CC BY
14
3 С ТА Т ТI 3
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА МЕДИЦИНА
УДК: 616.98:57.083.3
РОЛЬ ПОЛ1МОРФ1ЗМУ ТОЬЬ-ПОДГБНОГО РЕЦЕПТОРА 4 Л8Р2990ЬУ У РОЗВИТКУ БАКТЕР1АЛЬНИХ 1НФЕКЦ1Й, ЩО ПЕРЕДАЮТЬСЯ СТАТЕВИМ ШЛЯХОМ
1змайлова О. В., Шликова О. А., Боброва Н.О., Кайдашев I. П.
НД1 генетичних та iмунологiчних основ розвитку патологи та фармакогенетики
Вищого державного навчального закладу УкраТни «УкраТнська медична стоматолопчна академiя»
Целью этого исследования был анализ ассоциации между полиморфизмом гена То11-подобного рецептора 4 Л^р299О1у и бактериальными инфекциями, передающимися половым путем, а также изучение распространенности данного полиморфизма среди практически здоровых людей полтавской популяции. В группу здоровых пациентов вошли 299 мужчин и женщин, проживающих в Полтавской области и 156 больных с диагностированной урогенитальной инфекцией. Была установлена высокая частота встречаемости аллеля О и генотипов ЛО и ОО среди пациентов с бактериальными инфекциями, передающимися половым путем, в сравнении с практически здоровыми людьми полтавской популяции. Полученные результаты подтверждают важную роль То11-подобных рецепторов в реализации врожденного иммунного ответа и позволяют рассматривать полиморфизм гена То11-подобного рецептора 4 Л^р299О1у в качестве дополнительного прогностического показателя в генетических исследованиях.
Ключевые слова: врожденный иммунитет, полиморфизм, передающиеся половым путем.
Вступ
1мунолопчний захист проти рiзних патогешв здшс-нюеться в результат скоординованоТ роботи вродже-ноТ (неспецифiчноТ) i адаптивноТ (специфiчноТ) систем iмунiтету, взаeмодiя яких забезпечуе ефективне про-ткання iмунноТ вщповд Актива^я вродженого iмунi-тету являеться першим i обов'язковим етапом розвитку адаптивного iмунiтету [6].
Ефекторн мехаызми вродженого iмунiтету вивчен достатньо добре, тодi як першi етапи взаемодiТ з патогенами i активацiя запалення стали зрозумтими лише в останнi роки в результат вiдкриття молекуля-рних структур розтзнавання рiзних типiв мiкроорганi-змiв [5]. Розпiзнавання чужорiдних для оргаызму мо-лекулярних структур мiкробного походження вiдомих як патогенасоцiйованi молекулярн паттерни (pathogen associated molecular patterns - PAMPs) здшсню-еться за допомогою так званих паттернрозтзнаваю-чих рецепторiв (ПРР) [2]. Прикладом PAMPs якi, як правило, е загальними для певного класу патогеыв, i
То!!-подобные рецепторы, бактериальные инфекции,
як е необх1дними для забезпечення життед1яльност1 м1кроорган1зм1в, а тому не пщлягають серйозним му-тац1йним змшам, що можуть бути летальними для мкроба, служать л1попол1сахариди (ЛПС) грамнегати-вних бактер1й, пептидогл1кани грампозитивних мкро-орган1зм1в, флагелл1н, в1русна двохсп1ральна РНК, зимозан, л1потейхоева кислота, Р-б1лок респ1раторно-синцит1ального в1русу, а також ДНК, багата на Оро!уО-посл1довност1 та ¡н. [5].
В результат! структурних дослщжень до групи пат-тернрозтзнаваючих рецептор1в були в1днесен1 I То!!-под|бн1 рецептори (TLRs). У людини То!!-под1бн1 реце-птори являють собою амейство молекул, яке нал1чуе 13 ¡ндивщуальних рецептор1в (на даний час добре охарактеризован! 11 ¡з них), як здатн1 розп1знавати практично вс1 основн1 типи патоген1в, у тому числ1 I р1зн1 типи бактерш, в1руси, гриби, найпрост1ш1 та пара-зити [4].
