CC BY
75
УДК 616.155.1:616.379-008.64:616.12-008.331.1
С.В. Кремено*, О.В. Груздева*, А.В. Ситожевский*, И.В. Петрова**
E-mail: ksv@cardio.tsu.ru
УЧАСТИЕ БЕЛКОВ МЕМБРАННОГО КАРКАСА ЭРИТРОЦИТОВ В РЕГУЛЯЦИИ СА2+-АКТИВИРУЕМЫХ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2-ГО ТИПА В СОЧЕТАНИИ С АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ
* Гу нии кардиологии Томского научного центра сО рАМн;
** ГОу ВпО сибирский государственный медицинский университет росздрава, г Томск
ВВЕДЕНИЕ
Сахарный диабет (СД) 2-го типа и артериальную гипертензию (АГ) относят к заболеваниям, объединенным развитием состояния инсулинорезистент-ности, при которых сердечно-сосудистые нарушения являются основной причиной высокой инвали-дизации и смертности [1]. В патогенезе сердечно-сосудистых осложнений этих заболеваний немаловажную роль играют нарушения ионной проницаемости мембран, а также нарушения структуры и функции эритроцитов [2, 3]. Кроме того, эритроциты периферической крови традиционно служат моделью для оценки глубины повреждения мембран при патологическом процессе, протекающем в организме [4]. В то же время нарушение структурно-функционального состояния мембраны эритроцитов может рассматриваться и как одно из звеньев патогенеза ряда заболеваний, в частности сахарного диабета 2-го типа и артериальной гипертензии.
Известно, что белки мембранного каркаса эритроцитов участвуют в регуляции ряда ион-транспортных систем, таких, как №+/Н+-обмен, Na+/K+/2Cl--котранспорт [5, 6, 7]. Усиление процессов гликози-лирования белков мембранного каркаса эритроцитов, таких, как спектрин, анкирин, белок полосы 4.2 [3], а также повышение микровязкости мембран эритроцитов при сахарном диабете может оказывать влияние на функционирование ионтранспортных систем клеток. Роль этого особого пути регуляции определяется способностью эритроцитов изменять объем при варьировании физико-химических показателей плазмы крови, деформироваться при движении по микрососудистому руслу, а также трансформироваться в патологически измененные формы.
Таким образом, целью настоящего исследования явилась оценка роли белков мембранного каркаса эритроцитов в регуляции Са2+-зависимой калиевой
проницаемости эритроцитов у больных сахарным диабетом 2-го типа в сочетании с артериальной ги-пертензией.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В исследовании были использованы эритроциты 28 больных СД 2-го типа в сочетании с АГ, ожирением, дислипидемией и 29 здоровых доноров. Обследованные группы соответствовали по полу и возрасту.
Кровь забиралась из локтевой вены утром натощак в пробирки с гепарином (25 ед./мл крови). После центрифугирования (1000g, 5 мин, 4°С) плазму и клетки белой крови удаляли, а эритроциты дважды промывали 3 частями изоосмотического раствора NaCl (150 мМ), содержащего 5мМ Na-фосфатный буфер (pH 7,4) и один раз 3 частями среды, содержащей 150 мМ NaCl, 1 мМ KCl, 1мМ MgCl2, 10 мМ глюкозы. После этого упакованные эритроциты переносили на лед и хранили не более 6 часов.
В работе использовался метод регистрации мембранного потенциала эритроцитов по изменению рН среды инкубации в присутствии протонофора карбонилцианид-т-хлорфенилгидразона (С1ССР) [8], основанный на том, что в присутствии протоно-фора распределение протонов зависит от мембранного потенциала Em как Em=RT/F(pH;-pH0). Здесь рН; и pH0 - значения рН цитоплазмы и среды инкубации соответственно. При низкой буферной емкости среды инкубации (в наших условиях она примерно в 100 раз меньше буферной емкости цитоплазмы) изменениями рН; можно пренебречь, а его квазистационарный уровень определить при гемолизе клеток в присутствии детергента.
