Научная статья на тему 'Роль различных субпопуляций В-клеток в иммунном ответе на т-независимые антигены 2-го типа'

Роль различных субпопуляций В-клеток в иммунном ответе на т-независимые антигены 2-го типа Текст научной статьи по специальности «Биология»

CC BY
181
43
Поделиться
Журнал
Медицинская иммунология
Scopus
ВАК
Область наук
Ключевые слова
В-КЛЕТКИ / АНТИТЕЛА / ТН-2 АНТИГЕНЫ / ИММУНОГЛОБУЛИНЫ

Аннотация научной статьи по биологии, автор научной работы — Гаврилова М. В., Чернышова И. Н., Сидорова Е. В.

Исследована роль субпопуляций В-клеток в поликлональной активации В-лимфоцитов, индуцированной Т-независимыми антигенами 2-го типа (ТН-2 антигены). Из суспензий спленоцитов мышей, иммунизированных поливинилпирролидоном или б(1ЃЁ3) декстраном, выделяли CD5-BB-1-клетки. Числа антитело(АТ) и Ig-продуцентов определяли методом ELISPOT. Количество продуцентов неспецифических Ig рассчитывали по разности между количествами Igи АТ-продуцентов; число неспецифических Ig-продуцентов, индуцированных ТН-2 антигенами, вычисляли по разности между числами неспецифических Ig-продуцентов в опыте и контроле. В опытах с CD5и CD5субпопуляциями спленоцитов появление продуцентов АТ и увеличение числа клеток, синтезирующих неспецифические Ig, зависело от CD5B-клеток. Эти данные подтверждены определением количеств АТ и Ig-продуцентов в субпопуляциях, содержащих В-2и В-1-лимфоциты (получены с помощью набора Dynal). Несмотря на значительное преобладание числа В-клеток в В-2 фракции (91% против ~13в В-1 фракции) количества продуцентов АТ и индуцированных ТН-2 антигенами неспецифических Ig в обеих фракциях были примерно одинаковы. При расчете на 106 В-клеток фракция В-1 содержала в 67 раз больше клеток, синтезирующих АТ, и поликлонально активированных Ig-продуцентов, чем фракция В-2. Таким образом, как специфический, так и поликлональный иммунный ответ на поливинилпирролидон и декстран зависит, главным образом, от В-1-клеток. Одновременное введение двух ТН-2 антигенов не приводило к суммации числа клеток, продуцирующих индуцированные неспецифические Ig, несмотря на то, что введение каждого из этих антигенов порознь вызывало отчетливое увеличение количества этих клеток в В-1 фракции. Заключается, что поликлональная активация В-1-клеток ТН-2 антигенами рестриктирована. Рестрикция зависит либо от размера способного к активации пула В-1-клеток, либо от количества неспецифических стимулирующих факторов.

Похожие темы научных работ по биологии , автор научной работы — Гаврилова М.В., Чернышова И.Н., Сидорова Е.В.,

Role of different B cell subpopulations in immune response to t-independent type 2 antigens

The role of different B-cell subpopulations in polyclonal B-cell activation induced by T-independent antigens type 2 (TI-2) was under studies. CD5-B/B-1 cells were isolated from the spleens of mice immunized with polyvinyl pirrolidone, or б(1ЃЁ3) dextran. The numbers of antibody (Ab) and Ig-producers in CD5-B/B-1 splenocytes were determined by ELISPOT. The number of cells producing unspecific Ig was calculated as a difference between the numbers of Igand Ab-producers; the numbers of nonspecific Ig-producing splenocytes induced by TI-2 immunization were determined as differences between their contents in immunized and control animals. In experiments with CD5and CD5splenocytic populations, the development of Ab-producers and increased numbers of cells producing unspecific Ig was dependent on the CD5B-cells. These data were confirmed in experiments with subpopulations of B-1 and B-2 lymphocytes obtained with Dynal separation kit. In spite of sufficient predominance of B-cells in B2 fraction (91% vs ~13% in B-1 fraction), the numbers of Ab and TI-2-induced nonspecific Ig-producers were аnearly similar for the both cell fractions. Taking into account relative contents of B-cells, the numbers of Aband unspecific Igproducers in B-1 fraction were 6to 7-fold higher than in B-2 fraction. Thus, dependence on the B-1 cells exists both for polyclonal immune reactions to polyvinylpirrolidone and dextran, and specific response. Simultaneous injection of two TI-2 antigens did not induce additive effects upon the numbers of unspecific Ig-producers in B-1 fraction, in spite of marked increase in amounts of these cells after separate immunization with either of these antigens. It is concluded that polyclonal activation of B-1 cells by TI-2 antigens is subject to restriction which may depend either on the size of B-cell pool available for activation, or on insufficiency of appropriate stimulating factors.

