CC BY
37
УДК:611.36-018:661.982
В.К. Спиридонов, Н.Ф. Воробьева, З.С. Толочко
РОЛЬ ОКСИДА АЗОТА В ДЕЙСТВИИ КАПСАИЦИНА НА МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПЕЧЕНИ И АКТИВНОСТЬ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНАЗ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ У КРЫС
ГУ НИИ физиологии СО РАМН, Новосибирск
Исследовали влияние блокады NO синтазы (NOS), увеличения содержания оксида азота (NO) и повреждения капсаицинчувствительных нервов на структурные показатели ткани печени и активность ингибиторов протеиназ в сыворотке крови у крыс Вистар. Повреждение афферентных нервов капсаицином (150 мг/кг) вызывает изменения сосудов, лейкоцитарную инфильтрацию, дистрофические и некротические изменения гепатоцитов, снижение активности ингибитора сериновых протеиназ оц-антитрипсина (a,-AT) и увеличение а2-макрогло-булина (а2-МГ). Избирательный ингибитор nNOS 7-нитроиндазол (40 мг/кг) и ингибитор общего действия L-NAME (200 мг/кг) вызывают расширение сосудов, лейкоцитарную инфильтрацию, дистрофические и некротические изменения гепатоцитов, которые сильнее выражены с L-NAME и увеличивают активность а2-МГ. Донор NO нитропруссид натрия (1,5 мг/кг) вызывает гиперемию, расширение микрососудов и повышает активность оц-АТ. При введении L-аргинина наблюдается более выраженная сосудистая реакция и развитие дистрофических изменений гепатоцитов. Введение L-аргинина совместно с капсаицином частично снижает повреждающее действие капсаицина и восстанавливает активность оц-АТ. Полученные данные свидетельствуют о важной роли NO механизмов в поддержании структурного гомеостаза и их участии в деафферентационных эффектах капсаицина.
Ключевые слова: печень, капсаицин,
Выделяющиеся при раздражении VR1 рецепторов афферентных, капсаицинчувствительных нервов, нейропептиды действуют на структуры сосудистого русла, активируют соединительнотканные и иммунокомпетентные клетки, осуществляя таким образом локальную эфферентную функцию [1]. В последние годы выявлена важная роль оксида азота (NO) в функционировании капсаицинчувствительных нервов. NO увеличивает выброс нейропептидов при стимуляции рецепторов, усиливает и опосредует действие нейропептидов в регуляции сосудистого тонуса, проницаемости, воспалительных реакций [2].
Ранее в лаборатории было показано, что системное введение капсаицина вызывает изменения в тканях, заключающиеся в расширении мелких сосудов, набухании клеточных и неклеточных элементов при введении его стимулирующих доз и появлении очаговых изменений дистрофического характера на фоне хронической воспалительной реакции [3]. Блокада NOS усиливает дистрофические и некротические изменения печени крыс, вызываемые введением нейротоксических доз капсаицина [4]. Развитие дистрофических изменений после дефункционализации капсаицинчувствительных нервов сопровождается снижением активности ингибитора сериновых протеиназ а,-антитрипсина [5]. В противоположность
N0, а,-АТ, а2-МГ
этому, активность неспецифического ингибитора протеиназ а2-макроглобулина повышается в ранние сроки после введения нейротоксических доз капсаицина и нормализуется в более длительные сроки после деафферентации [6]. Баланс активностей протеиназ и их игибиторов имеет важное значение в тканевом гомеостазе. Основным местом образования о^-АТ и а2-МГ является печень. Нарушение ее структурно-функциональных свойств, вызываемое деафферентацией, может влиять на образование ингибиторов протеиназ, определяемых в циркулирующей крови. В то же время ингибиторы протеиназ являются важным компонентом в развитии дистрофических процессов и воспалительной реакции в деафферен-тированной ткани печени.