Широкий спектр л1ганд1в То!!-под1бних рецептор1в I експрес1я цих рецепторю на багатьох кп1тинах сприя-
ють залученню Toll-подiбних рецепторiв у патогенез iмуноопосередкованих захворювань людини [2].
На сьогодшшшй день роль Toll-подiбних рецепто-рiв у розвитку багатьох шфекцм залишаеться не з'ясованою i потребуе детального вивчення. Дефекти в системi Toll-подiбних рецепторiв, такi, як порушення розпiзнавання лiгандiв, експресií ТЬР, трансдукци сигналу, синтез ефекторних молекул, а також полiмор-фiзм гешв Toll-подiбних рецепторiв можуть призводи-ти до розвитку важких шфекцшних, аутоiмунних захворювань, атеросклерозу, алергопатологií тощо [2]. Одним iз найбiльш вивчених варiантiв полiморфiзму генiв Toll-подiбних рецепторiв е полiморфiзм гена TLR4 абр299о1у, який тiсно пов'язують iз розвитком гематогенного остеомiелiту i системного кандидозу, бтьш важким перебiгом атопiчних захворювань, хворобою Крона, виразковим колком [11, 12, 17].
У зв'язку з цим, актуальним е вивчення поширено-ст полiморфiзму гена TLR4 абр299о1у у практично здорових оаб полтавськоí популяцií та у хворих iз бактерiальними iнфекцiя, що передаються статевим шляхом (хламiдiоз, уреаплазмоз, гарднерелльоз, мь коплазмоз, трихомонiаз) для уточнення патогенетич-них механiзмiв урогенiтальних захворювань та пок-ращення якостi молекулярно'1' дiагностики iмунодефi-цитних станiв, пов'язаних iз порушеннями функцюна-льно' активност Toll-подiбного рецептора 4 (реестра-цшний номер ОепВапк и88880).
Матерiали та методи
У дослщження було включено 299 практично здорових чоловшв та жЫок, жителiв Полтавсько' област та 156 хворих iз дiагностованою методом полiмераз-но' ланцюгово' реакцп (ПЛР) урогенiтальною Ыфекць ею (хламщюз (п=16), уреаплазмоз (п=102), мкоплаз-моз (п=4), гарднерельоз (п=9), трихомонiаз (п=2), на-явнiсть декiлькох iнфекцiй (п=23)).
Усi жителi полтавського регiону пройшли детальне обстеження на кафедрi внутршшх хвороб iз доглядом за хворими Вищого державного навчального закладу Укра'ни «Укра'нська медична стоматологiчна акаде-мiя» iз визначенням даних соцiально-побутового, професшно-еколопчного, генетичного, епщемюлопч-ного, вакцинального, алерголопчного, терапевтично-
Розподл частот генотипе i алелей гена То11-пос
го, xipypri4Horo та кшматичного aHaMHe3iB, також даних ключного стану на час огляду i об'eктивнi данi 3i сторони рiзних органiв та систем.
Матерiалом для дослiдження слугувала перифе-рiйна кров, а також 3^Kpi6 епiтелiальних клiтин i3 уре-три i цервiкального каналу, який отримували за допо-могою спецiальних одноразових стерильних урогень тальних зондiв. ДНК збудника видтяли з використан-ням системи пробопщготовки «ДНК-экспресс» (НПФ «Литех», Москва).
Полiморфнy дiлянкy Asp299Gly гена Toll-подiбного рецептора 4 амплiфiкyвали за допомогою методу ПЛР на амплiфiкаторi «Терцик» («ДНК-Технология», Москва) з використанням специфiчних олiгонyклеотидних праймерiв TLR4:
5'-GATTAGCATACTTAGACTACTACCTCCATG-3' та 5' -GATCAAC TTC TGAAAAAG CATTCCCAC-3' за такою програмою: денатyрацiя 94 °С, 30 сек, 52 °С, 1 хв, 72 °С 1 хв, 1 цикл; 30 цикшв: 94 °С, 30 сек, 55 °С, 30 сек, 72 °С 30 сек; заключний цикл - 72 °С 5 хв. Зберiгання - 10 °С.
