CC BY
94
Медицинская Иммунология 2008, Т. 10, № 1, стр. 51-58 © 2008, СПб РО РААКИ
Оригинальные статьи
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ В-КЛЕТОК мыши. РОЛЬ МИКРООКРУЖЕНИЯ
Дьяков И.Н., Григорьев И.В., Сидорова Е.В., Чернышова И.Н.
ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, лаборатория биосинтеза иммуноглобулинов, Москва
Резюме. Для исследования влияния микроокружения на функциональную активность В-лимфоцитов использовали модель адоптивного переноса клеток мышей CBA конгенным мышам CBA/N, не имеющим CD5+ В-1 клеток, и модель кокультивирования спленоцитов мышей CBA/N с клетками селезенки или перитонеальной полости мышей СВА. Об активности В-лимфоцитов судили по числу IgM-продуцентов и клеток, образующих антитела к Т-независимому антигену 2-го типа — поливинил-пирролидону. За распределением введенных клеток следили, определяя количество клеток, окрашенных витальным красителем CDFA-SE, в селезенке и брюшной полости реципиентов. Внутривенный перенос спленоцитов CBA приводил к значительному (в 3-4 раза) увеличению числа иммуноглобулин-продуцентов в селезенке xid-реципиентов, достигавшему уровня, характерного для мышей СВА. Перенос CBA/N мышам xid-клеток увеличения количества иммуноглобулин-продуцентов не вызывал. Это свидетельствует о том, что увеличение количества IgM-продуцентов в селезенке реципиентов обусловлено клетками донора, предположительно, CD5+ В-1 лимфоцитами. Вместе с тем восстановить у xid-мышей иммунный ответ на поливинилпирролидон не удалось.В брюшной полости интактных мышей (и CBA, и CBA/N) продуценты иммуноглобулина не выявлялись. Внутрибрюшинный перенос СВА спленоцитов к появлению иммуноглобулин-продуцентов в брюшной полости реципиентов также не приводил. Это означает, что микроокружение брюшной полости тормозит активность В-лимфоцитов. В то же время внутривенное введение «молчащих» перитонеальных клеток мышей CBA мышам CBA/N, приводило к значительному возрастанию числа IgM-продуцентов в селезенке реципиента, т.е. в другом микроокружении работа перитонеальных В-клеток «разрешалась». Данные опытов in vivo согласуются с результатами, полученными in vitro. Добавление к спленоцитам CBA/N 10-50% спленоцитов или перитонеальных клеток мышей СВА приводило к резкому повышению числа IgM-продуцентов в культурах. Полученные данные свидетельствуют об определяющей роли микроокружения в функциональной активности В-лимфоцитов мыши.
Ключевые слова: В-лимфоциты, локальное микроокружение, иммуноглобулины.
Dyakov I.N., Grigoriev I.V., Sidorova E.V., Chernyshova I.N.
FUNCTIONAL ACTIVITY OF MURINE B CELL: A ROLE OF MICROENVIRONMENT
Abstract. To study influence of microenvironment upon functional activity of B cells, we used experimental models of adoptive cell transfer from CBA to congenic CBA/N mice lacking CD5+ B-1 cells, and cocultivation of CBA/N splenocytes with spleen, or peritoneal CBA cells. B cell activity was determined as numbers of IgM-producing cells, and as amounts of cells producing antibodies to a T-independent antigen type 2 (polyvinylpirrolidone). In vivo distribution of transferred cells was determined as the numbers of cells stained with a vital dye (CDFA-SE) in spleen and peritoneum of recipients. Intravenous injection of CBA splenocytes resulted into a significant (3- to 4-fold) increase in numbers of IgM-producing cells in the spleens of xid-recipients, where their levels reached those of CBA mice. Intravenous injection of CBA/N splenocytes into
xid-mice did not induce any increase of IgM-producers
^ in their spleen. That means that increased number
Адрес для переписки: *
Дьяков Илья Николаевич of IgM-producers in recipient spleen is due to donor
115088, Москва, ул. 1-я Дубровская, 15. cells, presumably, CD5+ B-1 lymphocytes.
Тел.: 8 (495) 674-08-42. restoration of immune response to polyvinylpirrolidone
Факс: 8 (495) 674-57-10. in xid-mice following transfer of CBA splenocytes was
E-mail: [email protected] not successful. IgM-producing cells were undetectable
51
Дьяков И.Н. и др.
