CC BY
17
УДК 616.36-003.826-036-053.2-07:575.1 DOI: 10.22141/2224-0551.15.4.2020.208470
Степанов Ю.М., Завгородня Н.Ю., Грабовська О.1., Кленна I.A., Татарчук О.М.
ДУ «1нститутгастроэнтерологи НАМН Укра'/ни», м. Дн!про, Укра/на
Роль однонуклеотидного полiморфiзму TLR4 у розвитку неалкогольноТ жировоТ хвороби печЫки в дiтей
For citation: Zdorov'e Rebenka. 2020;15(4):205-212. doi: 10.22141/2224-0551.15.4.2020.208470
Резюме. Актуальтсть. Прогресування неалкогольног жировог хвороби печнки (НАЖХП) eid простого стеатозу до стеатогепатиту eid6yeaembCH в генетично схильних mdueidyyMie вна^док порушення iмунного гомеостазу й розвитку системног i локальног запальног вiдповiдi. Несинонiмiчнi однонуклеотидт полiморфiз-ми гена TLR4, змнюючи просторову структуру протегну i, ймовiрно, чутливсть рецептора до його лiгандiв, обумовлюють певт функцюнальт аберацп, що можуть впливати на характер й активтсть запалення. Мета до^дження: вивчити асощацт SNP Asp299Gly rs4986790 гена TLR4 зi структурними змнами печнки, по-казниками вродженого iмyнiтетy та вуглеводного обмЫу в дтей iз НАЖХП. MamepiaÄU та методи. Шд спостереженням перебували 76 дтей iз надмiрною вагою та ожиртням вком вiд 9 до 17ротв. Наявтсть стеатозу печнки визначалась за допомогою транзieнтноi еластометрй. За наявтстю стеатозу печнки дти були розподшет на 2 групи, за наявтстю SNP Asp299Gly (rs4986790) гена TLR4 кожна з груп розподыена на 2 тдгрупи: дти з нормальним (Asp299Asp) та полiморфним (Asp299Gly) варiантами гена TLR4. Вмст iнсyлiнy, IL-6, IL-10, TNF-a в сироватщ кровi визначали iмyноферментним методом, розраховували ндекс HOMA-IR. Результати. Частота виявлення SNP Asp299Gly rs4986790 гена TLR4 у гетерозиготному стат серед об-стежених дтей становила 15,8 %, у дтей iз НАЖХП — 20,0 %, у дтей без стеатозу — 11,1 % (р > 0,05). Значущих вiдмiнностей показнитв жорсткостi та ступеня жировог iнфiльтрацii печнки пацieнтiв з AA та AG генотипами SNP rs4986790 гена TLR4 не знайдено (р > 0,05). У дтей iз НАЖХП iз варiантом Asp299Gly гена TLR4рiвень IL-10 був вiрогiдно вищим порiвняно з хворими з варiантом Asp299Asp гена TLR4. У той же час у дтей iз варiантом Asp299Asp без стеатозу печiнки спостерйався вiрогiдно вищий рiвень IL-6 (р < 0,05) порiвняно з особами з полiморфним варiантом Asp299Gly гена TLR4. Виявлений прямий кореляцшний зв'язок помiрноi сили мiж варiантом Asp299Gly гена TLR4 та рiвнем IL-10 (r = 0,459, p < 0,05). У дтей iз варiантом Asp299Asp гена TLR4, хворих на НАЖХП, вiдзначалися вищi значення HOMA-IR порiвняно з хворими з варi-антом Asp299Gly гена TLR4 (р > 0,05). Виявлений прямий кореляцтний зв'язок мiж рiвнем IL-6 та iнсyлiном (r = 0,398;р < 0,01), Ыдексом HOMA-IR (r = 0,364;р < 0,05) у дтей, хворих на НАЖХП. Висновки. Дти з SNP Asp299Gly TLR4, хворi на НАЖХП, характеризуются вiрогiдно вищим рiвнем продукцп IL-10 та нижчими рiвнями iнсyлiнy та HOMA-IR, що може свiдчити про протективт властивостi SNPAsp299Gly rs4986790 гена TLR4 щодо розвитку й прогресування НАЖХП.