Эксперименты проводились по следующему плану. К 4,75 мл среды инкубации, содержащей 150 мМ NaCl, 1 мМ KCl, 1мМ MgCl2, 10 мМ глюкозы и 10 мкМ кальция, добавляли 0,25 мл упакованных эритроцитов (pH 7,4). Через 5 мин инкубации при 37°С и постоянном перемешивании добавляли про-тонофор ClCCP до конечной концентрации 20 мкМ и спустя 2 мин добавляли 0,5 мкМ Са2+-ионофора А23187, что приводило к открыванию Са2+-активи-руемых калиевых каналов и выходу ионов калия из клетки, что сопровождалось гиперполяризацией мембраны эритроцитов.
Амплитуду гиперполяризационного ответа эритроцитов (A E) рассчитывали по формуле: AE=RT/F*(pH1-pH2), где рН4 - исходное значение рН среды инкубации эритроцитов, рН2 - значение рН среды инкубации клеток в момент гиперполяризации эритроцитов и использовали в качестве интегральной характеристики активности Са2+-зави-симых калиевых каналов этих клеток [8].
регистрацию рН проводили с помощью комбинированного рН-чувствительного электрода HI 1332 (HANNA Instruments) и рН-метра TYP N517 (Poland).
С.в. Кремено, о.в. груздева и др.
регуляция Са2 -активируемых калиевых каналов
Изменение объема эритроцитов, которое, как известно, сопровождается структурными перестройками белков мембранного каркаса этих клеток [8], осуществляли посредством изменения осмолярнос-ти среды инкубации от 220 мосм (уменьшением концентрации №С1 в среде инкубации до 100 мМ) до 520 мосм (добавлением соответствующих концентраций сахарозы к изоосмотическому раствору).
Для выявления роли спектрина в регуляции Са2+-активируемой калиевой проницаемости мембраны эритроцитов использовали подход, связанный с термической денатурацией спектрина мембранного каркаса эритроцитов [5]. Для выявления роли актина в регуляции Са2+-активируемой калиевой проницаемости мембраны эритроцитов суспензии клеток (гематокрит 20%) обрабатывали 10 мкМ цитоха-лазина D в течение 10 мин.
Показатели липидного обмена определяли с помощью специализированных тест-систем фирмы Вюсоп, Германия.
Достоверность различий параметров сравниваемых групп оценивали по непараметрическим критериям. Корреляционный анализ проводили с вычислением коэффициента ранговой корреляции Спир-мена. Результаты представлены в виде «среднее ± ошибка среднего».
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В настоящем исследовании было установлено, что у больных СД 2-го типа в сочетании с АГ по сравнению со здоровыми донорами происходило снижение амплитуды гиперполяризационного ответа эритроцитов. Исследуемый параметр составил у больных сахарным диабетом -33,62±1,13 (п=12) и -38,04±0,96 мВ в контрольной группе (п=12, р<0,01). Одной из причин обнаруженного снижения калиевой проницаемости мембраны эритроцитов больных СД 2-го типа в сочетании с АГ может быть повреждение белков мембранного каркаса клеток. Так, у больных СД 2-го типа происходит увеличение степени гликозилирования белков мембранного каркаса эритроцитов, таких, как спектрин, анкирин, белок полосы 4.2 [3].
Нарушение мембранного каркаса эритроцитов может проявляться в динамических условиях функционирования клеток - значительных изменениях осмолярности среды инкубации клеток, приводящих к колебаниям объема эритроцитов.
Согласно литературным данным, изменение объема эритроцитов, происходящее при варьировании осмолярности среды инкубации, с одной стороны, сопровождается структурными перестройками белков мембранного каркаса [4], а с другой стороны, - включением механизмов перераспределения ионов, ассоциированных с изменением активности ионно-транспортных систем клеток (№+/Н+-обмен-ника, №+,К+,2С1--котранспорта, К+,С1--котранспор-та) и приводящих к восстановлению объема [6, 7, 9].
-20 -1-1-1-1-
220 320 420 520
осмолярность среды, мосм
Рис. 1. Зависимость амплитуды гиперполяризационного ответа эритроцитов здоровых доноров и больных сахарным диабетом 2-го типа в сочетании с артериальной гипертензией
от осмолярности среды инкубации. Параметры больных, достоверно отличающиеся от контрольной группы: *р<0,01.