Полiморфний варiант iдентифiкyвали за допомогою подальшого рестрикцiйного аналiзy з використанням ендонуклеази рестрикци Nco I (НВО «Сибензим», Новосибiрськ). В резyльтатi рестрикцií були отриман фрагменти розмiром 263 bp та 222 bp. Продукти роз-щеплення полiморфноí дiлянки гену TLR4 (Asp299Gly) виявляли за допомогою електрофорезу в 3% агароз-ному гелi («Helikon», Москва) в 1 х ТВЕ (50 мМ трис-Н3ВО3 та 2 мМ ЕДТА, рН 8,0) протягом 2 годин при напрyзi 2V на 1 см гелю. Гель забарвлювали етидiy-мом бромщом з подальшою вiзyалiзацieю резyльтатiв в УФ-св^лк
Результати дослiдження були оброблен статисти-чно за допомогою критерю х2 i визначенням достовiр-ност точним критерieм Фiшера [2].
Результати та Тх обговорення
Данi про частоту полiморфiзмy Asp299Gly гена Toll-подiбного рецептора 4 серед осiб полтавсько''' попyляцií та у пацieнтiв iз бактерiальною iнфекцieю, що передаеться статевим шляхом, наведен в таблицi 1.
Таблиця 1
рецептора 4 серед oci6 ПолтавськоТ популяцТ та хворих з урогештальною нфекц^ею, % (n)
Генотип, алель Жителi полтавського регюну, n=299 Хворi з урогеытальною Ыфега^ею, n=156
АА 87,29 (261) 79,49 (124)
AG 10,71 (32) 15,38 (24)
GG 2,0 (6) 5,13* (8)
A 92,65 87,18
G 7,35 12,82*
* р<0,05 у порiвняннi з групою ос/'б полтавського регюну
Як видно iз таблиц 1 «дикий тип» генотипу зустрь чався у 87,29% полтавсько' популяцп та у 79,49% хворих з урогештальною Ыфега^ею. Частота генотипу АО серед оаб полтавсько' популяци i серед оаб з дiагностованою урогенiтальною iнфекцiею склала 10,71% та 15,38% вiдповiдно. Гомозиготний генотип за мутантним алелем зустрiчався у 2,00% полтавсько' популяцií та 5,13% хворих на бактерiальнi Ыфекцп, що передаються статевим шляхом.
Отриман результати вказують на важливу роль генотипу в розвитку захворювань, викликаних бакте-рiальною iнфекцiею, оскiльки виявлена висока частота алелю О та генотитв АО i ОО серед па^ен^в iз бактерiальною Ыфега^ею, що передаеться статевим шляхом, у порiвняннi з практично здоровим особами полтавсько! популяцií.
Таблиця 2
Порвняльний аналiз розподлу частот 3ycmpÎ4aeMocmi алелей i геноти^в гену Toll-подiбного рецептора 4 (Asp299Gly) в популя^ях европео)Ыв, %
Генотип, алель Полтавчани (n=299) 1спанц [3] (n=155) Бельпйц [1] (n=139) Угорц [2] (n=140)
АА 261 (87,29) 135 (87,1) 126 (90,6) 127 (90,7)
AG 32 (10,71) 20 (12,9) 12 (8,6) 12 (8,6)
GG 6 (2,0) 0 (0,0) 1 (0,8) 1 (0,7)
A 92,65 93,5 95,0 95,0
G 7,35 6,5 5,0 5,0
Як видно i3 представлених у таблиц 2 даних, по-пуляци характеризуются незначною рiзницею у роз-повсюдженостi алелей. Аналiзуючи розподiл алелей А та G, можна вщммтити схожiсть полтавсько1 популя-цп з iншими популяцiями европео^в.