Ключовi слова: однонуклеотидний полiморфiзм; toll-подiбний рецептор 4; неалкогольна жирова хвороба пе-чнки; дти
Вступ
Глобальна en^eMiH ожиршня призвела до виходу неалкогольно! жирово! хвороби печшки (НАЖХП) на провщш позици серед хрошчних захворювань печшки у свгговш педiатричнiй популяци [1]. НАЖХП на сьогодш вважаеться мультифакторним захворюван-
ням, ймовiрнiсть виникнення та прогресування якого обумовлюеться варiабельнiстю гешв рiзних кластерiв (асоцшованих i3 функцюнуванням жирово! ткани-ни, печшковою акумулящею жиру, запаленням, фь брогенезом, оксидативним стресом), шдивщуальною рiзноманiтнiстю мiжгенних асощацш, пов'язаних iз
© 2020. The Authors. This is an open access article under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License, CC BY, which allows others to freely distribute the published article, with the obligatory reference to the authors of original works and original publication in this journal.
Для кореспонденци: Завгородня Наталя Юривна, кандидат медичних наук, завщувач вщдшу дитячоТ гастроентерологи, ДУ «1нститут гастроентерологи НАМН УкраТни», пр. Слобожанський, 96, м. Днтро, 49074, УкраТна; e-mail: nzavgorodni75@gmail.com; конт. тел..: +38 (067) 982-71-70
For correspondence: Zavhorodnia Natalia, PhD, Head of the Department of pediatrics gastroenterology, State Institution "Institute of Gastroenterology of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine'; Slobozhanskii Avenue, 96, Dnipro, 49074, Ukraine; e-mail: nzavgorodni75@gmail.com; phone: +38 (067) 982-71-70 Full list of author information is available at the end of the article.
впливом певних факторiв зовнiшнього середовища (ri-перкалорiйне харчування, гiподинамiя) [2, 3]. Зпдно з теорieю «багатьох паралельних ударiв» прогресування НАЖХП вiд простого стеатозу до стеатогепатиту вщ-буваеться в генетично схильних iндивiдуумiв внаслщок порушення iмунного гомеостазу й розвитку системно! i локально! запально! вщповщ [4]. Тригерами та промоторами запалення можуть виступати рiзноманiтнi екзогенш та ендогеннi фактори, зокрема патогенасо-цiйованi молекулярнi структури бактерiальних аген-тiв (pathogen associated molecular patterns — PAMPs) [5]. Хдентифшащя PAMPs здшснюеться за допомогою патернрозпiзнавальних рецепторiв, у тому числi toll-подiбних рецепторiв (TLRs), що експресуються гепато-цитами, клiтинами Купфера, синусо!дальними ендоте-лiальними клiтинами, зiрчастими клiтинами печшки, холангiоцитами, ентероцитами, а також клггинами iмунно! системи. Активацiя TLR4 лшополюахаридом (LPS) клiтинно! стiнки грамнегативних бактерш шду-куе певний каскад молекулярних подш, результатом яких стае шдукщя транскрипци прозапальних генiв та запально! вщповщ.
