуноглобулинами (НИГ) [6]. Позднее было показано, что индукцию образования НИГ вызывают самые разные растворимые и корпускулярные ТЗ антигены (белки, эритроциты, вирусы), а также некоторые Т-независимые антигены (ЛПС, Уі-антиген) [1, 4, 10, 14].

Появление НИГ под действием ТЗ антигенов в основном обусловлено действием неспецифических стимулирующих факторов, образуемых стимулированными антигеном Т-лимфоцитами. Увеличение синтеза НИГ под действием ТН-2 антигенов, не реагирующих с Т-клетками и не обладающих митогенной активностью, до сих пор не объяснено.

Не можете найти то что вам нужно? Попробуйте наш сервис подбора литературы.

Ранее появление индуцированных антигеном НИГ было выявлено при введении животным Уі-антигена сальмонеллы и ПВП [1]. В настоящей работе круг ТН-2 антигенов был расширен: в опытах использовали синтетический антиген — ПВП, полисахаридные антигены пневмококка и лейконостока и фиколл. Количества АОК и ИГОК в суспензиях спленоцитов определяли на 4-е сутки после иммунизации, т.е. на максиму-

3000

тотальные спленоциты

НИГОКПВП

НИГОК Декс

НИГОК ПВП+Декс

Рисунок 4. Число НИГОК, индуцированных ПВП и Декс, введенных порознь и совместно

ме иммунного ответа, и пересчитывали числа АОК и инНИГОК на 106 спленоцитов или В-клеток.

Внутривенное введение использованных ТН-2 антигенов, как и ожидалось, приводило не только к образованию АОК, но и к появлению инНИГОК, т.е. индуцировало и специфическую и неспецифическую (поликлональную) активацию В-клеток. Иммуногенность ТН-2 антигенов существенно ниже, чем ТЗ антигенов. Соответственно, и специфический (число АОК) и неспецифический (число инНИГОК) ответы на ТН-2 антигены были значительно ниже, чем на ТЗ антиген (см. рис. 2).

С ортодоксальной точки зрения, ТН-2 антигены, не связывающиеся с Toll-like 5 рецептором, лишены «внутренней» митогенной активности [7]. Следовательно, наблюдаемое в опытах увеличение числа клеток, синтезирующих НИГ, обусловлено какими-то другими, пока не установленными механизмами. Возможно, роль в этом играют неспецифические стимулирующие В-факторы (по аналогии с таковыми Т-клеток) [12]. Не исключена и роль стимулирующих факторов, продуцируемых другими клетками, в том числе — Т-клетками, активированными посторонними антигенами или же НК, макрофагами и дендритными клетками. Этот вопрос нуждается в дальнейшем исследовании.

Суммация количества инНИГОК, обнаруженная ранее при одновременном введении ТЗ и ТН-2 антигенов привела к предположению об участии в поликлональной активации, индуцируемой такими антигенами, разных субпопуляций В-лим-фоцитов. Косвенным образом это подтверждалось данными, полученными при одновременном введении двух ТН-2 антигенов: суммациия числа инНИГОК отсутствовала при любых комбинациях ТН-2 антигенов. При одновременном введении 2-х ТН-2 антигенов число инНИГОК обычно не превышало такового при ответе на наиболее иммуногенный из них. Объяснить эти данные наличием неспецифической супрессии, вызванной увеличением в 2 раза общей дозы ТН-2 антигенов вряд ли возможно, т.к. использованные дозы ТН-2 антигенов не являются супрессивными [2]. Кроме того, против неспецифической супрессии говорит отсутствие какого-либо угнетения специфического иммунного ответа. Как уже говорилось, количества АОК при совместном введении

2-х ТН-2 антигенов не только не снижались, но в некоторых случаях даже немного возрастали.

Отсутствие суммации числа инНИГОК при одновременном введении двух ТН-2 антигенов позволяет предположить, что эти антигены по-ликлонально активируют одну и ту же ограниченную в размере популяцию клеток. К таковым может относиться либо небольшая субпопуляция В-клеток, способных неспецифически активироваться к синтезу НИГ ТН-2 антигенами,

(например, клетки, находящиеся в определенной фазе клеточного цикла), либо ограниченная в размерах популяция клеток, продуцирующих факторы, неспецифически стимулирующие любые В-лимфоциты. Очевидно, что для выяснения механизма образования НИГ в ответ на ТН-2 антигены была необходима прямая фенотипическая характеристика клеток, ответственных за этот процесс.