Медицинская Иммунология
in peritoneum of intact mice (both CBA and CBA/N). Intraperitoneal transfer of CBA splenocytes also did not induce their accumulation. It could mean that peritoneal microenvironment inhibits B cell activity. Meanwhile, intravenous injection of «silent» peritoneal cells into CBA/N mice brought about great increase of IgM-producers in recipient spleen, i.e., the «job» of B cells was permitted in other microenvironment. The results yielded in vivo are in agreement with data of in vitro experiments. Addition of CBA splenocytes or peritoneal cells (10-50%) to CBA/N splenocytes induced sharp increase of IgM-producing cells in the cultures. The data obtained provide evidence for a decisive role of microenvironment in functional activity of murine B lymphocytes. (Med. Immunol., 2008, vol. 10, N1, pp 51-58)
Введение
В лимфоциты подразделяют на 4 основные субпопуляции — В-1а, В-lb, MZ-B и В-2. Основными местами локализации В-клеток у мыши являются костный мозг, селезенка, лимфоузлы и брюшная полость. В селезенке доминируют В-2 клетки; основная масса перитонеальных В-клеток представлена В-1 лимфоцитами [22]. Между селезенкой и брюшной полостью происходит обмен В клетками, хотя он, по-видимому, невелик [13].
Несмотря на то, что в селезенке В-1а клетки представляют минорную субпопуляцию (2-5% от общего числа В-лимфоцитов), их абсолютное количество сходно с таковым В-1а клеток в брюшной полости [9, 10].Считается, что около 50% нормальных IgM мыши могут продуцироваться В-1 лимфоциты брюшной полости. Вместе с тем данные о наличии иммуноглобулинобразующих клеток (ИГОК) в брюшной полости противоречивы [4, 12, 17].
Свойства В-клеток, локализованных в разных органах, неодинаковы. Внимание большинства исследователей до последнего времени было направлено на изучение механизмов дифференци-ровки В-клеток, определение фенотипических маркеров и выяснение потенциальной способности В-лимфоцитов, принадлежащих к разным субпопуляциям, восстанавливать иммунореактивность организма [2, 16, 21]. Поведение и активность В-лимфоцитов, находящихся в разном микроокружении, остаются в тени.
Особый интерес в этом отношении представляют В-1а клетки, являющиеся продуцентами нормальных IgM [1]. Ранее было показано, что внутривенный перенос xid-мышам спленоцитов или клеток брюшной полости конгенных животных восстанавливает субпопуляцию CD5+ В-1 клеток и иммунореактивность xid-животных [6, 8, 18].
Задачей настоящей работы является выяснение того, как меняется реактивность В-лимфоцитов, ^держащих и не содержащих CD5+ В-1 клеток, под влиянием микроокружения. Для этого использовали 2 подхода. В опытах in vivo использовали модель адоптивного переноса клеток селезенки и брюшной полости мышей CBA (содержат CD5+ В-1а клетки) мышам конгенной линии CBA/N, не имеющим В-1а клеток. В опытах in vitro клетки селезенки или брюшной полости
мышей CBA культивировали со спленоцитами мышей CBA/N. О функциональной активности В-лимфоцитов судили, определяя с помощью ELISPOT количество IgM-ИГОК и число клеток, образующих антитела (АОК) к Т-независимому антигену 2-го типа — поливинилпирролидону (ПВП). Полученные данные свидетельствуют об определяющей роли микроокружения в деятельности В-лимфоцитов.
Материалы и методы
Животные, антигены, иммунизация. В опытах использовали мышей СВА, самок 16-18 г весом, полученных из питомника «Столбовая» (Москва, Россия). CBA/N мыши были получены из вивария ГУ ЦНИИ туберкулеза РАМН и размножены в виварии Института вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова. В качестве Т-независимого антигена 2-го типа (ТН-2 антиген) использовали поливинилпирролидон (ПВП) с молекулярной массой 350 kDa. Мышей иммунизировали 2 мкг ПВП внутривенно в подглазничный синус. Селезенку брали на 4-й день после иммунизации.
Получение клеточных суспензий и адоптивный перенос. Моноклеточную суспензию спленоцитов получали, гомогенизируя селезенку в среде RPMI 1640. Эритроциты удаляли осмотическим шоком. Перитонеальные клетки получали, вымывая содержимое брюшной полости 10 мл среды RPMI 1640. Клетки отмывали средой и определяли их число в камере Горяева. В опытах по адоптивному переносу мышам внутривенно (в подглазничный синус) вводили по 15 х 106 спленоцитов или по 3 х 106 клеток перитонеальной полости в 150 мкл среды; внутрибрюшинно переносили по 5 х 106 спленоцитов или по 3 х 106 клеток перитонеальной полости в 200 мкл среды.