Несинонiмiчнi однонуклеотиднi ПОЛ1МОРФ1ЗМИ (single nucleotide polymorphism — SNP) гена TLR4 призводять до замши амшокислотного залишку в по-лiпептиднiй ланщ рецептора, зм1нюючи просторову структуру проте!ну i, ймов1рно, чутлив1сть рецептора до р1зних лiгандiв, та обумовлюють певш функцюналь-н1 абераци, пов'язанi з активнютю продукци цитоюшв 1мунними кштинами, як1 можуть впливати на характер й активнють запально! в1дпов1д1. Nancy C. Arbour та ствавтори (2000) вперше надали докази пригнiчення активност запально! в1дпов1д1 на стимуляц1ю LPS ет-телiоцитiв дихальних шляхов та альвеолярних макро-фагiв людей-носив SNP Asp299Gly (rs4986790) гена TLR4 [6]. SNP (rs4986790, + 896A > G) локалiзуeться в 3-му екзош кодуючого регiону гена TLR4 людини i призводить до замiни амшокислоти в положеннi 299 (Asp299Gly). Наявнють Asp299Gly у кавказьких шдивь дуум1в змiнюe структуру позаклiтинного домену TLR4 i поеднуеться з1 змiнами афшггету рецептора до лиан-д1в та дисбалансом прозапальних та протизапальних цитоышв [7]. 1снують суперечливi повiдомлення щодо впливу SNP Asp299Gly гена TLR4 на чутливють до бак-терiальних ендотоксинiв in vitro та in vivo. Продемон-стрована асоцiацiя SNP Asp299Gly rs4986790 гена TLR4 з1 зростанням iнцидентностi бактерiальних та в1русних iнфекцiй та ризику септичного шоку, викликаного грамнегативними мiкроорганiзмами, ризику розвитку передракових уражень слизово! шлунка, колоректаль-ного раку, але виявленi протективш властивостi цього пол1морФ1зму щодо розвитку хрошчного перюдонти-ту [8—12]. Також продемонстроване значення даного пол1морФ1зму при розвитку запальних захворювань шлунка в дггей [13], хрон1чного гепатиту С [14, 15]. З шшого боку, SNP Asp299Gly гена TLR4 пов'язують 1з редукцieю ризику неiнфекцiйних захворювань, таких як атеросклероз, ревмато!дний артрит [16, 17]. У той же час метааналiз 5 европейських дослщжень не виявив асоцiативного зв'язку SNP Asp299Gly гена TLR4 з рев-
мато!дним артритом та ризиком атеросклерозу та кар-дiоваскулярних захворювань у хворих 1з ревмато!дним артритом [7, 18]. Молекулярш механiзми, що лежать в основ1 впливу SNP гена TLR4 на рецепторну функ-цш, залишаються недостатньо вивченими. Adeline M. Hajjar та спiвавтори (2017) продемонстрували, що саме рiвень експреси TLR4 людини, а не його послщовнють е ключовим фактором чутливост1 до LPS [19].
Вплив пол1морф1зм1в гена TLR4 на розвиток та пе-реб^ НАЖХП у дiтей залишаеться не дослiдженим. З урахуванням важливост рол1 TLR4 в оргашзаци ефек-тивного !мунного захисту, механiзмах прогресування захворювання вивчення рол1 SNP гена TLR4 при НАЖХП у дггей вважаеться надзвичайно актуальним, тому що вщкривае нов1 можливост1 прогнозування пе-ребiгу й удосконалення менеджменту захворювання в цих хворих.
Мета досЛдження: вивчити асощацш SNP Asp299Gly (rs4986790) гена TLR4 з1 структурними змь нами печiнки, показниками вродженого iмунiтету та вуглеводного о6м1ну в дггей !з НАЖХП.
Матерiали та методи
Шд спостереженням перебували 76 дггей !з над-м1рною вагою та ожиршням в1ком в1д 9 до 17 роыв, середнiй в1к становив 12,3 ± 2,5 року. Наявнють стеатозу печiнки визначалась за допомогою транзieнтно! еластометри апаратом FibroScan®502touch (Echosens, Францiя) !з вимiрюванням контрольованого параметра атенуаци ультразвуку (controlled attenuation parameter — CAP). За наявност НАЖХП дгга були роз-подiленi на 2 групи: 1-шу групу (основну) становили 40 пащенпв !з НАЖХП, 2-гу (пор1вняння) — 36 пацieнтiв без стеатозу печшки. За даними молекулярно-генетич-ного обстеження кожна з груп розподтена на 2 тдгру-пи: дгга з варiантом Asp299Asp та дни !з SNP Asp299Gly (rs4986790) гена TLR4 у гетерозиготному стань Групи не мали значущих вiдмiнностей за вшовим та статевим розпод1лом. Подаш для публшаци матерiали не запере-чують положенням бiоетики.
Молекулярно-генетичне дослщження з гено-типування гена TLR4 (визначення SNP Asp299Gly rs4986790) проведене на базi НД1 генетичних та Тмуно-лог1чних основ розвитку патологи та фармакогенетики ВДНЗУ «Укра!нська медична стоматолопчна акаде-м1я». Геномну ДНК видтяли з периферично! венозно! кров1, забiр яко! проводився з кубп-ально! вени в сте-рильн1 вакутайнери з1 стабiлiзатором (ЕДТА) за допомогою набора реагенпв для вщлення геномно! ДНК «ДНК-Экстран-1» («СИНТОЛ», Рошя). Пол1морфну д1лянку Asp299Gly гена TLR4 амптфшували шляхом полiмеразно-ланцюгово! реакци (ПЛР) !з викорис-танням специфiчних олионуклеотидних праймерiв (табл. 1) [20].