В настоящей работе проведено изучение действия селективного ингибитора пМОБ 7-нитроин-дазола, ингибитора общего действия Ь-МАМЕ, донора N0 нитропруссида Ыа, предшественника N0 Ь-аргинина и нейротоксических доз капсаицина на морфологические показатели ткани печени и активность ингибиторов протеиназ а(-АТ и а2-МГ в сыворотке крови у крыс Вистар.
Методика
Опыты проведены на крысах-самцах линии Вистар массой 200-240 г. Содержание, питание, уход за животными и выведение их из экспери-
Спиридонов В.К. Роль оксида азота в действии капсаицина на морфологические показатели печени и активность ингибиторов протеиназ в сыворотке кровиу крыс /с. 145-149
мента осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г. № 755). Экспериментальные группы (по 7-8 животных): 1-я группа — введение под легким эфирным наркозом капсаицина (Sigma) в три приема ( 30, 50 и 70 мг/кг, с интервалом 6-10 ч, и/к), забой крыс через 4 сут. 2-я группа — введение 7-нитроинда-зола (Sigma), 20 мг/кг/сут х 2. 3-я группа — введение метилового эфира Ncü-нитро-L-аргинина (L-NAME, ICN), в/б, 100 мг/кг/сут х 2. В этих группах материал исследовали через 1 сут. после введения препаратов. 4-я группа — введение нит-ропруссида натрия, 1,5 мг/кг, в/б, забор материала чрез 4 ч. 5-я группа — введение L-аргинина (Sigma), в/б, 200 мг/кг. 6-я группа — совместное введение L-аргинина, 200 мг/кг за 15 ч и затем по 100 мг/кг за 1 ч до каждого трехкратного введения капсаицина. В группах 5 и 6 материал исследовали через 4 сут. Контролем служили интактные крысы. Животных декапитировали под эфирным наркозом, забирали кровь для получения сыворотки и образцы ткани печени.
Образцы печени для световой микроскопии фиксировали в 10% формалине и получали гистологические срезы по общепринятым методам. Срезы окрашивали гематоксилином Майера и эозином. Изучали структурные компоненты ткани печени при увеличении хЮ00 на микроскопе Jenamed-2 Carl Zeiss Jena. Морфометрию дистрофических (вакуолизация, зернистость цитоплазмы), некротических (вакуолизация цитоплазмы, кариопикноз, кариорексис) изменений и 2-ядер-ных гепатоцитов проводили с использованием окулярной сетки из 25 точек [7]. Активность ингибиторов протеиназ определяли по торможению гидролиза БАЭЭ (этиловый эфир N-альфа-бензоил-Ь-аргинин, Sigma) и выражали в ингибиторных единицах (ИЕ/мл сыворотки) [8]. Статистическую обработку осуществляли по t-критерию Стъюдента.
Результаты
Данные морфометрических и биохимических измерений представлены в таблице. У интактных животных в печени наблюдается обычная морфологическая картина. Через 4 сут. после введения нейротоксических доз капсаицина в печени выявляется резкое расширение сосудов центральных отделов долек, сладж эритроцитов, а в портальных трактах видна умеренно выраженная лимфогис-тиоцитарная инфильтрация, местами выходящая за пределы пограничной пластинки. В гепатоци-тах видны деструктивные явления — вакуолизация цитоплазмы, пикноз ядер, наблюдается частичный распад балок. По сравнению с контролем увеличивается число дистрофически измененных гепатоцитов, некрозов и двухъядерных гепатоцитов. Активность cij-AT была достоверно снижена на 27,8%, тогда как активность а2-МГ увеличена на 26,2% по сравнению с интактными животными.
Влияние блокады NOS. Через 1 сут. после введения блокатора nNOS 7-нитроиндазола наблюдается умеренное расширение центральных вен, синусоидов и портальных трактов, варикозные выпячивания, наблюдается незначительный выход лейкоцитов. В синусоидах и портальных трактах видна умеренно выраженная лимфогис-тиоцитарная инфильтрация. Отмечается увеличение числа дистрофий и некрозов по сравнению с интактными животными и увеличение числа двухядерных гепатоцитов (Таблица), балочное строение печени сохранено. При этом активность dj-AT оставалась в пределах контрольного уровня с незначительной тенденцией к снижению, а активность а2-МГ была повышена на 21,9% (Р<0,05) по сравнению с контролем.
