Научная статья на тему 'Роль оксида азота в регуляции Са2+-зависимой к+-проницаемости мембраны эритроцитов человека'

Роль оксида азота в регуляции Са2+-зависимой к+-проницаемости мембраны эритроцитов человека Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
455
122
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ОКСИД АЗОТА / ЭРИТРОЦИТЫ / СА2+-АКТИВИРУЕМЫЕ К+-КАНАЛЫ / CA2+-ACTIVATED K+-CHANNELS / NITRIC OXIDE / ERYTHROCYTES

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Петрова Ирина Викторовна, Трубачева Оксана Александровна, Гусакова Светлана Валерьевна

Изучено влияние оксида азота на Са2+-зависимую К+-проницаемость мембраны эритроцитов человека. Исследования проводились с помощью метода регистрации мембранного потенциала в суспензии эритроцитов по изменениям рН среды инкубации в присутствии протонофора. Активность Са2+-активируемых калиевых каналов оценивалась по амплитуде гиперполяризационного ответа и скорости его развития. Обнаружено, что донор оксида азота нитропруссид натрия оказывает необычное действие на Са2+-активируемые калиевые каналы эритроцитов, возможно, из-за развития некоторых побочных эффектов. Предуктор NO L-аргинин увеличивает Са2+-зависимую К+-проницаемость мембраны эритроцитов. К такому же эффекту приводит и увеличение внутриклеточной концентрации цГМФ с помощью дибутирил-цГМФ или ингибиторов фосфодиэстеразы.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Петрова Ирина Викторовна, Трубачева Оксана Александровна, Гусакова Светлана Валерьевна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Nitric oxide performs multiple functions in the human body. Specifically, NO affects the stability of hypotonic red blood cells, regulates the transfer of oxygen, affects the deformability of red blood cells, as well as programmed death of erythrocytes. Erythrocyte membrane contains Ca2 +-activated K+channels of intermediate conductance, or the Gardos-channels, which play a role in death of erythrocytes. They may participate in deformability of cells: Ca2+-induced decrease in the deformability of red blood cells eliminated by aligning the gradient of potassium ions. Question of the participation of nitric oxide in the regulation of Ca2+-activated K+-channels of erythrocytes remains unsolved. In the present study, we investigated the effect of nitric oxide on Ca2+-dependent K+-permeability of the membrane of human erythrocytes. The studies were conducted using the method of recording the membrane potential in erythrocyte suspensions by changing the pH of the incubation medium in the presence of the protonophore. Adding the calcium ionophore A23187 to a suspension of cells containing calcium chloride led to potassium ions issue and the development of hyperpolarizing response of the membrane of red blood cells, which is reflected in the change of pH of the suspension. The activity of Ca2+-activated potassium channels was estimated by the amplitude of the hyperpolarizing response and the speed of its development. Data analysis was performed using the program Statistica 6.0 for Windows of Statsoft Company. The formed sample does not obey the normal distribution; so nonparametric tests were used for testing statistical hypotheses. Adding of red blood cells 10-8 to 10-6 M sodium nitroprusside (NP) to the incubation medium did not cause any changes in the amplitude of hyperpolarizing response of red blood cells. Increasing concentrations of NP in the incubation medium of erythrocytes to 10-5 M resulted in a significant decrease in the amplitude of hyperpolarizing response. Further increase in the concentration of sodium nitroprusside in the incubation medium to 10-4 10-3 M led to complete suppression of hyperpolarizing response of red blood cells. Perhaps the effects obtained are due to decomposition of NP with fragments of electron-transport chain present in the membrane of red blood cells and the inhibitory effect of cyanide ion. Incubation of erythrocyte with L-arginine (10-5 M) caused a significant increase in the amplitude and velocity of hyperpolarizing response of red blood cells. Inhibition of NO-synthase with L-NMMA (Sigma) (24 10-5 M) significantly reduced the amplitude of the hyperpolarizing response. Thus, the experiments revealed that intracellular NO production by L-arginine increased the Ca2+-dependent potassium permeability of erythrocyte membranes. The same effect is obtained by increasing the intracellular concentration of cGMP by dibutyryl-cGMP or phosphodiesterase inhibitors.