Текст научной работы на тему «Роль различных субпопуляций В-клеток в иммунном ответе на т-независимые антигены 2-го типа»

Медицинская Иммунология 2007, Т. 9, № 1, стр. 39-46 © 2007, СПб РО РААКИ

Оригинальные статьи

Роль различных сувпопуляций В-клЕток в иммунном ответе на т-независимые антигены 2-го типа

Гаврилова М.В., Чернышова И.Н., Сидорова Е.В.

ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, Москва

Резюме. Исследована роль субпопуляций В-клеток в поликлональной активации В-лимфоцитов, индуцированной Т-независимыми антигенами 2-го типа (ТН-2 антигены). Из суспензий спленоци-тов мышей, иммунизированных поливинилпирролидоном или а(1^3) декстраном, выделяли CD5+B/ В-1-клетки. Числа антитело- (АТ) и ^-продуцентов определяли методом ELISPOT Количество продуцентов неспецифических ^ рассчитывали по разности между количествами ^- и АТ-продуцентов; число неспецифических ^-продуцентов, индуцированных ТН-2 антигенами, вычисляли по разности между числами неспецифических ^-продуцентов в опыте и контроле. В опытах с CD5+ и CD5- субпопуляциями спленоцитов появление продуцентов АТ и увеличение числа клеток, синтезирующих неспецифические ^, зависело от CD5+ В-клеток. Эти данные подтверждены определением количеств АТ и ^-продуцентов в субпопуляциях, содержащих В-2- и В-1-лимфоциты (получены с помощью набора Dynal). Несмотря на значительное преобладание числа В-клеток в В-2 фракции (91% против ~13% в В-1 фракции) количества продуцентов АТ и индуцированных ТН-2 антигенами неспецифических ^ в обеих фракциях были примерно одинаковы. При расчете на 106 В-клеток фракция В-1 содержала в 67 раз больше клеток, синтезирующих АТ, и поликлонально активированных ^-продуцентов, чем фракция В-2. Таким образом, как специфический, так и поликлональный иммунный ответ на поливинил-пирролидон и декстран зависит, главным образом, от В-1-клеток. Одновременное введение двух ТН-2 антигенов не приводило к суммации числа клеток, продуцирующих индуцированные неспецифические ^, несмотря на то, что введение каждого из этих антигенов порознь вызывало отчетливое увеличение количества этих клеток в В-1 фракции. Заключается, что поликлональная активация В-1-клеток ТН-2 антигенами рестриктирована. Рестрикция зависит либо от размера способного к активации пула В-1-клеток, либо от количества неспецифических стимулирующих факторов.

Ключевые слова: В-клетки, антитела, ТН-2 антигены, иммуноглобулины

Gavrilova M.V., Chernyshova I.N., Sidorova E.V.

role of different b cell subpopulations in immune response to t-independent type 2 antigens

Abstract. The role of different B-cell subpopulations in polyclonal B-cell activation induced by T-independent antigens type 2 (TI-2) was under studies. CD5+B/B-1 cells were isolated from the spleens of mice immunized with polyvinyl pirrolidone, or a(1^3) dextran. The numbers of antibody (Ab) and Ig-producers in CD5+B/B-1 splenocytes were determined by ELISPOT The number of cells producing unspecific Ig was calculated as a difference between the numbers of Ig- and Ab-producers; the numbers of nonspecific Ig-producing splenocytes induced by TI-2 immunization were determined as differences between their contents in immunized and control animals. In experiments with CD5+ and CD5- splenocytic populations, the development of Ab-producers and “Г; “ increased numbers of cells producing unspecific Ig

Адрес для перышки: was dependent on the CD5+ B-cells. These data were

Гаврилова Марина Викторовна , . . . ,

confirmed in experiments with subpopulations of B-1

ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

П5088 Москва Ул 1-я ЛУбровСкаЯ д 15 and B-2 lymphocytes obtained with Dynal separation

_Z _Z iWi/t-A'DW* _Z УЬ l/Cx о С*/С • \J • _Z ^ . j • л pp* * j 1 * л

Тел ■ (495) 674-08-42 kit. In spite of sufficient predominance of B-cells in B-

гъ //na ^ c'7 m 2 fraction (91% vs ~13% in B-1 fraction), the numbers

Факс: (495) 674-57-10 ' о • ,i -ст а

E-mail: Sidorova@bio.ru of Ab and TI-2-induced nonspecific Ig-producers were

nearly similar for the both cell fractions. Taking into account relative contents of B-cells, the numbers of Ab-and unspecific Ig- producers in B-1 fraction were 6- to 7-fold higher than in B-2 fraction. Thus, dependence on the B-1 cells exists both for polyclonal immune reactions to polyvinylpirrolidone and dextran, and specific response. Simultaneous injection of two TI-2 antigens did not induce additive effects upon the numbers of unspecific Ig-producers in B-1 fraction, in spite of marked increase in amounts of these cells after separate immunization with either of these antigens. It is concluded that polyclonal activation of B-1 cells by TI-2 antigens is subject to restriction which may depend either on the size of B-cell pool available for activation, or on insufficiency of appropriate stimulating factors. (Med. Immunol., 2007, vol. 9, N1, pp 39-46)