Витальное окрашивание клеток CFDA-SE. Для окрашивания клеток использовали витальный флуоресцентный краситель CFDA-SE (Invitrogen). Суспензию клеток 50 х 106 млн/мл в фосфатносолевом буфере, содержащем 0,1% бычьего сывороточного альбумина, смешивали 1:1 с рабочим раствором красителя (40 мкМ) и инкубировали 10 мин при +37°С рабочий раствор CFDA-SE готовили непосредственно перед использованием из 2мМ сток раствора в диметилсульфоксиде, хранящегося при —20°С. Окрашивание останавливали, добавляя холодную среду с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Затем клетки
52
2008, Т. 10, № 1
Активность В-клеток разной локализации
3,0
2,5 -
2,0 -
1,5 -
g 1,0 -
0,5
0,0
1 сутки
4 сутки
8 сутки
■ % окрашенных клеток от общего числа клеток селезенки
■ % окрашенных клеток от общего числа клеток брюшной полости
Рисунок 1. Распределение спленоцитов CBA, окрашенных CFDA-SE, после внутривенного введения мышам CBA/N
60 50
0
1 40 I 30
3 го
ё 20
sO
o'"-
10 0
■ % окрашенных клеток от общего числа клеток селезенки
■ % окрашенных клеток от общего числа клеток брюшной полости
Рисунок 2. Распределение спленоцитов CBA, окрашенных CFDA-SE, после внутрибрюшинного введения мышам CBA/N
1 сутки 4 сутки 8 сутки
дважды отмывали средой без ЭТС, подсчитывали и вводили мышам. Число окрашенных клеток в селезенке и брюшной полости реципиентов определяли после фиксации 1% раствором параформальдегида в 0,9% растворе NaCl с помощью проточного цитофлуориметра (Beckman Coulter EPICS XL). Результаты обрабатывали с помощью программы SYSTEM II (Beckman Coulter).
Культивирование клеток. Клетки селезенки или перитонеальной полости мышей CBA или CBA/N (1 х 106/ лунку) культивировали в 96-лу-ночных плашках (Nunc) в 200 мкл полной среды с добавлением 10% фетальной сыворотки в СО2-инкубаторе в течение 4 дней. По окончании инкубации клетки собирали, отмывали и в моноклеточной суспензии определяли число ИГОК с помощью ELISPOT
Клеточный иммуноферментный анализ (ELISPOT). Для выявления антителообразующих клеток (АОК) и IgM-ИГОК использовали нитроцеллюлозные планшеты (Millipore), сенсибилизированные ПВП (для выявления АОК) или козьими антителами к иммуноглобулинам (ИГ) мыши (Sigma, USA) (для выявления ИГОК). На сенсибилизированные и отмытые фосфатносолевым буфером нитроцеллюлозные диски наносили клетки селезенки или брюшной полости мышей (по 100 х 103 для определения АОК и по 10 х 103 для определения ИГОК) и культивировали их при 37°С в среде RPMI-1640 с 1% ЭТС в течение 18-24 часов в CO2-инкубаторе. По окончании инкубации клетки удаляли, диски отмывали, добавляли усиливающую кроличью антисыворотку к IgM мыши, пероксидазный конъюгат антител к IgG кролика и субстратный буфер, содержащий 1,4-хлорнафтол, и H2O2. Реакцию останавливали дистиллированной водой. После высушивания фильтров число образовавшихся
окрашенных комплексов (плаков) подсчитывали под микроскопом и пересчитывали на 106 клеток.
Результаты
Функциональная активность спленоцитов мышей CBA, введенных мышам CBA/N внутривенно или внутрибрюшинно
Для проведения опытов по адоптивному переносу, прежде всего, следовало проследить за распределением переносимых мышам клеток. Для этого были получены спленоциты, окрашенные CFDA-SE, и проверена их способность к продукции IgM. Было установлено, что окрашенные клетки сохраняют не менее 80-85% своей функциональной активности.
Спленоциты, окрашенные CFDA-SE, вводили внутривенно (по 15 х 106 клеток) или внутрибрюшинно (по 5 х 106 клеток); окрашенные перитонеальные клетки вводили внутривенно (по 3 млн). Процент окрашенных клеток в селезенке и перитонеальной полости определяли на различные сроки после переноса. Полученные данные представлены на рисунках 1 и 2. Из них видно, что при внутривенном введении в селезенке CBA/N реципиентов, содержащей около 40 х 106 клеток, на 1-е сутки обнаруживалось 2,8%, на 4-е сутки — 2,1% и на 8-е — 1,8% окрашенных клеток от числа всех клеток селезенки. В пересчете на абсолютные количества соответственные величины равнялись 1,12 х 106, 0,84 х 106 и 0,72 х 106 окрашенных клеток, что составляло 7,5%, 5,6% и 4,8% от числа введенных спленоцитов. В перитонеальной полости при этом обнаруживалось не более 0,8% от общего числа клеток, или 0,04% от числа введенных окрашенных спленоцитов.
При внутрибрюшинном введении окрашенных спленоцитов наоборот, значительная часть
53
Дьяков И.Н. и др.
Медицинская Иммунология
спленоциты CBA
Рисунок 3. Число ИГОК в селезенке мышей CBA, CBA/N и CBA/N на 4 сутки после внутривенного переноса спленоцитов CBA
окрашенных клеток выявлялась в перитонеальной полости: до 50% от числа всех клеток на 1-е сутки, 20% на 4-е и ~ 5% — на 8-е. В пересчете на абсолютные количества это составляло 1 х 106, 0,4 х 106 и 0,1 х 106 клеток, или 20%, 8% и 2% от числа введенных клеток, соответственно. При этом в селезенке и на 1-е, и на 4-е сутки число окрашенных клеток было незначительным (не более 0,15% от общего числа клеток).