Текст научной работы на тему «Роль оксида азота в регуляции Са2+-зависимой к+-проницаемости мембраны эритроцитов человека»

УДК 612.111:612.126.31:577.352.4:546:172.6

И.В. Петрова, О.А. Трубачева, С.В. Гусакова

РОЛЬ ОКСИДА АЗОТА В РЕГУЛЯЦИИ Са2+-ЗАВИСИМОЙ К+-ПРОНИЦАЕМОСТИ МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП (проект № П445).

Изучено влияние оксида азота на Са2+-зависимую К+-проницаемость мембраны эритроцитов человека. Исследования проводились с помощью метода регистрации мембранного потенциала в суспензии эритроцитов по изменениям рН среды инкубации в присутствии протонофора. Активность Са2+-активируемых калиевых каналов оценивалась по амплитуде гиперполяризацион-ного ответа и скорости его развития. Обнаружено, что донор оксида азота нитропруссид натрия оказывает необычное действие на Са2+-активируемые калиевые каналы эритроцитов, возможно, из-за развития некоторых побочных эффектов. Предуктор N0 Ь-аргинин увеличивает Са2+-зависимую К+-проницаемость мембраны эритроцитов. К такому же эффекту приводит и увеличение внутриклеточной концентрации цГМФ с помощью дибутирил-цГМФ или ингибиторов фосфодиэстеразы.

Ключевые слова: оксид азота; эритроциты; Са2+-активируемые К+-каналы.

Широко известна роль оксида азота как эндогенного вазодилататора, нейротрансмиттера, агента, участвующего в иммунном ответе. Кроме этого, оксид азота влияет на гипотоническую устойчивость эритроцитов, регулирует перенос ими кислорода [1, 2], воздействует на деформируемость красных клеток крови [3], а также на эриптоз - программируемую гибель эритроцитов [4].

Мембрана эритроцитов содержит Са2+-акти-

вируемые К+-каналы средней проводимости, или ОаМоБ-каналы, которые играют определенную роль в эриптозе [5]. Не исключено их участие в деформируемости клеток: Са2-индуцируемое снижение деформируемости эритроцитов устраняется при выравнивании градиента ионов калия [6].

Вопрос об участии оксида азота в регуляции Са2+-активируемых К+-каналов эритроцитов остается открытым. Не исключено, что эффекты оксида азота, связанные с деформируемостью эритроцитов или продолжительностью их жизни, опосредованы его влиянием на Са2-зависимую К+-проницаемость мембраны красных клеток крови.

Целью настоящего исследования явилось изучение вклада оксида азота в регуляцию Са2+-зависимой К+-проницаемости мембраны эритроцитов здоровых доноров.

Материалы и методы исследования

В работе использовалась кровь 27 практически здоровых добровольцев в возрасте от 20 до 45 лет обоего пола.

Кровь забиралась из локтевой вены утром натощак в пробирки с гепарином (25 ед/мл крови). После центрифугирования (1000g, 5 мин, 4°С) плазму и клетки белой крови удаляли, а эритроциты дважды промывали 3 частями изоосмотического раствора №С1 (150 мМ), содержащего 5 мМ №-фосфатный буфер (рН 7,4), при тех же условиях центрифугирования.

Для исследования Са2-активируемых калиевых каналов был применен метод регистрации мембранного потенциала в суспензии эритроцитов по изменениям рН среды инкубации в присутствии протонофора, основанный на том, что в этих условиях распределение протонов зависит от мембранного потенциала [7]. Эксперименты проводились по следующему плану. Для получения гиперполяризационного ответа к 4,75 мл среды инкубации (среда №), содержащей 150 мМ №С1,

1 мМ KCl, 1мМ MgCl2, 10 мМ глюкозы и 10 мкМ СаС12, добавляли 0,25 мл упакованных эритроцитов. Через 5 мин инкубации при 37°С и постоянном перемешивании добавляли протонофор карбонилцианид-m-хлорфенилгидразон (С1-ССР Sigma) до конечной концентрации 20 мкМ и спустя 2 мин - 0,5 мкМ Са2+-ионофора А23187 (Sigma). Добавление кальциевого ионофора А23187 к суспензии клеток, содержащей хлорид кальция, приводило к выходу ионов калия и развитию гиперполяризационного ответа мембраны эритроцитов, что находило свое отражение в изменении рН суспензии.