Введение

Введение антигена индуцирует не только появление антителообразующих клеток (АОК), но и увеличение числа клеток, образующих так называемые неспецифические иммуноглобулины (НИГОК). Увеличение числа НИГОК при введении Т-зависимых антигенов (ТЗ антигены) в основном обусловлено действием неспецифических стимулирующих Т-факторов; увеличение числа НИГОК под действием Т-независимых антигенов

1-го типа (ТН-1) зависит от внутренне присущей им митогенной активности; увеличение числа НИГОК под влиянием ТН-2 антигенов до сих пор не нашло объяснения. Не изучено влияние на этот процесс разных ТН-2 антигенов, не выяснена роль в нем различных клеточных популяций, не установлены механизмы, ответственные за наблюдаемую поликлональную активацию.

В настоящее время В-лимфоциты подразделяют на 4 субпопуляции: В-1а(CD5+), В-1Ь (CD5-), MZ-B и В-2 [3]. Известно, что в специфическом иммунном ответе на ТН-2 антигены в основном участвуют две субпопуляции В-лимфоцитов: В-1-клетки и В-лимфоциты маргинальной зоны селезенки (MZ-B клетки) [3, 9]. Следовало выяснить, каким субпопуляциям В-клеток принадлежит основная роль в поликлональной активации под действием ТН-2 антигенов: тем же самым, что и отвечающим за специфический иммунный ответ, т.е. В-1 и MZ-B клеткам, или В-2 лимфоцитам. С этой целью мышам BALB/c вводили различные ТН-2 антигены, порознь или в различных сочетаниях, и исследовали образование АОК и НИГОК в суспензиях тотальных и разделенных на субпопуляции В-клеток селезенки.

Материалы и методы

Животные, антигены, иммунизация

В опытах использовали мышей BALB/c, самок, 16-18 г весом, полученных из питомника «Столбовая» (Москва, Россия). В качестве ТН-2 антигенов использовали поливинилпирролидон с мол. массой 350 кДа (ПВП), альфа (1^3) де-кстран (Декс), полисахарид пневмококка ^Ш) и фиколл (Фик); в качестве ТЗ антигена использовали водорастворимый антиген бараньих эритроцитов (ВРАБЭ), полученный по методу [13].

Мышей иммунизировали 2 мкг ТН-2 антигенов, вводимых внутривенно, порознь или совместно, или введением 50 мкг ВРАБЭ вместе с 2 мкг ПВП. Селезенку извлекали на 4 сутки после иммунизации и в моноклеточной суспензии спленоцитов методом ELISPOT определяли количества АОК и клеток, образующих иммуноглобулины (ИГОК). Число НИГОК на 106 спленоцитов рассчитывали по разности между количествами ИГОК и АОК; число индуцированных антигеном НИГОК (инНИГОК) определяли по разности между количествами НИГОК в иммунных и нормальных суспензиях спленоцитов.

Для определения числа АОК нитроцелллю-лозные плашки (МАНА№510, МйИроге, №А) сенсибилизировали ТН-2 антигенами (10-50 мкг/лунку); для определения числа ИГОК плашки сенсибилизировали козьими антителами к иммуноглобулинам мыши (Ю^ USA; 5 мкг/ мл). Свободные места связывания блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА).

Спленоциты интактных и иммунизированных мышей наносили на подготовленные таким образом фильтры (по 100х103 клеток/лунку для выявления АОК и по 10х103 клеток/лунку для выявления ИГОК) и культивировали в среде RPMI 1640 с 1% фетальной сыворотки и другими необходимыми добавками в течение 16 ч при 37°С в СО2-инкубато-ре. По окончании культивирования клетки из лунок удаляли и обрабатывали фильтры последовательно кроличьей антисывороткой к ц-цепям мышиного ^М и пероксидазным конъюгатом бараньих антител к иммуноглобулинам кролика (усиливающая сыворотка и конъюгат получены в лаборатории). В качестве субстратного буфера использовали Трис-буфер рН 7.8, содержащий 1,4-хлорнафтол и перекись водорода. Реакция развивалась в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин и останавливалась добавлением воды. Единичные клетки, продуцирующие антитела и иммуноглобулины, выявлялись в виде синих пятен, подсчет которых проводили под микроскопом.