1) —•— здоровые доноры 2) —о— больные сахарным диабетом 2-го типа в сочетании с артериальной гипертензией
Нами обнаружено, что увеличение объема (220 мосм) и сжатие (520 мосм) клеток здоровых доноров приводило к снижению гиперполяризационного ответа эритроцитов по сравнению с изоосмоти-ческими условиями (рис. 1). При этом у здоровых доноров происходило снижение амплитуды гиперполяризационного ответа эритроцитов до -34,22± 1,13 мВ (п=12, р<0,01) при увеличении объема и до -28,59±5,32 мВ (п=13, р<0,05, 520 мосм) при сжатии клеток. В эритроцитах больных достоверное снижение параметра ДЕ до -27,25±4,01 мВ (п=12, р<0,05) отмечалось только в гиперосмотической среде 520 мосм. При этом сжатие клеток нивелировало различия между параметрами гиперполяризационного ответа эритроцитов больных сахарным диабетом и здоровых доноров.
Известно, что выход ионов калия из клетки сопровождается потерей воды. В этом случае снижение Са2+-зависимой калиевой проницаемости мембраны эритроцитов у здоровых доноров, происходящее в гипоосмотических условиях, будет способствовать большему увеличению объема клеток и последующему лизису. При сжатии эритроцитов снижение Са2+-зависимой калиевой проницаемости, а, следовательно, и выход воды можно рассматривать как адаптивный механизм.
Таким образом, результаты экспериментов по сжатию и растяжению эритроцитов позволяют предположить, что белки мембранного каркаса эритроцитов участвуют в регуляции Са2+-активируемой калиевой проницаемости эритроцитов. У больных сахарным диабетом 2-го типа в сочетании с АГ, вероятно, происходит нарушение этого пути регуляции.
Основным количественно преобладающим белком мембранного каркаса эритроцита является спект-рин, содержание которого составляет 76%. Образуя с актином белковую сеть на цитоплазматичес-кой стороне мембраны, спектрин принимает участие в поддержании интегративной целостности мембран
Рис. 2. Влияние термоденатурации белков мембранного каркаса эритроцитов здоровых доноров (А) и больных сахарным диабетом 2-го типа в сочетании с артериальной гипертензией (Б) на амплитуду гиперполяризационного ответа этих клеток. Параметры достоверно отличаются в обеих выборках: *р<0,05
1) —▲—инкубация 37°С, 10 мин,
2) — А— инкубация 50°С, 10 мин
и обеспечении высокой деформируемости эритроцитов. При удалении спектрина из мембран клетки теряют способность сохранять свою целостность и распадаются на везикулы размером около 1 мкм. Спектрин и актин являются актомиозиноподобными сократительными белками. Они выполняют как ци-тоскелетную, так и цитокинетическую функции [10].
Показано, что инкубация эритроцитов при 50°С в течение 10 мин приводит к термической денатурации спектрина, не затрагивая при этом другие белки мембранного каркаса эритроцитов [5]. Этот подход мы использовали для выяснения роли спектри-на в объем-зависимой регуляции Са2+-активируе-мых К+-каналов.
В этой серии экспериментов (п=8) было показано, что температурная обработка эритроцитов больных и здоровых доноров (рис. 2) приводила к значительному снижению параметров гиперполяризационного ответа клеток, устраняя объм-зависимые различия и различия между величиной гиперполяризационного ответа эритроцитов больных СД и здоровых доноров.
Для выяснения роли актина в регуляции Са2+-ак-тивируемых калиевых каналов эритроцитов клетки
ДЕ, мВ -50 ■
-40 ■
-30 ■
-20 ■
-10 ■
0 ■
rflfl
инкубировали в присутствии 10 мкМ цитохалазина D, разобщающего взаимодействие актиновых фила-ментов [11]. Так, цитохалазин специфически связывается с растущими плюс-концами актиновых фила-ментов, блокируя присоединение к ним новых мономеров актина и, таким образом, нарушая «тредмил-линг» - процесс непреывного перемещения отдельных молекул актина от одного конца филамента к другому [12].