Ранее для одного из ТН-2 — ПВП — было показано, что СD5+ В-1 клетки ответственны как за образование антител, так и за поликлональную стимуляцию [15]. Было интересно выяснить роль В-1 субпопуляции и в поликлональной активации, индуцируемой другим ТН-2 антигеном — Декс. При иммунизации Декс также, как и при введении ПВП, удаление CD5+ В-клеток приводило к снижению числа АОК на 25%. Напротив, число АОК в CD5+ В клеточной популяции превышало число АОК в группе CD5- В-клеток в 2-3 раза. Это указывало на доминирующую роль CD5+В-клеток в специфическом иммунном ответе на Декс. Однако, в отличие от опытов с ПВП, в случае Декс значительного увеличения количества инНИГОК в CD5+ фракции не обнаружилось.

Не можете найти то что вам нужно? Попробуйте наш сервис подбора литературы.

Известно, что В-1-клетки подразделяются на В-1а (CD5+) и В-1Ь (CD5-) [5, 8]. Очевидно, что при изучении иммунного ответа на Декс и ПВП в CD5+ и CD5- субпопуляциях В-клеток мы не учитывали роли последней субпопуляции. Различие по маркеру CD43, одному из фенотипических маркеров, отличающих В-1 субпопуляцию от В-2 клеток [16], позволило разделить суспензию спленоцитов на «В-1» и В-2 субпопуляции. Как и ранее при иммунизации ПВП наибольшее увеличение АОК и инНИГОК наблюдалось во фракции «В-1». В случае Декс число инНИГОК было максимальным также в «В-1» фракции, однако количества АОК в группах В-1 и В-2 были близкими по значению. Так как используемый для разделения клеток набор не позволяет получить чистую В-1-клеточную субпопуляцию (после выделения она включает Т-лимфоциты, макрофаги и другие лейкоциты), состав обеих полученных фракций был проанализирован методом проточной цито-флуориметрии. Оказалось, что содержание В-кле-ток в В-2 фракции примерно в 7 раз выше, чем в «В-1» (91,2% и 13,9% соответственно). Это значит, что основными продуцентами и антител и индуцированных Декс НИГ являются, как и в случае с ПВП, В-1 лимфоциты. Полученные данные позволяют заключить что как специфический, так и поликлональный иммунный ответ на ПВП и Декс зависит главным образом от В-1-клеток.

Следует отметить, что ПВП и особенно Декс индуцируют образование АОК и инНИГОК и в В-2 субпопуляции. Можно было предположить, что их появление обусловлено присут-

ствием в В-2 фракции В-клеток маргинальной зоны селезенки (MZ-В). Для проверки этого предположения были проведены опыты по удалению из В-2 фракции CD23+ В-клеток (в основном В-2 клетки) [9, 11]. Это позволило получить В-клеточную популяцию, обогащенную MZ-В-клет-ками. Согласно предварительным данным, преобладающее число АОК и НИГОК было обнаружено именно в этой фракции.

Разработка метода высвобождения клеток из розеток позволила исследовать ответ на одновременное введение 2-х ТН-2 антигенов во фракциях «В-1» и В-2 лимфоцитов. Было установлено, что при совместной иммунизации мышей ПВП и Декс наибольшие количества АОК и инНИГОК выявляются именно в «В-1» фракции, однако, никакой суммации числа инНИГОК при этом не наблюдается. Полученные данные подтверждают результаты опытов на тотальных суспензиях спленоцитов и позволяют предполагать, что поликлональная активация В-1-клеток, индуцированная введением двух ТН-2, рестриктирована либо размерами способного к такой активации пула «посторонних» В-1/MZ-B-клеток, либо количеством неспецифических стимулирующих факторов, возникающих под влиянием ТН-2 антигенов.