На 4-е сутки после внутривенного переноса окрашенных CFDA-SE перитонеальных клеток в селезенке обнаруживалось 70-85 х 103 окрашенных клеток, т.е. ~ 0,15% от числа всех клеток, или 2,5% от числа введенных окрашенных клеток. В брюшной полости выявлялось 2 х 103 окрашенных клеток, т.е. ~ 0,4% от числа введенных окрашенных клеток.
Полученные данные позволяли перейти к модельным опытам по переносу клеток CBA мышей xid-мышам CBA/N. При адоптивном переносе мышам CBA/N внутривенно вводили 15 х 106 спленоцитов мышей CBA, содержащих 2700 IgM-ИГОК на 106 клеток, т.е. всего ~ 40 х 103 ИГОК, и на 4 сутки определяли число IgM-ИГОК в селезенке реципиентов. Исходное количество IgM-ИГОК в селезенке CBA/N мышей составляло в среднем 550 на 106 клеток. На 4 сутки после внутривенного переноса CBA спленоцитов число IgM-ИГОК у реципиентов увеличивалось до 2400 IgM-ИГОК на 106 клеток, т.е. доходило примерно до уровня, характерного для мышей CBA (рис. 3).
Чтобы выяснить обусловлено ли это возрастание перенесенными клетками СВА, или оно происходит в результате «запуска» лимфоцитов реципиента самой процедурой переноса, CBA и CBA/N мышам внутривенно вводили спленоциты или перитонеальные клетки мышей CBA/N и на 4-е сутки определяли количества IgM-ИГОК в селезенках реципиентов. Перенос клеток xid-
мышей сколько-нибудь заметного увеличения числа IgM-ИГОК ни в одном случае не вызвал. Это говорит о том, что сама по себе процедура переноса клеток к «запуску» В-лимфоцитов реципиента не приводит, и, следовательно, наблюдаемый при внутривенном переносе клеток CBA прирост числа IgM-ИГОК в селезенке xid-мышей обусловлен клетками доноров.
В следующей серии опытов определяли, сохраняют ли В-клетки селезенки способность продуцировать IgM в другом микроокружении — при переносе их в брюшную полость. Мышам СВА/N вводили внутрибрюшинно по 5 х 106 окрашенных CFDA-SE спленоцитов СВА, содержащих 17,5 х 103 IgM-ИГОК, и на разные сроки определяли число IgM-ИГОК в брюшной полости реципиентов. Уже на первые сутки после переноса число ИГОК в брюшной полости составило не более 200 на 106 клеток, а на четвертые сутки выявить там ИГОК вообще не удалось. В селезенке достоверного изменения числа ИГОК при внутрибрюшинном введении спленоцитов не наблюдалось.
Функциональная активность клеток брюшной полости мышей CBA, введенных мышам CBA/N внутривенно или внутрибрюшинно
Известно, что внутривенный перенос перитонеальных клеток нормальных мышей xid-мышам восстанавливает иммунологическую реактивность последних [6, 18]. Было интересно выяснить, как изменяется поведение перитонеальных В-лимфоцитов при их адоптивном переносе в селезенку и брюшную полость xid-мышей. В первую очередь следовало определить количество IgM-ИГОК в перитонеальной полости мышей СВА. Однако многократные попытки выявить такие IgM-продуценты как в норме, так и после иммунизации ПВП оказались безуспешными.
Вместе с тем внутривенный перенос 3 х 106 «молчащих» перитонеальных клеток мышей CBA xid-мышам приводил к значительному увеличению на 4 сутки числа IgM-ИГОК в селезенке реципиентов (рис. 4.). Так, исходное количество IgM-ИГОК в селезенке мышей СВА/N составляло в среднем 735 на 106 спленоцитов. На 1-е и 2-е сутки после переноса 3 х 106 перитонеальных клеток достоверного увеличения числа IgM-ИГОК в селезенке реципиентов не наблюдалось. Однако на 3-и сутки оно повышалось до 1500 на 106 спленоцитов, а на 4-е достигало максимальных значений (в среднем 3325 на 106 спленоцитов) и сохранялось на этом уровне в течение 2-х недель (время наблюдения). Таким образом, «молчащие» в перитонеальной полости В-клетки СВА при попадании в селезенку мышей CBA/N активировались к синтезу и секреции IgM. При внутрибрюшинном переносе клеток перитонеальной полости CBA мышей xid-мышам появления ИГОК в брюшной полости не наблюдалось (увеличения числа ИГОК в селезенке реципиентов также не было).
54
2008, Т. 10, № 1
Активность В-клеток разной локализации
ТАБЛИЦА 1. ОБРАЗОВАНИЕ IgM-ИГОК ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ СПЛЕНОЦИТОВ МЫШЕИ CBAСО СПЛЕНОЦИТАМИ XID-МЫШЕЙ CBA/N
Спленоциты CBA/N, % Спленоциты CBA, % Предполагаемое число ИГОК/106 клеток* Полученное число ИГОК/106 клеток
100 - - 100
98 2 213 291
95 5 383 534
90 10 665 2095
50 50 2925 6150
- 100 - 5750
Примечание: * - предполагаемые числа ИГОК получены суммацией чисел ИГОК в клетках селезенки CBA и CBA/N мышей, внесенных в культуры.