Защелачивание среды инкубации соответствовало гиперполяризации мембраны, а восстановление рН -возвращению мембранного потенциала к исходному значению. При анализе полученных данных использовались следующие параметры (рис. 1). АБ - амплитуда гиперполяризационного ответа, значение мембранного потенциала, соответствующие максимальному уровню гиперполяризации мембраны в ответ на добавление А23187 (мВ); V1 - скорость защелачивания среды инкубации, отражающая скорость гиперполяризации (мэкв ОН-/мин-л клеток); V2 - скорость закисле-ния среды инкубации, отражающая скорость восстановления мембранного потенциала (мэкв Н+/мин-л клеток). Амплитуда гиперполяризационного ответа и скорость его развития (V1) характеризуют Са2+-зависимую К+-проницаемость, а скорость восстановления мембранного потенциала (V2) - активность Са2+-АТФазы [7].

Статистическая обработка. Анализ данных проводили при помощи программы STATISTICA 6.0 for Windows фирмы Statsoft. Фактические данные представлены в виде «среднее арифметическое ± ошибка среднего» (X±m). Для определения характера распределения полученных данных использовали критерий нормальности Колмогорова-Смирнова. Сформированные выборки не подчинялись закону нормального распределения, поэтому для проверки статистических гипотез были использованы непараметрические критерии [8]. Для проверки гипотезы об однородности двух независимых выборок использовался U-критерий Манна-Уитни. Для проверки однородности парных или зависимых выборок был использован Т-критерий Вилкок-сона [9]. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05.

Рис. 1. Типичная кинетика изменения рН в суспензии эритроцитов человека в ответ на добавление 0,5 мкМ А23187 в присутствии 10 мкМ СаСЬ и 20 мкМ С1-ССР (представлена как иллюстрация метода расчета параметров гиперполяризационного ответа эритроцитов)

Результаты исследования и обсуждение

Для изучения влияния оксида азота в экспериментальной практике широко используются нитросоединения - доноры NO. В проведенных экспериментах был применен нитропруссид натрия (НП, Sigma).

Добавление в среду инкубации эритроцитов НП в концентрациях от 10-8 до 10-6 М не вызывало измене-

ний амплитуды гиперполяризационного ответа роцитов (рис. 2).

эрит-

Увеличение концентрации НП в среде инкубации эритроцитов до 10-5 М приводило к достоверному снижению амплитуды гиперполяризационного ответа (рис. 2). Кроме того, снижались и скорость развития гиперполяризации, и скорость восстановления мембранного потенциала. Увеличение концентрации нитропруссида натрия в среде инкубации до 10-410-3 М полностью подавляло развитие гиперполяризационного ответа эритроцитов (на рис. 2 не указано).

£

О

S

о

100

80

а

и

о

м

К

&

ч

о

а

60

40

Г

20

<

-8

-7 -6

Ьд(концентрации нитропруссида натрия), М

-5

Рис. 2. Изменение амплитуды гиперполяризационного ответа эритроцитов человека в присутствии различных концентраций нитропруссида натрия. За 100% приняты значения ответа в отсутствии нитропруссида натрия (контроль).

* Статистически значимые отличия от контрольных значений (р<0,05)

Имеются данные о стимуляции нитропруссидом натрия калиевой проводимости мембраны ряда клеток, в первую очередь гладкомышечных, что связывают с действием оксида азота, донором которого нитропрус-сид натрия является. В проведенных нами экспериментах был получен противоположный результат. Каковы

же причины неожиданного влияния нитропруссида натрия на Са2-активируемые калиевые каналы мембраны эритроцитов?

Следует отметить, что относительно донорной способности нитропруссида натрия не существует единой точки зрения. Некоторые авторы считают, что

*

0

НП спонтанно освобождает оксид азота [10], который легко проникает внутрь клеток и оказывает свое регуляторное действие. Согласно другой точке зрения, НП подвергается изменениям, в которых участвует мембранносвязанная НАДН-дегидрогеназа [11]. Кроме того, нитропруссид натрия освобождает не только N0, но и ионы цианида С№, причем концентрация последних пропорциональна концентрации НП [12]. Мембрана эритроцитов содержит некоторые фрагменты электронно-транспортной цепи, в частности НАДН-дегидрогеназу, цитохром с [13-15], которые могут включаться в регуляцию Са2+-активируемых калиевых каналов эритроцитов [13]. Установлено, что ионы СК- могут выступать в роли ингибитора цитохрома с [16].