Амптфшащю проводили з використанням чотири-канального термостата ТП4-ПЦР-01-«Терцик» для про-ведення ПЛР-аналiзу (ТОВ «ДНК-Технология», Рос1я). Сушш для ПЛР об'емом 25 мкл мiстила 2,5 мкл 10х буферу для ампифкаци; 2 мМ хлориду магнiю; 0,2 мМ dNTP; сум1ш специфiчних олiгонуклеотидних праймерiв по
10 пкмоль/мкл кожного; 2,5 од. Taq-ДНК-полiмерази (НВО «СибЭнзим», Росiя); 20-50 нг геномно1 ДНК. У пробiрки нашаровували 25 мкл мiнерального мастила. Температура вщпалу для визначення полiморфноï да-лянки Asp299Gly гена TLR4 становила 58 °С. Полiмор-фiзм Asp299Gly гена TLR4 iдентифiкували за допомогою рестрикцшного аналiзу з використанням ендонуклеази рестрикцiï Bsp19 I (НВО «СибЭнзим», Рошя) при темпе-ратурi 37 °С впродовж 12 годин. Продукти розщеплення полiморфних дтянок гена TLR4 виявляли за допомогою електрофорезу в 3% агарозному гелi в 1х TBE-буферi (протягом 2 год при напрузi 2V на 1 см гелю). У ролi маркера молекулярноï ваги ДНК використовували pBR322/ BsuRI. Гелi забарвлювали етидаумом бромщом iз подаль-шою вiзуалiзацieю результат у УФ-свiтлi за допомогою спектрофотометра.
Вмют iнсулiну в сироватцi кровi визначали iму-ноферментним методом тест-набором фiрми DRG International, Inc. (Нiмеччина). Кльысне визначення концентрацiï IL-6, IL-10, TNF-a в сироватцi кровi проводили за допомогою iмуноферментного аналiзу (1ФА) iз використанням тест-систем ЗАТ «Вектор-бест» (м. Новосибiрськ). 1ФА виконали за допомогою аналiзатора Stat Fax 303 Plus (США). 1ндекс HOMA-IR розраховували за формулою: HOMA-IR = глюкоза на-тще (ммоль/л) х шсулш натще (мкОд/мл)/22,5.
Для оптимiзацiï математично'1' обробки результа-ти вводили в базу даних, побудовану за допомогою електронних таблиць Microsoft Excel. Статистичне опрацювання результапв виконали за допомогою пакета прикладних програм Statistica 6.1 (сершний номер AGAR909 E415822FA). Вщповщшсть розподiлу даних закону нормального розподту перевiряли за допомогою методу Шашро — Ушка. Для опису даних застосовували медiану (Me), нижнiй (Q1) та верхнш (Q2) квартилi. Порiвняння здiйснювали за допомогою непараметричного критерш Манна — Уïтнi. Статис-тичну значущють оцiнювали на рiвнi не нижчому шж 95,0 % (р < 0,05). Стушнь взаемозв'язив мiж змiнними оцiнювали за допомогою значущих коефiцieнтiв коре-ляцй' Спiрмена (r).
Результати
За результатами молекулярно-генетичного досль дження, загальна частота виявлення носшства SNP Asp299Gly (rs4986790) гена TLR4 у гетерозиготному сташ в обстежених дггей становила 15,8 % (табл. 2). Частота зусщчальносп SNP Asp299Gly (rs4986790) гена TLR4 у дггей iз НАЖХП становила 20,0 %, у дггей без стеатозу печшки — 11,1 % (р > 0,05). Гомозиготне носшство SNP Asp299Gly (rs4986790) гена TLR4 не ви-явлене в жодного обстеженого пащента.