Враховуючи важливу роль Toll-подiбних рецепто-рiв в реалiзацiï вроджено' iмунноï вiдповiдi, логiчно припустити, що дефекти на рiвнi самих рецепторiв, на рiвнi рiзних компонентiв, що приймають участь у пе-редачi сигналу, а також факторiв, якi регулюють |'х функцiю, можуть призводити до розвитку шфекцшних та запальних захворювань. Саме тому значна кть-гасть зарубiжних наукових дослiджень останнiх рогав була спрямована на розкриття ролi функцiонального полiморфiзму в генах, що кодують Toll-подiбнi рецеп-тори, як пов'язанi з пiдвищеною чи зниженою сприй-нятливiстю до рiзноманiтних шфекцмних захворювань. Полiморфiзм Toll-подiбних рецепторiв може призводити до порушень розтзнавання iнфекцiйних агентiв i дисбалансу функцюнування системи вродженого iмунiтету, що в результат буде проявлятися пщвищенням чутливостi до iнфекцiй та розвитком хрошчних запальних захворювань [7].
Серед вщомих на сьогоднiшнiй день PAMP най-бiльш повно охарактеризована саме взаeмодiя ЛПС iз рецепторним комплексом Toll-подiбного рецептора 4. TLR4 е первинним клiтинним сенсором бактерiально-го ЛПС i ключовим медiатором iмунноï вiдповiдi на грамнегативнi бактерiï [4]. Експонований на штиншй мембранi TLR4 розтзнае ЛПС та взаемодiе з шшими молекулами рiзного походження, у тому чи^ i рос-линного. TLR4 може також розтзнавати протипухлин-ний препарат таксол i F-бток рестраторно-синцитiального вiрусу, HSP60 хламщш, HSP70, HSP90, бiлки мiкобактерiй, фiбронектин, гiалуронову кислоту, р-дефенсин-2 та Ы. [10]. Для розпiзнавання ЛПС TLR4 формуе високоафшний рецепторний комплекс за участю акцесорних молекул CD14 i MD2. ЛПС взаемодiе з ЛПС-звязуючим бтком сироватки, LBP i утворений комплекс розтзнаеться CD14-рецептором, який експресований на моноцитах пери-фершно! кровi та макрофагах. У комплекс з CD14 ЛПС зближуеться з TLR4 на поверхн кгмтини, а для iндукцiï ефективноï запально! вiдповiдi необхiдне його додаткове зв'язування iз декретованим бiлком MD2 [3,13].
Аналiз структури гена TLR4 виявив два однонук-леотидних полiморфiзми у позаштинних доменах, якi забезпечують розтзнавання ЛПС, що були пов'язанi зi змiною функцiï вiдповiдi на ЛПС [16]. Описан випа-дки вщсутност у людини нормальноï чутливостi до ЛПС, що проявляеться зниженням ЛПС-залежно1 продукци лейкоцитами 1Л-1 ß, при наявност амЫокис-лотноï замiни у послщовност TLR4 Asp299Gly [14].
Генетично обумовлене зниження вщпов^ на ЛПС призводить до вибiркового порушення захисних реак-цiй органiзму проти грамнегативних бактерш, що ви-значае схильнють до бiльш важкого протiкання Ыфек-цiйного захворювання [5].
В рядi дослiджень встановлена асоцiацiя однонук-леотидного полiморфiзму Asp299Gly гену TLR4 iз розвитком гематогенного остеомiелiту i системного кан-дидозу, з бтьш важким протiканням атопiчних захворювань, хворобою Крона, виразковим колком [11, 12, 17]. Проведен окремими вченими дослщження показали, що носи полiморфiзму гена TLR4 Asp299Gly були бтьш схильними до розвитку септичного шоку, меншгококового меншпту i грамнегативноТ iнфекцiТ.
Також Toll-подiбний рецептор 4 в^грае важливу роль i у розтзнаванш грампозитивних мiкроорганiз-мiв. Встановлено, що тLR4-мутантнi мишi особливо схильн до сепсису, що викликаний пневмолiзиноут-ворюючим S. Pneumonia [4].