Благодарности

Выражаем благодарность за помощь в оформлении статьи аспиранту лаборатории Дмитрию Александровичу Ходченкову.

Работа выполнена при поддержке РФФИ.

Список литературы

1. Агаджанян М.Г., Меграбян Т.Б., Сидорова Е.В. Нарастание числа клеток, секретирующих антитела и клеток, секретирующих неспецифические иммуноглобулины, при иммунизации мышей Т-зависимым и Т-независимым антигенами // Бюлл. эксперим. биол. мед. — 1981. — Т. 92. - С. 66-68.

2. Агаджанян М.Г., Смирнова И.Н.,Сидорова Е.В. Зависимость образования продуцентов анти-гензависимых неспецифических иммуноглобулинов от дозы Т-зависимого и Т-независимых антигенов // Бюлл. эксперим. биол. мед. — 1986. — Т. СП — № 8. — С. 206-208.

3. Сидорова Е.В. Что нам известно сегодня о В-клетках // Успехи современ. биологии. — 2006. — Т. 126. — № 3. — С. 227-242.

4. Bakay M., Biladi I., Berencsi K., Sidorova E., Agadzhanian M., Fachet F., Erdei J. Immuno-

enhancement and suppression induced by adenovirus in chicken // Acta Virol. — 1992. — ЛЫ. 36. — Р. 269-276.

5. Baumgarth N., Tung J.W, Herzenberg L.A. Inherent specificities in natural antibodies: a key to immune defense against pathogen invasion // Springer Semin. Immun. — 2005. — Vol. 26. — P. 347-362.

6. Boyd W.C., Bernard H. Quantitative changes in antibodies and y-globulin fraction in sera of rabbits injected with several antigens // J. Immunol. — 1937. — V. 33. — P. 111-122.

Не можете найти то что вам нужно? Попробуйте наш сервис подбора литературы.

7. Chandrashekhar P., Medzhitov R. Control of B-cell responses by Toll-like receptors // Nature Letters — 2005. — Vol. 438. — P. 364-368.

8. Hardy R.R., Hayakawa K. B cell development pathways // Ann. Rev. Immunol. — 2001. — Vol. 19. — P. 595-621.

9. Martin F., Kearney J. B-cell subsets and the mature preimmune repertoire. Marginal zone and B1 cells as part of a «natural immune memory» // Immunol. Rev. — 2000. — Vol. 175. — P. 70-79.

10. Mond J.J, Lees A., Snapper C.M. T cell-independent antigens type 2 // Ann. Rev. Immunol. — 1995. — V. 13. — P. 655-692.

11. OliverA.M,Martin F.,GartlandG.L.,CarterR.H., Kearney J.F. Marginal zone B cells exhibit unique activation, proliferative and immunoglobulin secretory responses // Eur. J. Immunol. — 1997. — Vol. 27, N 7. — P. 2366-2374.

12. Pers J.O., Jamin C.,Youinou P., Charreire J. Role of IL-10 in the distribution of B cell subsets in the mouse B-1 cellpopulation // Eur. Cytokine Netw. — 2003. — Vol. 14, N 3 — P. 178-185.

13. Seman M., Mazie J.C., Bussard A.E. Antigenic properties of a water soluble fraction of sheep erythrocytes // Eur. J. Immunol. — 1972. — Vol. 4. — P. 387-388.

14. Sidorova E.V, Agadzhanian M.G., Mazhul L.A., Biladi I., Bakai M., Berenchi K. Immunosuppresson induced by respiratory viruses (influenza virus, adenovirus) in mice // Biull. Eksp. Biol. Med. — 1991. — Vol. 111. — P. 510-512.

15. Sidorova E.V., Li-Sheng Lu, Devlin B., Chernishova I., Gavrilova M. Role of different B-cell subsets in the specific and polyclonal immune response to T-independent antigens type 2 // Immunol. Letts. — 2003. — Vol. 88. — P. 37-42.

16. Wells S.M., Kantor A.B., Stall A.M. CD43(S7) expression identifies peripheral B cell subsets // J. Immunol. — 1994. — Vol. 153, N 12. — P. 55035515.

поступила в редакцию 11.01.2007 принята к печати 16.01.2007