Таблиця 1. Нуклеотидна послщовнсть длянки гена TLR4
Назва полiморфiзму гена Пряма послщовшсть Зворотна послщовшсть
TLR4 Asp299Gly 5'AGCATACTTAGACT ACTACCTCCATG3' 5'GAGAGATTTGAG TTTCAATGTGGG3'
Генотип 1-ша група (n = 40) 2-га група (n = 36) Загалом (n = 76) р
n % n % n %
АА 32 80,0 32 88,9 64 84,2 0,5
AG 8 20,0 4 11,1 12 15,8 0,3
Рисунок 1. Частота виявлення вар'ант'в Asp299Asp та Asp299Gly гена TLR4 у дтей ¡з НАЖХП (А)
та в rpyni пор1вняння (В)
Таблиця 2. Розподл генотип1в за SNP rs4986790 гена TLR4 серед обстежених па^ен^в (n = 76)
За частотою виявлення нормального Asp299Asp та полiморфного Asp299Gly-варiанта гена ПЯ4 дгти 1-1 групи вiрогiдно не вiдрiзнялись вiд 2-1 групи: серед дгтей iз НАЖХП варiант Asp299Asp зусщчався з частотою 90,0 %, варiант Asp299Gly — 10,0 %, у груш по-рiвняння частота виявлення варiанта Asp299Asp стано-вила 94,4 %, полiморфного варiанта Asp299Gly — 5,6 % (рис. 1).
Не знайдено значущих вiдмiнностей показниыв жорсткостi печiнки мiж АА та AG генотипами SNP ге4986790 гена ПЯ4 хворих iз НАЖХП, але жорсткiсть печiнки в дiтей iз НАЖХП була вищою, нiж у дгтей без стеатозу, незалежно вщ генотипу хворого (р > 0,05) (рис. 2).
Виявлеш значущi вiдмiнностi мiж 1-ю та 2-ю група-ми при порiвняннi середнiх значень САР, що характе-ризують ступiнь жирово! шфтьтраци печiнки, але вщ-мiнностi мiж пiдгрупами з рiзними генотипами ПЯ4 не були значущими (рис. 3).
Порiвняльна характеристика середнiх значень рiв-нiв прозапальних та протизапальних цитоышв сиро-ватки кровi обстежених пащенпв залежно вiд генотипу SNP ге4986790 гена ПК4 наведена в табл. 3.
Вщмшною особливiстю хворих iз НАЖХП iз ва-рiантом Asp299Gly був вiрогiдно бiльш високий рь вень вмiсту IL-10 порiвняно з хворими з варiантом Азр299Азр гена ПЯ4. У той же час у дгтей iз варiантом Азр299Азр без стеатозу печiнки спостерiгався вiроriд-но вищий рiвень IL-6 (р < 0,05) порiвняно з особами з
полiморфним варiантом Asp299Gly гена ПЯ4. Був ви-явлений прямий кореляцшний зв'язок помiрно! сили мiж варiантом Asp299Gly гена ПЯ4 та рiвнем IL-10 (г = 0,459, р < 0,05).
Слiд вщзначити, що дiти, хворi на НАЖХП, незалежно вщ генотипу SNP ге4986790 гена ПЯ4 вiдрiзня-лись вщ дiтей без стеатозу вiрогiдно вищими рiвнями iнсулiну та НОМА-Ж. У дiтей iз варiантом Азр299Азр гена ПЯ4, хворих на НАЖХП, вщзначалися вищi значення HOMA-IR порiвняно з хворими з варiантом Asp299Gly гена Т1^Я4 (р > 0,05) (табл. 4). Виявлений прямий кореляцшний зв'язок мiж рiвнем вмiсту Ш-6 та iнсулiном (г = 0,398; р < 0,01), шдексом НОМА-Ж (г = 0,364; р < 0,05) у дгтей, хворих на НАЖХП.
Обговорення
Отриманi нами даш свiдчать про те, що носшство полiморфного варiанта Asp299Gly гена ПЯ4 зустрiча-еться з частотою 15,8 % серед дттей iз надмiрною вагою та ожирiнням, i не суперечать результатам дослщження Ваг1 Feгweгda та спiвавторiв (2007), яю повщомили, що частота виявлення вказаного полiморфiзму в дорос-лих становить близько 18 % [21]. Результати нашого дослщження не виявили чтткого зв'язку SNP Asp299Gly ге4986790 гена ПЯ4 iз НАЖХП у дгтей, що збтаеться з даними Shweta Kapil та спiвавт., опублiкованими у 2016 рощ [22], але дещо суперечить даним Safak КшЬаз та спiвавторiв, яю продемонстрували превентивну роль цього полiморфiзму в розвитку НАЖХП у дорослих [23].