Таким чином, зважаючи на отриманi результати можна зробити припущення, що наявнють алелю G асоцiюеться зi схильнютю до розвитку поширених урогенiтальних шфекцш, таких як хламiдiоз, уреапла-змоз, мкоплазмоз, бактерiальний вагiноз, трихомонь аз. Це не суперечить лтературним даним, яга вказу-ють на значний вплив полiморфiзму Asp299Gly гена Toll-подiбного рецептора на характер розвитку Ыфек-цiйноТ патологiТ, особливо при захворюваннях, викли-каних грамнегативними мiкроорганiзмами, що можна пояснити враховуючи ключову роль TLR4 у розтзнаванш та розвитку запальноТ вщповд на ЛПС [5].
Висновки
1. Серед здорових жителiв полтавського регiону i хворих iз бактерiальними iнфекцiями, що передають-ся статевим шляхом переважае алель А гену Toll-подiбного рецептора 4 (92,645% i 87,18% вщповщно) та генотип АА (87,29% i 79,49%).
2. Бiльша частота алелю G серед хворих з уроге-ытальною iнфекцiею можливо е прогностично не-сприятливою ознакою щодо розвитку i перебiгу захворювань, викликаних бактерiальною iнфекцiею, яка передаеться статевим шляхом.
Лiтература
1. Полиморфизм рецептора ангиотензина II 1-го типа у больных эссенциальной гипертензией в украинской популяции / И. П. Кайдашев, М. С. Расин, Л. Г. Савченко [и др.] // Цитология и генетика. - 2005. - № 5. - С. 51-55.
2. Рецепторы врожденного иммунитета: подходы к количественной и функциональной оценке Toll-подобных рецепторов человека / Л. В. Ковальчук, М. В. Хорева, А. С. Варивода [и др.] // Иммунопатология и клиническая иммунология. - 2008. - № 4. - С.223-227.
3. Роль Toll-подобных рецепторов в регуляции иммуного ответа в норме и при патологи / Н. Я. Спивак, И. М. Бог-
данова, Н. И. Мартиросова [и др.] // Фiзiологiчний журнал. - 2008. - Т. 54, № 6. - С. 87-99.
4. Роль и биологическое значение Толл-подобных рецепторов в антиинфекционной резистентности организма /
A. Л. Байракова, Е. А. Воропаева, С. С. Афанасьев [и др.] // Вестн. Рос. АМН. - 2008. - № 1. - С. 45-54.
5. Симбирцев А. С. Толл-белки: специфические рецепторы неспецифического иммунитета / А. С. Симбирцев // Иммунология. - 2005. - № 6. - С. 368-377.
6. Сухих Г. Т. Иммунология беременности / Г. Т. Сухих, Л.
B. Ванько. - М. : Издательство РАМН, 2003. - 400 с.
7. Толстопятова М. А. Роль рецепторов врожденного иммунитета в развитии инфекционной патологии у новорожденных детей / М. А. Толстопятова, Г. А. Буслаева, И. Г. Козлов // Педиатрия. - 2009. - Т. 87, № 1. - С.115-120.
8. Хаитов Р.М. Роль паттернраспознающих рецепторов во врожденном и адаптивном иммунитете / Р. М. Хаитов, М. В. Пащенков, Б. В. Пинегин // Иммунология. - 2009. -№ 1. - С. 66-76.
9. Хилл Б.А. Основы медицинской статистики / Б. А. Хилл ; пер. с англ. - М. : Медгиз, 1958. - 306 с.
10. Яглова Н.В. Тучные клетки и врожденный иммунитет / Н. В. Яглова // Иммунология. - 2009. - № 2. - С.139-143.
11. Candida-specific IFN-gamma deficiency and toll-like receptor polymorphisms in patients with chronic mucocutaneous candidiasis / C. A. Van der Graaf, M. G. Netea, S. A. Morre
[et al.] // J. Eur. Cytokine Netw. - 2006. - Vol. 17 (1). - P. 29.
12. Deficient host-bacteria interactions in inflammatory bowel disease? The toll-like receptor (TLR)-4 Asp299Gly polymorphism is associated with Crohn's disease and ulcerative colitis / D. Franchimont, S. Vermeire, H. Housni [et al.] // Gut. - 2004. - Vol. 53 (7). - P. 978-992.
13. Fitzgerald K. A. Endotoxin recognition and signal transduction by the TLR4/MD2-complex / K. A. Fitzgerald, D. C. Rowe, D. T. Grolenbock // Microbes Infection. - 2004. -Vol. 6 (15). - P.1361-1367.