Иммунный ответ на ПВП
Определение числа IgM-ИГОК в селезенке xid-мышей показало, что оно значительно ниже, чем у конгенных мышей CBA. Известно также, что CBA/N мыши не отвечают на ТН-2 антигены [15]. Поскольку внутривенный перенос CBA/N мышам нормальных клеток селезенки или брюшной полости мышей CBA восстанавливал количество ИГОК в селезенке до «нормального» уровня, представлялось интересным выяснить, приобретают ли при этом xid-реципиенты способность отвечать на ТН-2 антиген. Для этого определяли иммунный ответ на ПВП у мышей CBA, CBA/N и CBA/N после внутривенного переноса им спленоцитов или клеток брюшной полости мышей СВА.
Реципиентов иммунизировали ПВП одновременно с переносом клеток или спустя неделю. Число АОК в селезенке определяли на 4 сутки после введения антигена. В качестве контроля использовали нормальных и иммунизированных мышей CBA и CBA/N. Иммунизация ПВП мышей СВА приводила к увеличению числа АОК в 2-2,5 раза (с 248 АОК на 106 спленоцитов в норме до 632 АОК на 106 спленоцитов на 4-е сутки после иммунизации). Число АОК к ПВП у неиммунизированных мышей СВА/N не превышало в среднем 35 на 106 клеток селезенки. После внутривенного введения 15 х 106 спленоцитов мышей СВА оно возрастало до 180-220, а после переноса 3 х 106 перитонеальных клеток — даже до 300-350 АОК на 106 спле-ноцитов. Таким образом, внутривенное введение CBA/N мышам клеток СВА приводило не только к увеличению общего числа ИГОК, но и повышало количество фоновых АОК на ПВП. Однако иммунизация реципиентов ПВП достоверного увеличения числа АОК в селезенке не вызвала, т.е. способность к ответу на ТН-2 антиген в описанной постановке опыта не восстановилась.
Образование IgM-продуцентов при совместной инкубации клеток СВА и CBA/N in vitro
Определение числа окрашенных клеток в селезенке и брюшной полости реципиентов показало, что при внутривенном введении в этих органах выявляется относительно небольшая часть переносимых клеток. Это затрудняет оценку
их функциональной активности. Чтобы исключить влияние миграции клеток было решено использовать систему культивирования лимфоцитов in vitro.
Спленоциты или перитонеальные клетки мышей CBA культивировали в разных соотношениях со спленоцитами мышей CBA/N и на 4-е сутки определяли количества IgM-продуцентов методом ELISPOT. В ряде опытов к культурам добавляли ПВП и определяли кроме ИГОК также и количества АОК. Полученные данные представлены в таблицах 1 и 2.
Приведенные данные свидетельствуют о том, что культивируемые В-лимфоциты селезенки сохраняют in vitro свою функциональную активность, а перитонеальные клетки, перенесенные в культуру, приобретают способность к продукции и секреции IgM. Таким образом, как и в опытах in vivo, перенос перитонеальных клеток СВА в другие условия, приводит к их «растормажива-нию». Внесение в культуру, состоящую в основном из спленоцитов CBA/N, даже незначительных количеств клеток СВА (как селезеночных,
перитонеальные клетки CBA
Рисунок 4. Число ИГОК в селезенке мышей CBA, CBA/N и cBa/N на 4 день после внутрибрюшинного переноса перитонеальных клеток свА
55
Дьяков И.Н. и др.
Медицинская Иммунология
ТАБЛИЦА 2. ОБРАЗОВАНИЕ IgM-ИГОК ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ КЛЕТОК МЫШЕИ CBA
со спленоцитами мышей CBA/N
Спленоциты CBA/N, % Перитонеальные клетки CBA, % Предполагаемое число ИГОК/106 клеток* Полученное число ИГОК/106 клеток
100 - - 80
95 5 154 617
90 10 229 1283
80 20 378 1483
50 50 825 2425
- 100 - 1569
Примечание: * - предполагаемые числа ИГОК получены суммацией чисел ИГОК в клетках CBA и CBA/N мышей, внесенных в культуры.
так и перитонеальных) приводило к увеличению числа IgM-ИГОК, превышающему предполагавшиеся значения. Это говорит о том, что в культуре имеет место активация/пролиферация В-лимфоцитов.
Как и в опытах с адоптивным переносом, выявить образование АОК к ПВП в смешанных культурах клеток не удалось.
Обсуждение
Ряд данных свидетельствует о различии свойств В-клеток в зависимости от локализации [13, 20]. Однако сравнительное поведение В-клеток селезенки и брюшной полости при их внутривенном и внутрибрюшинном введении изучено недостаточно. Представлялось интересным сравнить функциональную активность В-лимфоцитов селезенки и перитонеальной полости мышей кон-генных линий CBA и CBA/N в гомологичном и гетерологичном окружении.