Разделение спленоцитов на ^5+ и CD5- В-клеточные фракции

Для разделения В-спленоцитов на субпопуляции использовали два подхода. В первом из них получали суспензии, обедненные и обога-

щенные CD5+ В-лимфоцитами, а во втором — фракцию, содержащую В-2 клетки, и фракцию, обогащенную В-1-клетками («В-1»). В первом случае суспензии клеток селезенок интактных и иммунных мышей после лизиса эритроцитов инкубировали с магнитными бусами panT (Thy 1.2) (Dynal, Norway) на ротаторе при +4°С в течение 30 мин при соотношении бусы/клетки 4:1) и образующиеся розетки, содержащие Т-клет-ки, удаляли с помощью магнита. Не связавшиеся с бусами спленоциты обрабатывали 30 мин при +4°С моноклональными крысиными антителами к CD5 мыши (53-7.3, Pharmingen) и инкуби -ровали 30 мин при +4°С на ротаторе с магнитными бусами, содержащими антитела к крысиным IgG (Dynal). Образовавшиеся розетки отделяли на магните.

Разделение суспензии клеток селезенок на В-2 и «В-1» субпопуляции проводили при помощи набора (Dynal, Mouse B Cell Negative Isolation Kit) согласно инструкции фирмы. Суспензии клеток селезенок интактных и иммунных мышей обрабатывали 20 мин при +4°С коктейлем крысиных антител к CD43, CD4 и Ter-119 мыши. Затем клетки отмывали и инкубировали с магнитными бусами, содержащими антитела к крысиным IgG, 15 мин при комнатной температуре на ротаторе. В результате получали свободную от магнитных бус В-2 клеточную популяцию и «В-1» клетки в виде розеток с магнитными бусами, содержащими также Т-клетки, макрофаги и другие лейкоциты.

Для высвобождения клеток из розеток последние инкубировали 7 мин при 37°С при постоянном помешивании с 0,2% трипсином (Gibco) и отмывали средой RPMI 1640 при центрифугировании.

Функциональную активность В-лимфоци-тов, не связавшихся с бусами (CD5/8-2 клетки) и выделенных из розеток с помощью трипсина (CD5+/«В-1» клетки), исследовали методом ELISPOT.

Фенотипическая характеристика клеток

Для фенотипического анализа выделенных клеток использовали бараньи антитела к IgG, IgM мыши (Boenhringer Mannheim Biochemica, Germany), меченные FITC, и крысиные антитела к CD5 мыши, меченные фикоэритрином (PE) (Pharmingen).

Клетки инкубировали с антителами 30 мин при +4°С в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) c добавлением 1% БСА и 0,02% NaN3, дважды отмывали и фиксировали 1% параформальдегидом в ФСБ. Цитофлуориметрический анализ проводили на COULTER EPICS XL, данные были проанализированы в программе EPICS XL SYSTEM II.

Результаты

В 1-й серии опытов исследовали влияние иммунизации ТН-2 антигенами на специфический и поликлональный иммунный ответ. Введение ТН-2 антигенов индуцировало как появление АОК, так и нарастание общего числа иммуно-гобулин-образующих клеток (ИГОК) и, соответственно, появление инНИГОК (рис. 1). Количества АОК, индуцированных разными ТН-2 антигенами, колебались от 70/ млн спленоцитов (для Фик) до 364/млн спленоцитов (для ПВП), а количества инНИГОК — от 810/млн (для Фик) до 1874/млн (для Декс).

Ранее было показано, что одновременное введение мышам ВРАБЭ (ТЗ антиген) и Уі-антигена (ТН-2 антиген) приводит к суммации числа инНИГОК, индуцированных этими антигенами. Тогда же было высказано предположение о том, что в неспецифическую активацию В-клеток ТЗ и ТН-2 антигенами вовлекаются разные субпопуляции В-лимфоцитов [1]. Было интересно определить, что происходит со специфическим и поликлональным ответами при совместном введении двух ТН-2 антигенов. Данные, полученные при совместном введении двух ТН-2 антигенов в разных комбинациях, представлены на рис. 2. Для сравнения приведены результаты опыта с одновременным введением ТЗ (ВРАБЭ) и ТН-2 антигена (ПВП).

Как видно из рисунка, совместное введение ВРАБЭ и ПВП приводило к появлению АОК на тот и другой антигены и увеличению числа инНИГОК. Последнее при этом практически равнялось сумме чисел инНИГОК, индуцируемых каждым из этих антигенов в отдельности. Так, количества АОК и ИГОК при иммунизации ВРАБЭ составляли 3808 и 14300 на 106 спленоцитов, а при иммунизации ПВП — 820 и 5870 на 106 спленоцитов. Соответственные количества ИГОК равнялись 10492 и 5050 на 106 клеток. В норме выявлялось в среднем 245 АОК и 3000 ИГОК на 106 спленоцитов, т.е. 2755 НИГОК на 106 спленоцитов. Таким образом, число инНИГОК, индуцированных ВРАБЭ, составило 7692 на 106 клеток, а число инНИГОК, индуцированных ПВП, — 2295 на 106 спленоцитов. Теоретически суммарное количество инНИГОК должно было бы составить 9987 на 106 спленоцитов. Обнаруженное при совместном введении ВРАБЭ и ПВП число инНИГОК равнялось 10536 на 106 клеток, т.е. практически соответствовало теоретическому значению.