Возможно, полученные эффекты НП обусловлены его декомпозицией с участием фрагментов электроннотранспортной цепи, имеющихся в мембране эритроцитов и ингибирующим влиянием ионов цианида.

Чтобы избежать NO-независимых эффектов нитро-пруссида натрия, мы использовали другой подход для увеличения концентрации оксида азота, связанный с естественным предуктором NO L-аргинином.

Известно, что эритроциты содержат NO-синтазу -фермент, образующий оксид азота из L-аргинина [17, 18].

Инкубация эритроцитов с L-аргинином (10-6 М) вызывала достоверное повышение амплитуды и скорости развития ГО эритроцитов (рис. 3).

Ингибирование NO-синтазы с помощью L-NMMA (Sigma) (24 10-5 M) достоверно снижало амплитуду гиперполяризационного ответа (рис. 3).

Таким образом, в проведенных экспериментах установлено, что внутриклеточная продукция NO с помощью L-аргинина увеличивала Са2 -зависимую калиевую проницаемость мембраны эритроцитов. Подтверждением этому являются сведения, что L-аргинин снижает гипотонический гемолиз красных клеток крови вследствие активации выхода ионов калия [19].

Рис. 3. Амплитуда гиперполяризационного ответа эритроцитов человека в присутствии Ь-аргинина, дибутирил-цГМФ, изобутилметилксантина, запринаста и Ь^ММА. За 100% приняты значения гиперполяризационного ответа в отсутствии перечисленных агентов (контроль). * Статистически значимые отличия от контрольных значений (р<0,05)

В работах по изучению участия NO в регуляции №+/Н+-обмена и К+-СГ-котранспорта показан цГМФ-зависимый эффект оксида азота [20-22].

Для выяснения цГМФ-зависимого действия оксида азота обычно применяют ингибитор растворимой гуа-нилатциклазы - метиленовый синий. Однако проведенные эксперименты показали, что метиленовый синий сам изменяет параметры гиперполяризационного ответа: в концентрации 1мкМ он увеличивал амплитуду и скорость развития гиперполяризации, что свидетельствует о его влиянии на Са2+-активируемую калиевую проницаемость эритроцитов.

В связи с этим были проведены эксперименты с агентами, увеличивающими внутриклеточную концентрацию цГМФ: дибутирил-цГМФ (10-4 М) (Sigma) -проникающим в клетки аналогом цГМФ и ингибиторами фосфодиэстераз - изобутилметилксантином (10-4 М) и запринастом (10-4 М) (100 мкМ) (Sigma) [20]. Инкубация эритроцитов со всеми перечисленными веществами

приводила к достоверному повышению амплитуды гиперполяризационного ответа (рис. 3). Скорость развития ГО достоверно увеличивалась при действии изобутилметилксантина и запринаста. Результаты исследования показали, что Ь-аргинин, дибутирил-цГМФ и ингибиторы фосфодиэстераз действуют однонаправленно, увеличивая активность Са2+-активируемых калиевых каналов. Это позволяет предположить наличие цГМФ-опосре-дованного действия оксида азота на каналы.

Таким образом, в настоящем исследовании обнаружено, что донор оксида азота нитропруссид натрия оказывает необычное действие на К+(Са2+)-каналы эритроцитов, возможно, из-за развития некоторых побочных эффектов. Стимуляция внутриклеточной продукции оксида азота с помощью Ь-аргинина вызывает повышение Са2+-зависимой К+-проницаемости мембраны эритроцитов человека. К такому же эффекту приводит и увеличение внутриклеточной концентрации цГМФ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Клещев А.Л., Демидов М.Л., Седов К.Р. Биохимические аспекты действия нитропруссида натрия // Экспериментальная и клиническая фарма-

кология. 1994. Т. 133, № 1. С. 39-43.

2. Kon K., Maeda N., Shiga T. Effect of nitric oxide on the oxygen transport of human erythrocytes // Toxicol. Environ Health. 1977. Vol. 5, № 2.

P. 1109-1113.

3. Bor-Kucukatay M., Wenby R.B., Meiselman H.J., Baskurt O.K. Effects of nitric oxide on red blood cell deformability // Amer. J. Physiol. 2005.

Vol. 284. P. 1577-1584.