CBA/N мыши дефектны по гену Бруттон-тирозин киназы (Btk), в связи с чем у них нарушено созревание В-клеток, отсутствуют CD5+ В-1а лимфоциты и резко снижено содержание нормальных IgM в крови [7, 9]. Такие мыши не отвечают на ТН-2 антигены. Внутривенное введение xid-мышам клеток селезенки или брюшной полости нормальных мышей в значительной степени устраняет эти дефекты [6, 8, 18]. Это позволяет использовать модель адоптивного переноса клеток мышей CBA мышам CBA/N и vice versa для изучения роли микроокружения в функциональной активности В-клеток, содержащих и не содержащих CD5+ B лимфоциты. В настоящей работе было исследовано влияние микроокружения селезенки и брюшной полости мышей CBA/N на способность В-лимфоцитов мышей СВА продуцировать IgM.
Изучение распределения клеток селезенки, окрашенных витальным красителем CFDA-SE, показало, что при внутривенном введении в селезенке обнаруживается больше окрашенных клеток, чем в перитонеальной полости, а при внутрибрюшинном — наоборот. На четвертые сутки после внутривенного переноса, в селезенке
выявлялось 5,6% от числа введенных окрашенных клеток (0,84 х 106 клеток на орган), а в брюшной полости — не более 0,04%. На 4-е сутки после внутрибрюшинного переноса, напротив, в брюшной полости оставалось ~8% от числа введенных клеток (0,4 х 106 клеток на орган), а в селезенке — 1,2%. По-видимому, основная часть переносимых клеток мигрирует в другие органы, либо погибает. Действительно, было показано, что при переносе лимфоцитов взрослым нормальным мышам, большая часть введенных клеток погибает вскоре после переноса [5].
Внутривенный перенос 15 млн спленоцитов СВА, содержавших 2700 ИГОК на 106 клеток, т.е. всего 40 х 103 ИГОК, приводил к возрастанию их числа в селезенке CBA/N реципиентов на четвертые сутки с 550 на 106 до 2400 на 106.
Согласно данным по переносу окрашенных спленоцитов, на 4-е сутки в селезенке мышей CBA/N выявляется 2,1% окрашенных клеток или 5,6% от числа введенных. В пересчете на вносимое количество ИГОК (40 х 103) это составляет 2240 ИГОК на селезенку. В то же время реальное возрастание числа ИГОК в селезенках реципиентов достигало ~ 80 х 103. Резкое повышение количества ИГОК может объясняться как активацией клеток донора, так и активацией клеток реципиента процедурой переноса или внесением клетками СВА каких-то отсутствующих в селезенке мышей CBA/N факторов. Однако внутривенный перенос мышам CBA и CBA/N лимфоцитов мышей CBA/N увеличения числа ИГОК в селезенке реципиентов не вызывал. Это свидетельствует о том, что сама процедура переноса клеток не активирует спленоциты реципиента. Прирост числа ИГОК в селезенке мышей CBA/N, после переноса им клеток СВА, обусловлен функциональной активностью клеток донора.
Интересно было установить, что происходит при внутривенном переносе клеток из другого микроокружения, а именно из брюшной полости. Несмотря на наличие в последней значительного количества В-клеток, нам, как и ряду других авторов [4, 11, 14] выявить среди них IgM-ИГОК не удалось. Отсутствие ИГОК в брюшной полости
56
2008, Т. 10, № 1
Активность В-клеток разной локализации
могло быть обусловлено как особенностями самих перитонеальных В-лимфоцитов, так и влиянием локального микроокружения. Известно, например, что макрофаги брюшной полости выделяют простагландин Е2, угнетающий В-лимфоциты [3]. Можно было предположить, что «освободившись» от угнетающего микроокружения брюшной полости В клетки начнут функционировать и продуцировать ИГ. Для проверки этого предположения были проведены опыты по внутривенному переносу перитонеальных клеток. При внутривенном введении 3 млн перитонеальных клеток СВА мышам CBA/N в селезенке последних наблюдалось постепенное возрастание числа IgM-ИГОК, достигающее на 3-4-е сутки «нормальных» величин, практически не отличающихся от таковых в селезенке мышей СВА (см. рис. 4). Это означает, что В клетки, «молчащие» в брюшной полости, в микроокружении селезенки приобретают способность к размножению и синтезу и секреции ИГ.
Как показали опыты с введением окрашенных перитонеальных клеток, процент последних в селезенке xid-реципиентов был весьма низок, составляя не более 0,15% всех клеток селезенки, или ~ 80 х 103 клеток на орган. Это свидетельствует о крайне высокой функциональной активности перенесенных перитонеальных клеток, в несколько раз превышающей таковую СВА спленоцитов. Возможно, это связано с большим содержанием в брюшной полости CD5+В-клеток. Ранее на восстановление иммунореактивности мышей BALB.xid после переноса им перитонеальных клеток мышей BALB/c, указывал Riggs et al. [18].