Принципиально иная картина наблюдалась при совместной иммунизации двумя ТН-2 антигенами. Ни в одном случае суммации числа инНИГОК обнаружить не удалось (рис. 2). Обычно количество появляющихся инНИГОК не превышало их числа, индуцированного более имму-

5000

4000

3000

2000

1000

0

5000

4000

3000

2000

1000

0

поливинилпирролидон (ПВП)

1

АОК ИГОК НИГОК инНИГОК а (1^3) декстран (Декс)

АОК ИГОК НИГОК инНИГОК

нормальные

3 5000 § 4000 6 3000

1 2000

Ф

§ 1000

о

0

т 6000

о

! 5000

X

§ 4000

0

6 3000

1 2000

і 1000

т

0

иммунные

фиколл (Фик)

АОК ИГОК НИГОК инНИГОК полисахарид пневмококка ^Ш)

±

АОК ИГОК НИГОК инНИГОК ■ инНИГОК

Рисунок 1. Иммунный ответ на ТН-2 антигены

12000

Рисунок 2. Число индуцированных НИГОК при введении ТЗ и ТН-2 совместно и порознь (1-5)

Примечание: 1 - ПВП, 2 - Фик, 3 - Декс, 4 - SШ, 5 - ВРАБЭ.

ногенным из 2-х использованных в паре ТН-2 антигенов.

Необходимо подчеркнуть, что совместное введение ТН-2 антигенов не влияло на образование специфических АОК: их количества оставались практически такими же, как при введении этих антигенов порознь, а иногда даже слегка увеличивались.

Полученные данные еще раз показали, что в поликлональную активацию В-лимфоцитов ТЗ и ТН-2 антигенами вовлекаются разные пулы В-лимфоцитов. При этом было очевидно, что под действием ТН-2 антигенов в такой ответ вовлекается ограниченная в размерах субпопуляция клеток. Для выяснения роли различных В-клеточных субпопуляций в индуцируемой ТН-2 антигенами поликлональной активации В-клеток были проведены опыты по разделению В-спленоцитов на фракции CD5- и CD5+ клеток и определению иммунного ответа в каждой из фракций.

Ранее в опытах с разделением спленоцитов на CD5+ В-1 и CD5- В-2 клетки на клеточном сорте-ре было показано, что в иммунном ответе на ПВП за появление и АОК и инНИГОК ответственны в основном CD5+ В-клетки [15]. В настоящей работе роль CD5+ и СD5- В, а также — В-2 и «В-1» клеток, полученных с помощью иммуномагнитной сепарации, исследовали при ответе на ПВП и Декс.

При иммунизации ПВП число АОК во фракциях CD5- и CD5+ спленоцитов (клетки, не связавшиеся с бусами, и клетки, выделенные из розеток, соответственно), составило 563 и 2420 на 106 спленоцитов, а число инНИГОК — 1778 и 4008 на 106 спленоцитов соответственно. Таким образом, за появление как АОК, так и НИГОК отвечали в основном CD5+ В-клетки, что согла-

суется с данными, полученными ранее другим способом.

При иммунизации Декс удаление из суспензии CD5+В-клеток понижало число АОК ~ на 25%. Количество АОК в CD5+ В-клеточной популяци и при этом превышало число АОК в CD5- популяции ~ в 2-3 раза, что свидетельствовало об обогащении CD5+ фракции продуцентами антител. Однако, в отличие от опытов с ПВП, значительного увеличения числа инНИГОК в этой фракции обнаружить не удалось.

На следующем этапе количества АОК и инНИГОК определяли непосредственно в субпопуляциях «В-1» и В-2. При иммунизации ПВП во фракции «В-1», содержались большие их количества (1066/106 и 27 92/106), чем во фракции В-2 (754/106 и 1251/106 соответственно), а при иммунизации Декс числа АОК во фракциях «В-1» и В-2 оказались близкими по значению (537/106 и 468/106 соответственно).

Поскольку числа АОК и ИГОК рассчитывались на 106 клеток, а количества В-лимфоцитов в субпопуляциях В-2 и «В-1» могли сильно различаться, для оценки реального содержания В-клеток во фракциях В-2 и «В-1» использовали метод проточной цитофлуориметрии. Было установлено, что в В-2 фракции содержится ~ в 6 раз больше В-кле-ток, чем во фракции «В-1». CD5+ В-клеток в В-2 фракциии было выявлено 1-2%, а в «В-1» фракции — 47% (последняя включает Т-лимфоциты, макрофаги и др.) (рис. 3). Это означает, что количества АОК и ИГОК, а следовательно, и инНИГОК в субпопуляциях «В-1» В-лимфоцитов примерно в 6-7 раз превышают таковые в В-2 субпопуляции.