Введение блокатора NOS смешанного типа действия L-NAME вызывало более выраженный эффект. Отмечается нарушение балочной структуры печени. Центральные вены долек расширены, наблюдается сладж эритроцитов; портальные тракты и синусоиды значительно расширены, в
Таблица
Влияние капсаицина, блокаторов NOS и увеличения NO на морфологические показатели ткани печени
и активность ингибиторов протеиназ
Группы Дистрофические гепатоциты Некротические гепатоциты 2-ядерные гепатоциты о^-АТ, ИЕ/мл.сыв а2МГ, ИЕ/мл.сыв.
Контроль п=8 0,03±0.01 0,05±0,01 0,03±0.01 27,7±0,6 3,09±0,1
Капсаицин п-8 5,54±0,12* 0,42±0,03* 0,78±0,05* 20,011,3* 3,9+0,1*
7-нитроиндазол п=8 0,5±0,01* 0,1±0,01* 0,5±0,01* 26,5+1,1 3,8±0,2*
L-NAME п=8 1,5±0,0Г 2,9±0,1* 1,01+0,01* 27,2±2,0 4,1±0,3*
Нитропруссид Na п=7 0,3+0,01 0,02±0,01 0,4±0,01 33,8+1,3* 3,0+0,1
L-аргинин п=7 0,05±0,01* 0,02+0,01 0,4±0,01 27,3±1,6 3,2±0,4
L-аргинин + капсаицин п=7 8,5±0,2* 0,03±0,01 0,7±0,02 28,4±1,6 3,6+0,1*
Примечание: * — Р< 0,05по сравнению с контролем
Спиридонов В.К. Роль оксида азота в действии капсаицина на морфологические показатели печени и активность ингибиторов протеиназ в сыворотке крови у крыс/с. 145-149
них видна умеренно выраженная лимфогистио-цитарная инфильтрация. По сравнению с действием 7-нитроиндазола в большей степени увеличено число дистрофических гепатоцитов, еще более выражено увеличение числа некрозов. Активность ингибиторов протеиназ после воздействия Ь-ЫАМЕ была практически такой же, как после введения 7-нитроиндазола, но повышение активности а2-МГ выражено в большей степени, чем при действии 7-нитроиндазола и составляло 132,9% (Р < 0,05).
Влияние увеличения содержания N0. Результаты опытов показали, что через 4 часа после введения экзогенного источника N0 нитропрус-сида натрия выявляется отчетливая сосудистая реакция в виде полнокровия центральных вен и микроциркуляторного русла, умеренно выраженная лимфогистиоцитарная инфильтрация. Число дистрофий, некрозов и двухядерных гепатоцитов находится в пределах контрольных величин. Активность о^-АТ в этом случае была достоверно увеличена и составляла 122,0% (Р<0,05) от контрольного уровня, тогда как активность а2-МГ была в пределах нормы.
Через 4 сут. после введения Ъ-аргинина значительно расширены и полнокровны центральные вены, наблюдается усиленный сладж эритроцитов в капиллярах; заметно расширены и синусоиды и портальные тракты; отмечается незначительный выход лейкоцитов в ткань, увеличивается инфильтрация синусоидов и портальных трактов лим-фогистиоцитарными элементами. В этой группе наблюдается небольшое увеличение дистрофических изменений гепатоцитов, а число некрозов и двухъядерных форм гепатоцитов не отличается от контроля. Балочное строение печени при этом не нарушено. Активность ингибиторов протеиназ в этом опыте существенно не изменена.