Возник вопрос, сохранят ли спленоциты способность к образованию и секреции ИГ при помещении их в брюшную полость. Для проверки этого предположения клетки селезенки мышей СВА (5 х 106), содержащие 3500 ИГОК на 106 клеток, переносили в брюшную полость мышей СВА/N. Через сутки перенесенные спленоциты составляли в брюшной полости около 50% от общего числа клеток, а через 4 дня — около 20%. Теоретически это позволяло выявить в перитонеальных клетках реципиентов не менее 1750 и 700 ИГОК на 106 клеток, соответственно. Однако в действительности, даже на 1-е сутки удалось выявить лишь около 200 ИГОК на 106 клеток (вместо ожидаемых 1750); на 4-е же сутки обнаружить ИГОК вообще не удалось. Таким образом, не только перитонеальные клетки (ни В-2, ни В-1) не секре-тируют ИГ, но и спленоциты, помещенные в перитонеальное микроокружение, перестают это делать. Альтернативному предположению о том, что В клетки после переноса чрезвычайно быстро «уходят» из брюшной полости противоречат данные о наличии в ней значительных количеств перенесенных окрашенных спленоцитов. Таким образом, отсутствие ИГОК в брюшной полости
мышей, по-видимому, обусловлено тормозящим влиянием перитонеального окружения.
При адоптивном переносе введенные клетки в организме мигрируют, что осложняет интерпретацию результатов. Система совместного культивирования клеток селезенки мышей CBA/N с клетками селезенки и брюшной полости мышей СВА позволяет исследовать активность нормальных В-клеток в окружении, в значительной степени имитирующем селезенку и перитонеальную полость. Проведенные опыты по кокультивиро-ванию нормальных спленоцитов и перитонеальных клеток СВА со спленоцитами CBA/N показали (в соответствии с данными опытов in vivo), что перенос клеток из брюшной полости в питательную среду приводит к «растормаживанию» В-клеток и появлению в культуре IgM-ИГОК, и что совместная инкубация нормальных клеток СВА со спленоцитами CBA/N приводит к увеличению числа IgM-ИГОК в культурах (см. таблицы 1 и 2). Необходимо отметить, что это увеличение превышает предполагаемые величины, рассчитанные на основании данных о количествах ИГОК в культурах спленоцитов СВА и CBA/N и культурах перитонеальных клеток, что свидетельствует об активации В-лимфоцитов. Особенно выражена активация при совместной культивации спленоцитов CBA/N и перитонеальных клеток СВА.
Полученные данные не позволяют определить, какие В-клетки активируются в смешанных культурах. Возможно, что и В-клетки СВА, и В-клетки CBA/N. Для выяснения этого следует использовать отдельные субпопуляции В-лимфоцитов селезенки и перитонеальной полости и раздельное культивирование клеток в двухкамерных плашках.
Ранее было установлено, что основной популяцией В-клеток, отвечающих на ПВП , являются CD5^-1 лимфоциты [19, 22]. В настоящей работе внутривенный перенос CBA/N мышам нормальных лимфоцитов СВА приводил к возрастанию числа «фоновых» АОК к ПВП в селезенке реципиентов, однако, специфического иммунного ответа на ПВП не восстанавливал.
Полученные данные отличаются от результатов Riggs et al., выявивших ответ репопулирован-ных нормальными В-клетками мышей BALB.xid на ДНФ-фиколл [18]. Эти различия могут быть связаны: 1) с использованием в опытах разных линий мышей, 2) с использованием разных ТН-2 антигенов и, наконец, 3) с различными способами выявления иммунного ответа.
В целом полученные данные свидетельствуют о том, что использованные нами модели адоптивного переноса и система культивирования лимфоцитов in vitro позволяет исследовать функциональную активность В-лимфоцитов различной локализации. Показано, что ведущую роль в деятельности В-клеток играет микроокружение. Микроокружение селезенки и брюшной полости
57
Дьяков И.Н. и др.
Медицинская Иммунология
влияет на функциональную активность В-клеток противоположным образом. В селезенке «разрешается» деятельность не только спленоцитов, но и клеток брюшной полости, а в брюшной полости деятельность и тех и других «запрещается». Очевидно, что необходимы дальнейшие исследования с использованием чистых субпопуляций В-1 и В-2 клеток.
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований.
Список литературы
1. Baumgarth N., Tung J.W, Herzenberg L.A. Inherent specificities in natural antibodies: a key to immune defense against pathogen invasion // Springer Semin. Immunopathol. — 2005. — ЛЫ. 26, N 4. - P. 347-62.
2. Berland R., Wortis H.H. Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5 // Annu. Rev. Immunol. - 2002. - Vol. 20. - P. 253-300.
3. Chace J.H., Fleming A.L., Gordon J.A., Perandones C.E., Cowdery J.S. Regulation of differentiation of peritoneal B-1a (CD5+) B cells. Activated peritoneal macrophages release prostaglandin E2, which inhibits IgM secretion by peritoneal B-1a cells // J. Immunol. - 1995. -Vol. 154, N 11. - P. 5630-5636.