Наличие в В-2 субпопуляции значительных количеств АОК и ИГОК, особенно выраженное

Рисунок 3. Содержание В-лимфоцитов во фракциях В-2 (а) и В-1 (б)

Примечание: область С - В-лимфоциты, экспрессирующие 1д (окрашивание ФИТЦ-Ат к 1д мыши).

при иммунизации Декс, привело к предположению о том, что за это ответственны MZ-B лимфоциты, которые при использовании для разделения клеток коммерческого набора попадают в В-2 фракцию. С целью проверки этого предположения из В-2 лимфоцитов методом иммуно-магнитной сепарации (на бусах, сенсибилизированных анти-CD23 антителами) удаляли В-2 клетки и определяли количества АОК и инНИГОК в исходной и обедненной CD23+ В-клетками (В-2 и MZ-B клетки, соответственно) фракциях. Согласно предварительным данным, при введении Декс основная масса АОК и инНИГОК принадлежала CD23- В-клеткам: в В-2 субпопуляции число АОК составило 5 95/106 и инНИГОК 3538/106, а для MZ — 1480/106 и 80 00/106, соответственно.

Разработка метода высвобождения клеток из розеток и установление роли «В-1» клеток в поликлональной активации при ответе на ТН-2 антигены позволили прямо определить количества инНИГОК, во фракциях «В-1» и В-2 клеток при одновременной иммунизации двумя ТН-2 антигенами. Полученные данные приведены на рис. 4. Видно, что несмотря на четкое увеличение числа инНИГОК в «В-1» фракциях при раздельном введении ТН-2, их совместное введение ни к какой суммации количества инНИГОК не приводит. Таким образом, данные, полученные на тотальной суспензии спленоцитов, получили полное подтверждение.

Обсуждение

Много лет назад Бойд и Бернард обнаружили, что при иммунизации белковыми антигенами по-мимообразованияантителнаблюдаетсяувеличение содержания иммуноглобулинов, не реагирующих с введенным антигеном и названных ими неспецифическими иммуноглобулинами (НИГ) [6]. Позднее было показано, что индукцию образования НИГ вызывают самые разные растворимые и корпускулярные ТЗ антигены (белки, эритроциты, вирусы), а также некоторые Т-независимые антигены (ЛПС, Уі-антиген) [1, 4, 10, 14].

Появление НИГ под действием ТЗ антигенов в основном обусловлено действием неспецифических стимулирующих факторов, образуемых стимулированными антигеном Т-лимфоцитами. Увеличение синтеза НИГ под действием ТН-2 антигенов, не реагирующих с Т-клетками и не обладающих митогенной активностью, до сих пор не объяснено.

Ранее появление индуцированных антигеном НИГ было выявлено при введении животным Уі-антигена сальмонеллы и ПВП [1]. В настоящей работе круг ТН-2 антигенов был расширен: в опытах использовали синтетический антиген — ПВП, полисахаридные антигены пневмококка и лейконостока и фиколл. Количества АОК и ИГОК в суспензиях спленоцитов определяли на 4-е сутки после иммунизации, т.е. на максиму-

3000

тотальные спленоциты

НИГОКПВП

НИГОК Декс

НИГОК ПВП+Декс

Рисунок 4. Число НИГОК, индуцированных ПВП и Декс, введенных порознь и совместно

ме иммунного ответа, и пересчитывали числа АОК и инНИГОК на 106 спленоцитов или В-клеток.

Внутривенное введение использованных ТН-2 антигенов, как и ожидалось, приводило не только к образованию АОК, но и к появлению инНИГОК, т.е. индуцировало и специфическую и неспецифическую (поликлональную) активацию В-клеток. Иммуногенность ТН-2 антигенов существенно ниже, чем ТЗ антигенов. Соответственно, и специфический (число АОК) и неспецифический (число инНИГОК) ответы на ТН-2 антигены были значительно ниже, чем на ТЗ антиген (см. рис. 2).

С ортодоксальной точки зрения, ТН-2 антигены, не связывающиеся с Toll-like 5 рецептором, лишены «внутренней» митогенной активности [7]. Следовательно, наблюдаемое в опытах увеличение числа клеток, синтезирующих НИГ, обусловлено какими-то другими, пока не установленными механизмами. Возможно, роль в этом играют неспецифические стимулирующие В-факторы (по аналогии с таковыми Т-клеток) [12]. Не исключена и роль стимулирующих факторов, продуцируемых другими клетками, в том числе — Т-клетками, активированными посторонними антигенами или же НК, макрофагами и дендритными клетками. Этот вопрос нуждается в дальнейшем исследовании.