Таблиця 3. Залежнсть цитокнового профлю обстежених дтей вщ генотипу SNP ^4986790 гена
Показник 1-ша група, п = 40 2-га група, п = 36
АА, П = 32 AG, П = 8 АА, П = 32 AG, п = 4
^25, Q75) Me (Q25, Q75) Me ^25, Q75) Me (Q25, Q75)
^-6, пг/мл 0,6 (1,18; 4,4) 0,3 (0,23; 1,73) 1,1 (0,43; 2,2)* 0,1 (0,1; 0,1)
TNF-a, пг/мл 0,5 (0,28; 2,23) 0,15 (0,1; 0,28) 0,6 (0,2; 1,05) 0,15 (0,13; 0,18)
!Ь-10, пг/мл 1,35 (0,68; 2,55)# 4,05 (2,08; 5,28)л 4,85 (2,48; 10,5)* 2,95 (1,63; 4,28)
Прим1тки: * — р < 0,05 - р'вень значущост в'щм'нностей пор1вняно з AG-пiдгрупою 2 групи за критер1ем Манна — Уíтнi; # — р < 0,05 — рiвень значущост вiдмiнностей порiвняно з АА-пщгрупою 2-1 групи за критерieм Манна — Уíтнi; " р < 0,05 — р1вень значущост в'щм'тностей пор1вняно з АА-пщгрупою 1ч групи за критерieм Манна — Утш.
Рисунок 2. Характеристика жорсткост печ1нки залежно вщ генотипу SNP ^4986790 гена
Рисунок 3. Характеристика ступеня жировоí нфтьтрацП' печнки за показником САР залежно вщ генотипу SNP ^4986790 гена TLR4
Рецептор TLR4 е ключовим сенсором лшополь сахаридiв кштинно! стiнки грамнегативних бактерш, циркулюючих насичених вiльних жирних кислот [24, 25]. Зв'язування TLR4 з вщповщними лiгандами ш-дукуе потужний прозапальний каскад активаци фак-торiв транскрипци (NF-кВ, АР-1, IRF-3), продукци прозапальних цитокiнiв, що призводить до рекрутингу ефекторних iмуноцитiв та прогресування пошкоджен-ня печiнки (рис. 4) [26].
Крiм того, активацiя TLR4-асоцiйованих прозапальних шляхiв у метаболiчно активних тканинах призводить до порушення рецепцп iнсулiну та формування
Рисунок4. Активац1я ^Я4-сигнального шляху при НАЖХП [26]
периферично! та центрально! шсулшорезистентносп, пригнiчення секреци шсулшу Р-клгганами п^дшлун-ково! залози, сприяе активаци лiполiзу в жировiй тка-нинi, акумуляци жиру в печшщ й розвитковi атеросклерозу, формуючи порочне коло дисметаболiчних розладiв [27].
Популяцшне дослiдження з генотипуванням 621 донора чоловiчо! статi дозволило встановити зв'язок Asp299Asp генотипу ПЯ4 з тдвищеним ризиком акумуляцГ! лшщв, розвитком iнсулiнорезистентностi та метаболiчного синдрому [28]. У той же час метааналiз 15 059 суб'екпв не виявив зв'язку SNP Asp299Gly Т1^Я4 iз пiдвищенням ризику розвитку дiабету 2-го типу [29].