В проведенной серии экспериментов (n=7) было обнаружено, что цитохалазин D в изоосмотических условиях не вызывал изменения активности Са2+-ак-тивируемых калиевых каналов эритроцитов у больных и у здоровых доноров (рис. 3). При увеличении объема и сжатии клеток также не происходило выраженных изменений Са2+-активируемой калиевой проницаемости эритроцитов.
На основании полученных данных можно предположить, что наиболее важную роль в регуляции Са2+-зависимой калиевой проницаемости мембраны эритроцитов как у больных СД 2-го типа в сочетании с АГ, так и у здоровых доноров, играет спектрин. Отсутствие эффекта цитохалазина D на калиевую проницаемость мембраны, возможно, связано с невысоким содержанием актина в мембранном каркасе эритроцитов, в отличие от других клеток, например, макрофагов, регуляторное изменение объема которых заметно подавляется цитохалазином [13].
Регуляторное влияние на Са2+-зависимые калиевые каналы эритроцитов спектрин может оказывать как через белок-белковые взаимодействия, так и опосредованно через липидный матрикс клеток. Известно, что в эритроцитах больных СД 2-го типа происходят изменения и в составе липидного бислоя мембраны: отмечается повышение содержания холестеро-ла, сфингомиелина и снижение содержания фосфа-тидилсерина [14, 15], что может приводить к нарушению белок-липидных взаимодействий.
Известно, что в мембране эритроцитов не происходит синтеза липидов de novo, однако эффективно
220 320 420 520
осмолярность среды, моем
Рис. 3. Влияние цитохалазина D на амплитуду гиперполяризационного ответа эритроцитов здоровых доноров (А) и больных сахарным диабетом 2-го типа в сочетании с артериальной гипертензией (Б).
| - инкубация 37°С,
- инкубация 37° С в присутствии цитохалазина D
C.B. Кремено, О.В. Груздева и др.
РЕГУЛЯЦИЯ Са2 -АКТИВИРУЕМЫХ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ
работают механизмы их обновления и обмена в результате взаимодействия с липопротеинами плазмы [1б]. Существует предположение, что изменения липидного состава мембран эритроцитов могут отражать общие нарушения липидного обмена в организме [14].
У обследованных нами пациентов наблюдалась дислипидемия, проявляющаяся повышением общего холестерола, холестерола липопротеинов низкой плотности (ХС ЛПHП), триацилглицеролов, снижением холестерола липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП) и соответствующим повышением индекса атерогенности (ХС ЛПHП/ ХС ЛПВП).
Шми обнаружены отрицательные корреляционные зависимости между амплитудой мембранного потенциала эритроцитов больных СД 2-го типа в сочетании с Ar и содержанием общего холестерола плазмы крови (n=20, -0,42, р=0,04), ХС ЛПHП (n=20, -0,5б, р=0,0038) и индексом атерогенности (n=20, -0,5б, р=0,0042), а также прямая зависимость с содержанием ХС ЛПВП плазмы крови (n=20, 0,38, р=0,05). Возможно, нарушения липидного обмена могут оказывать опосредованное влияние на активность Са2+-активируемых калиевых каналов эритроцитов больных СД 2-го типа вследствие изменения липидного состава мембраны.
Таким образом, установлено, что у больных СД 2-го типа в сочетании с Ar отмечается снижение калиевой проницаемости мембраны эритроцитов, одной из причин изменения которой может быть повреждение спектрина, основного белка мембранного каркаса этих клеток, либо нарушение белок-липид-ных взаимодействий, обусловливающих взаимосвязь белков мембранного каркаса, липидного матрикса и канала.
ЛИТЕРАТУРА
1. Neri S., Bruno C.M., Leotta C. et al. Early endothelial alterations in non-insulin-dependent diabetes mellitus // Int J Clin Lab Res. - 1998. - V. 28. - P. 100-103.
2. McMillan D.E., Utterback N.G., Puma J. La Reduced erythrocyte deformability in diabetes // Diabetes. - 1978. - Vol. 27. - P. 895.