После совместного введения Ь-аргинина и капсаицина центральные вены, синусоиды и портальные тракты значительно расширены, но полнокровия и сладжа эритроцитов не наблюдается, нет и инфильтрации лимфогистиоцитарными элементами. Основная масса гепатоцитов находится в состоянии дистрофии, сильно выражена вакуолизация их цитоплазмы, но некрозов мало. Число двухъядерных форм гепатоцитов незначительно увеличено, балочное строение в центральной части долей печени нарушено. Активность о^-АТ была в пределах контрольного уровня, тогда как активность а2-МГ была достоверно повышена на 15,5%.
Обсуждение
Полученные данные показывают, что повреждение афферентных нервов капсаицином через 4 сут. вызывает развитие изменений дистрофи-
ческого и некротического характера с проявлениями воспалительного процесса и пролиферации в ткани печени. Сниженная активность оц-АТ в этих условиях говорит о важной роли капсаицин-чувствительных нервов в регуляции активности ингибитора сериновых протеиназ и может быть причиной изменения баланса протеиназ и их ингибиторов в сторону увеличения активности протеиназ, что является одним из патогенетических факторов дистрофического процесса. Повышение а2-МГ в ранние сроки после воздействия капсаицином связано, вероятно, с развитием острой реакции на повреждение, вызываемое нейротокси-ческими дозами капсаицина и показанной нами ранее по реакции белков сыворотки крови [9]. При стрессе, вызываемым термическим повреждением у крыс, многократному увеличению уровня а2-МГ предшествует повышение концентрации провоспалительных цитокинов и наблюдается положительная корреляция развития во времени увеличения концетраций IL-6 и а2-МГ [10]
Данные опытов показали, что блокада nNOS 7-нитроиндазолом вызывает нарушения тканевого гомеостаза, заключающиеся в расширении сосудов, незначительной лейкоцитарной инфильтрации, появлении дистрофических и некротических изменений гепатоцитов. Полученные нами данные отражают, вероятно, изменения тонуса микрососудов и свидетельствуют об участии NO нейронального происхождения в поддержании баланса вазодилататорных и вазоконстрик-торных механизмов в ткани печени. Более выраженные структурные изменения при воздействии блокатором смешанного типа L-NAME объясняется, по-видимому, его действием на сосуды, потенцированием вазоконстрикторного действия эндотелина-1 и увеличением проницаемости сосудов печени [11]. Отметим, что оба блокатора NOS одинаково подействовали на ингибиторы протеиназ — не изменили активность а(-АТ и, как и после воздействия капсаицином, увеличили активность а2-МГ. Эти результаты согласуются с данными об усилении структурных нарушений, увеличении уровня провоспалительного цитоки-на IL-6 при введении L-NAME крысам с хронической инфекцией в легких [12].
Как видно из результатов наших опытов, введение экзогенного источника NO (нитропруссид натрия) вызывает гиперемию сосудов без существенных структурных изменений. В тоже время активность а(-АТ была достоверно увеличена. Этот факт говорит о том, что NO может осуществлять активирующее действие на активность a,-AT в организме. В литературе имеются данные о том, что при дефиците антипротеазной активности снижено содержание NO [13,14].
Спиридонов В.К. Роль оксида азота в действии капсаицина на морфологические показатели печени и активность ингибиторов протеиназ в сыворотке крови у крыс /с. 145-149
Увеличение эндогеного NO введением L-арги-нина в наших опытах вызывало более выраженную реакцию сосудов, появление дистрофически измененных гепатоцитов и не влияло на активность ингибиторов протеиназ в отличие от действия нитропруссида Na. Последний факт может быть объяснен длительным сроком (4 сут.) наблюдения после введения L-аргинина и его утилизацией NOS и аргиназой.
При введении капсаицина в условиях увеличения NO L-аргинином сохраняется сосудистая реакция в виде расширения центральных вен, си-нусоидов и портальных трактов, но без воспалительной реакции и некротических изменений. В то же время наблюдаются дистрофические изменения гепатоцитов, нарушение балочной структуры в центральных участках долек и небольшое повышение 2-ядерных гепатоцитов. Отсутствие воспалительной реакции и некрозов в этом опыте свидетельствуют о частичном предотвращении действия капсаицина, осуществляемое, вероятно, восстановлением NO механизмов, нарушаемых при воздействии нейротоксических доз капсаицина. Об этом также свидетельствует восстановленная активность a,-AT и менее выраженное повышение активности а2-МГ по сравнению с действием одного капсаицина.