4. Fagarasan S., Watanabe N., Honjo T. Generation, expansion, migration and activation of mouse B1 cells // Immunol. Rev. - 2000. - Vol. 176. -P. 205-215.
5. Gaudin E., Rosado M., Agenes F., McLean A., Freitas A.A. B-cell homeostasis, competition, resources, and positive selection by self-antigens // Immunol. Rev. - 2004. - Vol. 197. - P. 102-115.
6. Hayakawa K., Hardy R.R., Stall A.M., Herzenberg L.A., Herzenberg L.A. Immunoglobulinbearing B cells reconstitute and maintain the murine Ly-1 B cell lineage // Eur. J. Immunol. - 1986. -Vol. 16, N 10. - P. 1313-1316.
7. Herzenberg L.A. B-1 cells: the lineage question revisited // Immunol. Rev. - 2000. - Vol. 175. -P. 9-22.
8. Julius P. Jr., Kaga M., Palmer Y, Vyas V, Prior L., Delice D., Riggs J. Recipient age determines the success of intraperitoneal transplantation of peritoneal cavity B cells // Immunology. - 1997. - ЛЫ. 91, N 3. - P. 383-390.
9. Kantor A.B., Herzenberg L.A. Origin of murine B cell lineages // Annu. Rev. Immunol. - 1993. -Vol. 11. - P. 501-538.
10. Kantor A.B., Stall A.M., Adams S., Herzenberg L.A., Herzenberg L.A. Differential development of progenitor activity for three B-cell lineages // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1992. - Vol. 89. -P. 3320-3324.
11. Kawahara T., Ohdan H., Zhao G., Yang Y.G., Sykes M. Peritoneal cavity B cells are precursors of splenic IgM natural antibody-producing cells //
J. Immunol. - 2003. - Vol. 171, N 10. -P. 5406-5414.
12. Klinman D.M., Holmes K.L. Differences in the repertoire expressed by peritoneal and splenic Ly-1 (CD5)+ B cells // J. Immunol. - 1990. -Vol. 144, N 12. - P. 4520-4525.
13. Kretschmer K., Jungebloud A., Stopkowicz J., Stoermann B., Hoffmann R., Weiss S. Antibody repertoire and gene expression profile: Implications for different developmental and functional traits of splenic and peritoneal B-1 lymphocytes // J. Immunol. - 2003. - Vol. 171. - P. 1192-1201.
14. McIntyre T.M., Holmes K.L., Steinberg A.D., Kastner D.L. CD5+ peritoneal B cells express high levels of membrane, but not secretory, C mu mRNA // J. Immunol. - 1991. - Vol. 146, N 10. -P. 3639-3645.
15. Mond J.J., Vos Q., Lees A., Snapper C.M. T cell independent antigens // Curr. Opin. Immunol. -1995. - Vol. 7, N 3. - P. 349-354.
16. Montecino-Rodriguez E., Leathers H., Dorsh-kind K. Identification of a B-1 B cell-specified progenitor // Nat. Immunol. - 2006. - Vol. 7, N 3. -P. 293-301.
17. Murakami M., Tsubata T, Shinkura R., Nisi-tani S., Okamoto M., Yoshioka H., Usui T., Miyawaki S., Honjo T. Oral administration of lipopolysaccharides activates B-1 cells in the peritoneal cavity and lamina propria of the gut and induces autoimmune symptoms in an autoantibody transgenic mouse // J. Exp. Med. -1994. - Vol. 180, N 1. - P. 111-121.
18. Prior L., Pierson S., Woodland R.T., Riggs J. Rapid restoration of B-cell function in XID mice by intravenous transfer of peritoneal cavity B cells // Immunology. - 1994. - Vol. 83, N 2. - P. 180-183.
19. Sidorova E.V, Li-Sheng L., Devlin B., Chernishova I., Gavrilova M. Role of different B-cell subsets in the specific and polyclonal immune response to T-independent antigens type 2 // Immunol. Lett. -2003. - Vol. 88, N 1. - P. 37-42.
20. Tumang J.R., Hastings WD., Bai C., Rothstein TL. Peritoneal and splenic B-1 cells are separable by phenotypic, functional, and transcriptomic characteristics // Eur. J. Immunol. - 2004. - ЛЫ. 34, N 8. - P. 2158-2167.
21. Tung J.W, Herzenberg L.A. Unraveling B-1 progenitors // Curr. Opin. Immunol. - 2007. - Vol. 19, N 2. - P. 150-155.
22. Whitmore A.C., Haughton G., Arnold L.W Phenotype of B cells responding to the thymus-independent type-2 antigen polyvinylpyrrolidinone // Int. Immunol. - 1996. - Vol. 8, N 4. - P. 533-542.
23. Сидорова Е.В. Что нам известно сегодня о В-клетках // Успехи современной биологии. -2006. - № 3. - С. 227-241.
поступила в редакцию 27.07.2007 принята к печати 15.09.2007
58