Суммация количества инНИГОК, обнаруженная ранее при одновременном введении ТЗ и ТН-2 антигенов привела к предположению об участии в поликлональной активации, индуцируемой такими антигенами, разных субпопуляций В-лим-фоцитов. Косвенным образом это подтверждалось данными, полученными при одновременном введении двух ТН-2 антигенов: суммациия числа инНИГОК отсутствовала при любых комбинациях ТН-2 антигенов. При одновременном введении 2-х ТН-2 антигенов число инНИГОК обычно не превышало такового при ответе на наиболее иммуногенный из них. Объяснить эти данные наличием неспецифической супрессии, вызванной увеличением в 2 раза общей дозы ТН-2 антигенов вряд ли возможно, т.к. использованные дозы ТН-2 антигенов не являются супрессивными [2]. Кроме того, против неспецифической супрессии говорит отсутствие какого-либо угнетения специфического иммунного ответа. Как уже говорилось, количества АОК при совместном введении

2-х ТН-2 антигенов не только не снижались, но в некоторых случаях даже немного возрастали.

Отсутствие суммации числа инНИГОК при одновременном введении двух ТН-2 антигенов позволяет предположить, что эти антигены по-ликлонально активируют одну и ту же ограниченную в размере популяцию клеток. К таковым может относиться либо небольшая субпопуляция В-клеток, способных неспецифически активироваться к синтезу НИГ ТН-2 антигенами,

(например, клетки, находящиеся в определенной фазе клеточного цикла), либо ограниченная в размерах популяция клеток, продуцирующих факторы, неспецифически стимулирующие любые В-лимфоциты. Очевидно, что для выяснения механизма образования НИГ в ответ на ТН-2 антигены была необходима прямая фенотипическая характеристика клеток, ответственных за этот процесс.

Ранее для одного из ТН-2 — ПВП — было показано, что СD5+ В-1 клетки ответственны как за образование антител, так и за поликлональную стимуляцию [15]. Было интересно выяснить роль В-1 субпопуляции и в поликлональной активации, индуцируемой другим ТН-2 антигеном — Декс. При иммунизации Декс также, как и при введении ПВП, удаление CD5+ В-клеток приводило к снижению числа АОК на 25%. Напротив, число АОК в CD5+ В клеточной популяции превышало число АОК в группе CD5- В-клеток в 2-3 раза. Это указывало на доминирующую роль CD5+В-клеток в специфическом иммунном ответе на Декс. Однако, в отличие от опытов с ПВП, в случае Декс значительного увеличения количества инНИГОК в CD5+ фракции не обнаружилось.

Известно, что В-1-клетки подразделяются на В-1а (CD5+) и В-1Ь (CD5-) [5, 8]. Очевидно, что при изучении иммунного ответа на Декс и ПВП в CD5+ и CD5- субпопуляциях В-клеток мы не учитывали роли последней субпопуляции. Различие по маркеру CD43, одному из фенотипических маркеров, отличающих В-1 субпопуляцию от В-2 клеток [16], позволило разделить суспензию спленоцитов на «В-1» и В-2 субпопуляции. Как и ранее при иммунизации ПВП наибольшее увеличение АОК и инНИГОК наблюдалось во фракции «В-1». В случае Декс число инНИГОК было максимальным также в «В-1» фракции, однако количества АОК в группах В-1 и В-2 были близкими по значению. Так как используемый для разделения клеток набор не позволяет получить чистую В-1-клеточную субпопуляцию (после выделения она включает Т-лимфоциты, макрофаги и другие лейкоциты), состав обеих полученных фракций был проанализирован методом проточной цито-флуориметрии. Оказалось, что содержание В-кле-ток в В-2 фракции примерно в 7 раз выше, чем в «В-1» (91,2% и 13,9% соответственно). Это значит, что основными продуцентами и антител и индуцированных Декс НИГ являются, как и в случае с ПВП, В-1 лимфоциты. Полученные данные позволяют заключить что как специфический, так и поликлональный иммунный ответ на ПВП и Декс зависит главным образом от В-1-клеток.

Следует отметить, что ПВП и особенно Декс индуцируют образование АОК и инНИГОК и в В-2 субпопуляции. Можно было предположить, что их появление обусловлено присут-

ствием в В-2 фракции В-клеток маргинальной зоны селезенки (MZ-В). Для проверки этого предположения были проведены опыты по удалению из В-2 фракции CD23+ В-клеток (в основном В-2 клетки) [9, 11]. Это позволило получить В-клеточную популяцию, обогащенную MZ-В-клет-ками. Согласно предварительным данным, преобладающее число АОК и НИГОК было обнаружено именно в этой фракции.