Полученные нами данные об отсутствии проявлений воспалительной реакции при введении L-аргинина как отдельно, так и совместно с кап-саицином, согласуется с данными литературы об антивоспалительном действии L-аргинина — снижении адгезии лейкоцитов при ишемии печени [15], нейтрофильной инфильтрации в печени при геморрагии [16], структурных изменений и уровня IL-6 при легочной инфекции [12]. В то же время наличие дистрофических изменений в гепатоцитах после введения L-аргинина говорит о его многообразном действии, обусловленном не только увеличением продукции NO, но также активацией аргиназы и включения аргинина в цикл продукции мочевины с образованием мочевины и орнитина, который, в свою очередь, служит источником образования пролина, субстрата синтеза коллагена и полиаминов, стимулирующих клеточную пролиферацию [17].
Заключение
Обобщая полученные данные, можно заключить, что дефицит оксида азота, вызванный блокадой NOS, приводит к выраженному нарушению регуляции сосудистого русла, что, в свою очередь, приводит к ишемии и гипоксии и, как следствие, к дистрофическим и некротическим изменениям в ткани печени. Можно предполагать, что в развитии дистрофических изменений после дефункционализации капсаицинчувстви-
тельных нервов, наряду со снижением содержания сенсорных нейропептидов, большую роль играют N0 механизмы. Введение экзогенного N0 вызывает гиперемию сосудов, увеличение активности ингибитора сериновых протеиназ, но не влияет на активность универсального ингибитора протеиназ а2-МГ, тогда как блокада NOS увеличивает активность а2-МГ. Введение предшественника N0 L-аргинина снижает число некрозов и воспалительные проявления в печени и восстанавливает активность а(-антитрипсина, вызываемых дефункционализацией капсаицин-чувствительных нервов.
THE INFLUENCE OF DEAFFERENTATION AND MODIFICATION OF THE NO-SYSTEM ON LIVER MORPHOLOGY AND SERUM ACTIVITY PROTEINASE INHIBITORS.
V.K. Spiridonov, N.F. Vorobieva, Z.S. Tolochko
The effects of NOS blocade, increase in content NO and damage of capsaicin-sensitive nerves on the structural parameters of liver tissue and the activity of proteinase inhibitors have been investigated. The damage of afferent nerves by capsaicin (150 mg|kg) produced the changes of vessels, leucocytes infiltration, dystrophic and necrotic injury of hepatocytes, decrease of the activity of proteinase inhibitor of af-antitrypsin and increase of a2-macroglobulin. nNOS selective inhibitor 7-nitroindazole (40 mg|kg) and inhibitor of general action L-NAME (200 mg|kg) caused the expansion of vessels, the leucocytes infiltration, dystrophic and necrotic injury of hepatocytes which stronger expressed with L-NAME, and increase of a2-macroglobulin activity. The donor of NO sodium nitroprusside (1,5 mg|kg) caused hyperemia, expansion of the microvessels and increased aj-antitrypsin activity. After L-arginine injection observe stronger the reaction of vessels and development of dystrophic injury of hepatocytes. The combined injection of the L-arginine together with capsaicin partly prevented damaging capsaicin effect and restore of ^-antitrypsin activity.The data obtained give evidence for the important role of NO mechanisms in maintenance of structural homeostasis and their involvement in deafferentation effects of capsicin.
Литература
1. Szolcsanyi,J. Forty years in capsaicin research for sensory pharmacology and physiology / J. Szolc-sanyi // Neuropeptides. — 2004. — Vol. 38. — № 6. - P. 377-384.