3. Schwartz R.S., Madsen J.W., Rybicki A.C., Nagel R.L. Oxidation of spectrin and deformability defects in diabetic erythrocytes // Diabetes. - 1991. - Vol. 40, №№ б. - P. 701-708.
4. Черницкий E.A., Воробей A^. Структура и функции эритроцитарных мембран.- Минск, 1981. - 2б0 с.
5. Shnyrov V.L., Orlov S.N., Zhadan G.G., Pokudin N.I. Thermal inactivation of membrane proteine, volume -dependent Na+, K+, 2Cl--cotransport and protein kinase C activator - induced changes of the shape of human and rat enterocytes // Biomed. biochim. acta. - 1990. - V. 49. -P. 445-453.
6. Орлов С.И., Покудин И.И., Ряжский Г.Г. и др. О механизме регуляции транспорта ионов через плазматическую мембрану при изменении обьема клетки // Биол. мембраны. - 1988. - Т. 5. - С. 1030-1041.
7. Орлов С.И., Покудин И.И., Ряжский Г.Г. и др. Вали-номицин индуцирует Na+/H+- обмен в эритроцитах крысы: влияние активаторов протеинкиназ A и С. // Биол. мембраны. - 1987. - Т. 4. - С. 103б-104б.
8. Орлов С.Н., Петрова И.В., Покудин Н.И. и др. Са2+-активируемые калиевые каналы эритроцитов, исследованные методом регистрации Са2+-индуцированных изменений мембранного потенциала // Биологические мембраны. - 1992. - Т. 9. № 8. - С. 885-903.
9. Brugnara C., Tosteson D.C. Cell volume, K transport, and cell density in human erythrocytes // Am.J.Physiol. - 1987252 (Cell Physiol. 21). - P. 269-276.
10. Сторожок С.А., Санников А.Г., Захаров Ю.М. Молекулярная структура мембран эритроцитов и их механические свойства. - Тюмень, 1997. - 140 с.
11. Goddette D.W., Frieden C. Actin polymerization. The mechanism of action of cytochalasin D // J. Biol. Chem. -1986. - Vol. 261. - P. 15974-15980.
12. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Д. и др. Молекулярная биология клетки: В 3 томах. Т. 2. М.: Мир, 1993. -С. 254-337.
13. Галкин А.А. Регуляторное уменьшение объема макрофагов в гипоосмотической среде, обусловленное активацией фуросемидчувствительной системы ионного транспорта / А.А. Галкин, Б.И. Ходоров // Внутриклеточная сигнализация. - М.: Наука, 1988. - С. 166-171.
14. Максимов О.В., Солун М.Н. Особенности липидного состава эритроцитарных мембран у больных сахарным диабетом // Пробл. эндокринол. - 1989. - Т. 35, № 2. -С. 14-18.
15. Martinez М., Vaya A., Server R. Alterations in erythrocyte aggregability in diabetics: the influence of plasmatic fibrinogen and phospholipids of the red blood cell membrane // Clin Hemorheol Microcirc. - 1998. - Vol. 18, № 4. - P. 253-258.
16. Lange Y., Molinaro A.L., Chauncey T.R., Steck T.L. On the mechanism of transfer of cholesterol between human erythrocytes and plasma // J. Biol. Chem. - 1983. - Vol. 258, № 6. - P. 6920-6926.
PARTICIPATION OF MEMBRANE TYPE PROTEINS IN THE REGULATION OF CA2+-ACTIVATED SODIUM CHANNELS IN PATIENTS WITH THE 2-ND TYPE DIABETES MELLITUS COMBINED WITH ARTERIAL HYPERTENSION
S.V. Kremeno, O.V. Grouzdeva, A.V. Sitozhevski, I.V. Petrova
SUMMARY
The given work results established that patients with the diabetes mellitus of the 2-nd type combined with arterial hypertension have decreased Са2+-dependent sodium membrane permeability of erythrocytes.
Key words: erythrocytes, Ca2+-activated potassium channels, spectrin, dyslipidaemia, diabetes mellitus of the 2-nd type, arterial hypertension.