Разработка метода высвобождения клеток из розеток позволила исследовать ответ на одновременное введение 2-х ТН-2 антигенов во фракциях «В-1» и В-2 лимфоцитов. Было установлено, что при совместной иммунизации мышей ПВП и Декс наибольшие количества АОК и инНИГОК выявляются именно в «В-1» фракции, однако, никакой суммации числа инНИГОК при этом не наблюдается. Полученные данные подтверждают результаты опытов на тотальных суспензиях спленоцитов и позволяют предполагать, что поликлональная активация В-1-клеток, индуцированная введением двух ТН-2, рестриктирована либо размерами способного к такой активации пула «посторонних» В-1/MZ-B-клеток, либо количеством неспецифических стимулирующих факторов, возникающих под влиянием ТН-2 антигенов.

Благодарности

Выражаем благодарность за помощь в оформлении статьи аспиранту лаборатории Дмитрию Александровичу Ходченкову.

Работа выполнена при поддержке РФФИ.

Список литературы

1. Агаджанян М.Г., Меграбян Т.Б., Сидорова Е.В. Нарастание числа клеток, секретирующих антитела и клеток, секретирующих неспецифические иммуноглобулины, при иммунизации мышей Т-зависимым и Т-независимым антигенами // Бюлл. эксперим. биол. мед. — 1981. — Т. 92. - С. 66-68.

2. Агаджанян М.Г., Смирнова И.Н.,Сидорова Е.В. Зависимость образования продуцентов анти-гензависимых неспецифических иммуноглобулинов от дозы Т-зависимого и Т-независимых антигенов // Бюлл. эксперим. биол. мед. — 1986. — Т. СП — № 8. — С. 206-208.

3. Сидорова Е.В. Что нам известно сегодня о В-клетках // Успехи современ. биологии. — 2006. — Т. 126. — № 3. — С. 227-242.

4. Bakay M., Biladi I., Berencsi K., Sidorova E., Agadzhanian M., Fachet F., Erdei J. Immuno-

enhancement and suppression induced by adenovirus in chicken // Acta Virol. — 1992. — ЛЫ. 36. — Р. 269-276.

5. Baumgarth N., Tung J.W, Herzenberg L.A. Inherent specificities in natural antibodies: a key to immune defense against pathogen invasion // Springer Semin. Immun. — 2005. — Vol. 26. — P. 347-362.

6. Boyd W.C., Bernard H. Quantitative changes in antibodies and y-globulin fraction in sera of rabbits injected with several antigens // J. Immunol. — 1937. — V. 33. — P. 111-122.

7. Chandrashekhar P., Medzhitov R. Control of B-cell responses by Toll-like receptors // Nature Letters — 2005. — Vol. 438. — P. 364-368.

8. Hardy R.R., Hayakawa K. B cell development pathways // Ann. Rev. Immunol. — 2001. — Vol. 19. — P. 595-621.

9. Martin F., Kearney J. B-cell subsets and the mature preimmune repertoire. Marginal zone and B1 cells as part of a «natural immune memory» // Immunol. Rev. — 2000. — Vol. 175. — P. 70-79.

10. Mond J.J, Lees A., Snapper C.M. T cell-independent antigens type 2 // Ann. Rev. Immunol. — 1995. — V. 13. — P. 655-692.

11. OliverA.M,Martin F.,GartlandG.L.,CarterR.H., Kearney J.F. Marginal zone B cells exhibit unique activation, proliferative and immunoglobulin secretory responses // Eur. J. Immunol. — 1997. — Vol. 27, N 7. — P. 2366-2374.

12. Pers J.O., Jamin C.,Youinou P., Charreire J. Role of IL-10 in the distribution of B cell subsets in the mouse B-1 cellpopulation // Eur. Cytokine Netw. — 2003. — Vol. 14, N 3 — P. 178-185.

13. Seman M., Mazie J.C., Bussard A.E. Antigenic properties of a water soluble fraction of sheep erythrocytes // Eur. J. Immunol. — 1972. — Vol. 4. — P. 387-388.

14. Sidorova E.V, Agadzhanian M.G., Mazhul L.A., Biladi I., Bakai M., Berenchi K. Immunosuppresson induced by respiratory viruses (influenza virus, adenovirus) in mice // Biull. Eksp. Biol. Med. — 1991. — Vol. 111. — P. 510-512.

15. Sidorova E.V., Li-Sheng Lu, Devlin B., Chernishova I., Gavrilova M. Role of different B-cell subsets in the specific and polyclonal immune response to T-independent antigens type 2 // Immunol. Letts. — 2003. — Vol. 88. — P. 37-42.

16. Wells S.M., Kantor A.B., Stall A.M. CD43(S7) expression identifies peripheral B cell subsets // J. Immunol. — 1994. — Vol. 153, N 12. — P. 55035515.

поступила в редакцию 11.01.2007 принята к печати 16.01.2007