2. KajekarR. Essential role for nitric oxide in neurogenic inflammation in rat cutaneous microcirculation / R. Kajekar, P.K. Moore, S.D. Brain // Circulation Research. - 1995. - Vol. 76. - P. 441-447.
Спиридонов В.К. Роль оксида а:юта в действии капсаицина на морфологические показатели печени и активность ингибиторов протеиназ в сыворотке крови у крыс / с. 145-149
3. Структурные изменения тканей белых крыс после введения капсаицина / Н.Ф. Воробьева, Г.Г. Князев, В.А. Лазарев, В.К. Спиридонов // Морфология. - 1997. - Т. 111. - № 2. - С. 59-63.
4. Спиридонов В.К. Эффекторное действие стимуляции и повреждения капсаицин-чувствитель-ных афферентных нейронов / В.К. Спиридонов, Н.Ф.Воробьева, З.С. Толочко// Бюл. СО РАМН. -2004. - №2.-С. 135-141.
5. Толочко З.С. Влияние повреждения капса-ицин-чувствительных нервов на активность о^-антитрипсина в крови крыс / З.С. Толочко, В.К. Спиридонов // Эксп. и клин, фармакол. — 2004.
- Т. 67. - № 2. - С. 67-69.
6. Толочко З.С. Разнонаправленные изменения концентрации а2-макроглобулина и а(-антитрип-сина крови у крыс при повреждении капсаицин-чувствительных нервов / З.С. Толочко, В.К. Спиридонов // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова.
- 2006. - Т. 92. - № 9. - С. 1078-1084.
7. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия / Г.Г Автандилов. - М„ 1990. - 383 с.
8. Архипова О.Г. Методы исследования в профпатологии / О.Г. Архипова. — М., 1988. — 207 с.
9. Костина Н.Е. Реакция белков крови на повреждение капсаицин-чувствительных нервов / Н.Е. Костина, В.К. Спиридонов // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. - 2005. - Т. 91. - № 1.
- С. 758-763.
10. Kataranovski, М. Early inflammatory cytokine and acute phase protein response under the stress of thermal injure in rats / M. Kataranovski, Z. Magic,
N. Pejnovic // Physiol. Res. - 1999. - Vol. 48. - № 6. - P. 473-482.
11. Vascular responses to endothelin-1 following inhibition of nitric oxide synthesis in the conscious rat / J.G. Filep, E. Foldes-Filep, A. Rousseau, et al. // Br. J. Pharmacol. - 1993. - Vol. 110. - № 3. - P. 1213-1221.
12. Anti-inflammatory effect of augmented nitric oxide production in chronic lung infection / N. Hopkins, Y Gunning, D.F. O'Croinin, et al. //J. Pathol.
- 2006. - Vol. 209. - № 2. - P. 198-205.
13. Low levels of nitric oxide and carbon monoxide in alpha 1-antitrypsin deficiency / R.F. Machado, J.K Stoller, D. Laskowski et al. // J. Appl. Physiol.
- 2002. - Vol. 93. - № 6. - P. 2038-2043.
14. Exhaled nitric oxide in patients with PiZZ phenotype-related alpha 1-antitrypsin deficiency / M. Malerba, E. Clini, G. Cremona et al. // Respir. Med. - 2001. - Vol. 95. - № 6. - P. 520-525.
15. Effect of L-arginine on leucocyte adhesion in ischemia-reperfusion injury / A. Gabriel, M.L. Por-rino, L.L. Stephenson, W.A. Zamboni // Plast. Re-const. Surg. - 2004. - Vol. 113. - № 6. - P. 1698-1702.
16. The role of L-arginine following trauma and blood loss / F. Loehe, C.J. Bruns, S.M. Nitsch, M.K. Angele // Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. — 2007. - Vol. 10. - № 1. - P. 80-87.
17. Curran, J.N. Biological fate and clinical implications of arginine metabolism in tissue healing / J.N. Curran, D.C. Winter, D. Bouchier-Hayes // Wound. Repair. Regen. - 2006. - Vol. 14. - № 4.
- P. 376-386.