14. Identification of two major sites in the type I interleukin-1 receptorcytoplasmic region responsible for coupling to pro-inflammatory signaling pathways / J. Slack, K. Schooley, T. Bonnert [et al.] // J. Biol. Chem. - 2000. - Vol. 275. - P. 4670-4678.
15. Lack of genetic association of the Toll-like receptor 4 (TLR4) Asp299Gly and Thr399Ile polymorphisms with spondylarthropathies in a Hungarian population / P. Gergely, Jr. A. Blazsek, Z. Weiszha [et al.] // Rheumatology. - 2006. - Vol. 45 (10). - P. 1194-1196.
16. Phylogenetic variation and polymorphism at the toll-like receptor 4 locus (TLR4) / I. Smirnova, A. Poltorak, E. Chan [et al.] // Genome Biol. - 2000. - Vol. 1. - P. 2-9.
17. The tlr4 (tlr4 Asp299Gly) polymorphism is a risk factor for gram-negative and haematogenous osteomyelitis / A. H. Montes, V. Asensi, V. Alvarez [et al.] // J. Clin. Exp. Immunol. - 2006. - Vol. 143 (3). - P. 404-413.
Summary
THE ROLE OF POLYMORPHISM OF TOLL-LIKE RECEPTOR 4 ASP299GLY IN DEVELOPMENT OF A BACTERIAL INFECTIONS, SEXUALLY TRANSMITTED DISEASES Izmaylova O. V., Shlykova O. A., Bobrova N. A., Kaidashev I.P.
Key words: congenital immunity, polymorphism, Toll-like receptor, bacterial infections, sexually transmitted diseases
The purpose of this study was to analyze the association between gene of Toll-like receptor 4 Asp299Gly polymorphism and bacterial infections, sexually transmitted diseases, as well as study the prevalence of this polymorphism among healthy people of the Poltava population. The group of healthy patients included 299 men and women living in the Poltava region, and 156 patients diagnosed of urogenital infection. It established the high frequency of allele G and the AG and GG genotypes among patients with bacterial infections, sexually transmitted infections, compared with practically healthy people of the Poltava population. These results confirm the important role of Toll-like receptors in the realization of the innate immune response and allow for consideration of gene Toll-like receptor 4 Asp299Gly polymorphism as an additional prognostic indicator in genetic research. Ukrainian Ministry of Health Public Service, Ukrainian Medical Stomatological Academy
Mamepian nadiumoB do pedaKqit 16.12.09
УДК 616-056-002-092.9:615
ВПЛИВ ФУЛЕРЕН1В НА РОЗВИТОК АЛЕРГ1ЧНОГО ЗАПАЛЕННЯ В ЕКСПЕРИМЕНТ1
Куценко Н.Л., Микитюк М.В., Боброва Н.О., Кайдашев 1.П. Науково-дослщний шститут генетичних та 1мунолопчних основ розвитку патологи та фармакогенетики Вищого державного навчального закладу Украши «Украшська медична стоматолопчна академ1я», м. Полтава
Исследовано влияние фуллерена С60 (¥С60) и модифицированого фуллерена (1,2 метанофуллерен С60)-61 карбок-силацида на развитие аллергического воспаления на модели бронхиальной астмы. Экспериментальная модель бронхиальной астмы была воспроизведена на мышах линии Ва1Ь/с, путем внутрибрюшинной сенсибилизации с последующей ингаляцией 1% раствором овальбумина. Животным с бронхиальной астмой внутрибрюшинно вводили водную дисперсию FC60, водную дисперсию FC60 в смеси с овальбумином, водный раствор модифицированного фуллерена и коньюгированного с овальбумином. Исследования показали, что введение животным разных форм фуллеренов С60 приводило к снижению интенсивности аллергического воспаления. Наблюдался терапевтический эффект как для фуллерена, коньюгированного с овальбумином, так и не коньюгированного.
Ключевые слова: фуллерены, бронхиальная астма, овальбумин, аллергическое воспаление.