4. Nicolay J.P., Liebig G., Niemoeller O.M. et al. Inhibition of suicidal erythrocyte death by nitric oxide // Pflügers Archiv European Journal of Physiol-

ogy. 2008. Vol. 456, № 2. P. 293-305.

5. Lang K.S., Lang P.A., Huber S.M., Wieder T. Mechanisms and significance of eryptosis // Antioxid Redox Signal. 2006. Vol. 8, № 8. P. 1183-1192.

6. Dodson R.A., Hinds T.R., Vincenzi F.F. Effects of calcium and A23187 on deformability and volume of human red blood cells // Blood cells. 1987.

Vol. 12. P. 555-561.

7. Орлов С.Н., Петрова И.В., Покудин Н.И. и др. Са2+-активируемые калиевые каналы эритроцитов, исследованные методом регистрации Са2+-

индуцированных изменений мембранного потенциала // Биологические мембраны. 1992. Т. 9, № 9. С. 885-903.

8. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. 459 с.

9. Боровиков В.П., Боровиков И.П. Статистика. Статистический анализ и обработка данных в среде Windows. М., 1998. 591 с.

10. Ignarro L.J., Napoli C., Loscalzo J. Nitric oxide donors and cardiovascular agents modulating the bioactivity of nitric oxide // Ibid.-2002. Vol. 90, № 1. P. 21-28.

11. Mohazzab H.K.M., Kaminski P.M., Agarwal R., Wolin M.S. Potential role of a membrane-bound NADH oxidoreductase in nitric oxide release and arterial relaxation to nitroprusside // Circ Res. 1999. № 5. P. 220-228.

12. Lockwood A., Patka J., Rabinovich M. et al. Sodium nitroprusside-associated cyanide toxicity in adult patients fact or fiction? A critical review of the

evidence and clinical relevance // Open Access Journal of Clinical Trials. 2010. № 2. P. 133-148.

13. Alvarez J., Garcia-Sancho J., Herreros B. Effect of electron donors on Ca2+-dependent K+-transport in one - step inside - out vesicles from human

erythrocyte membrane // Biochim. et biophys. acta. 1984. Vol. 771. P. 23-27.

14. KennettE.C., KuchellP.W. Redox reactions and electron transfer across the red cell membrane // IUBMB Lifte. 2003. Vol. 55, № 7. P. 375-385.

15. Matteucci E., Giampietro O. Electron pathways through erythrocyte plasma membrane in human physiology and pathology: potential redox biomarker? // Biomark Insights. 2007. Vol. 17, № 2. P. 321-329.

16. Leavesley B.H., Heather B., Prabhakaran K. et al. Interaction of cyanide and nitric oxide with cytochrome c oxidase: implications for acute cyanide toxicity // 2008. Toxicol. Sci. Vol. 101, № 1. P. 101-111.

17. Kleinbongard P., Schulz R., Rassaf T. et al. Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase // Blood. 2006. Vol. 107, № 7. P. 2943-2951.

18. Suhr F., Porten S., Hertrich T., Brixius K. Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes // Exp. Biol. Med. 2009. Vol. 20, № 2. P. 95-103.

19. Caramelo C., Riesco A., Outeirino J. et al. Effects of nitric oxide on red blood cells: changes in erythrocyte resistance to hypotonic hemolysis and potassium efflux by experimental maneuvers that decrease nitric oxide // Biochem Biophys Res Commun. 1994. Vol. 199, № 2. P. 447-454.

20. Petrov V., Lijnen P. Regulation of human erythrocyte Na+/H+-exchange by soluble and particulate guanylate cyclase // Am. J. Physiol. Cell Physiol.

1996. Vol. 271. Р. 1556-1564.

21. Adragna N.C., Lauf P.K. Role of nitrite, a nitric oxide derivative, in K-Cl-cotransport activation of low-potassium sheep red blood cells // J. Membr.

Boil. 1998. Vol. 166. P. 157-167.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

22. Adragna N.C., White R.E., Orlov S.N., Lauf P.K. K-CL cotransport vascular smooth muscle and erythrocytes: possible implication in vasodilatation //

Am. J. Physiol Cell. Physiol. 2000. Vol. 278 (2). P. 381-390.

Статья представлена научной редакцией «Биология» 22 февраля 2011 г.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.