Вважаеться, що TLR4 забезпечуе молекулярний зв'язок мiж ожирiнням, запаленням i резистентню-тю до iнсулiну [30]. У нашому дослiдженнi пацiенти з НАЖХП iз варiантом Asp299Asp гена TLR4 вiдрiз-нялись вiд хворих iз полiморфним варiантом вищи-ми рiвнями прозапальних цитокiнiв — IL-6, TNF-a (ри > 0,05) у поеднаннi з вiрогiдно нижчими рiвнями IL-10. У пащенпв зi SNP Asp299Gly ге4986790 гена TLR4, хворих на НАЖХП, продукция IL-10 зберiгалась на вiрогiдно бiльш високому рiвнi, що поеднувалось iз бiльш низькими рiвнями прозапальних цитоюшв, по-рiвняно з хворими з Asp299Asp-варiантом гена TLR4. Був виявлений прямий кореляцiйний зв'язок помiр-но! сили мiж AG-генотипом гена TLR4 та рiвнем IL-10 (г = 0,459, р < 0,05). Дгги з НАЖХП та SNP Asp299Gly ге4986790 гена TLR4 характеризувались тенденцiею до зниження HOMA-IR та рiвня iнсулiну порiвняно з Asp299Asp-варiантом. Отриманi данi не збiгаються з даними шмецьких дослiдникiв, опублiкованими у 2010 рощ, яы продемонстрували асощацш SNP Asp299Gly ге4986790 гена TLR4 з шдвищенням загального вмiсту жиру, вюцерального жиру i незначущим зниженням чутливост до iнсулiну в ошб кавказького походжен-ня без дiабету [30]. На рис. 5 наведена власна гшотеза впливу варiанта Asp299Gly гена TLR4 на характер за-пально! вiдповiдi.
Таким чином, переби НАЖХП у пацiентiв з Asp299Asp-варiантом гена TLR4 супроводжуеться пд-вищенням продукци прозапальних цитокiнiв (TNF-a, Ш-6), дефiцитарнiстю секреци IL-10, зростанням рiв-нiв iнсулiну та HOMA-IR, що корелюють iз рiвнем IL-6 без суттевих змiн жорсткостi паренхiми печшки. На вiдмiну вiд пацiентiв iз нормальним генотипом дiти з SNP Asp299Gly гена TLR4, хворi на НАЖХП, характеризуются вiрогiдно вищим рiвнем продукци IL-10 та нижчими рiвнями iнсулiну та HOMA-IR. Загалом
Таблиця 4. Залежшсть нсулнового статусу обстеженихдтей вд генотипу SNP гз4986790 гена
Ме ^25, Q75)
Показник 1-ша група, п = 40 2-га група, п = 36
АА, п = 32 AG, П = 8 АА, П = 32 AG, п = 4
1нсулш, мкОД/мл 32,2 (24,2; 39,3)* 24,8 (17,2; 36,3)* 21,3 (14,8; 28,2) 19,4 (13,0; 28,2)
Глюкоза, ммоль/л 5,12 (5,0; 5,4) 5,08 (4,8; 5,4) 5,0 (4,5; 5,3) 5,1 (4,7; 5,4)
НОМА-^ 6,5 (4,2; 8,6)* 6,2 (3,8; 8,3)* 4,45 (3,1; 6,6) 4,1 (3,1; 6,6)
Примтка: ' на — У/тм.
р < 0,05 — значущсть в'щм'шностей пор1вняно з показниками 2-1 групи за критер1ем Ман-
TLR4
Рисунок 5. Ппотеза запально/ вщповщ:' при НАЖХП залежно вд генотипу SNP rs4986790 TLR4
з урахуванням рГвня поширеностi SNP Asp299Gly rs4986790 гена TLR4 в дитячш популяци (15,8 %) й особливостями nepe6iry захворювання у хворих з SNP Asp299Gly гена TLR4 носшство полiморфного BapiaHTa SNP Asp299Gly rs4986790 гена TLR4 супроводжуеться формуванням бгльш сприятливого метаболiчного та цитокiнового профглю i, ймовiрно, мае протективнi властивосп щодо розвитку й прогресування НАЖХП.
Висновки
1. Установлено, що частота виявлення SNP Asp299Gly rs4986790 гена TLR4 у дГтей i3 надмГрною вагою та ожи-рiнням становить 15,8 %, але мiнливiсть гена TLR4 у 299-й позицй не мае чГткого зв'язку з НАЖХП у дгтей.
2. ПеребГг НАЖХП у пащенпв зГ SNP Asp299Gly гена TLR4 супроводжуеться вГропдним шдвищенням продукци IL-10 у поеднанш з вгдносним зниженням рГвшв прозапальних цитокшв TNF-a, IL-6.
3. У дгтей Гз НАЖХП спостерГгаеться формування шсулшорезистентносп незалежно вгд генотипу TLR4, але носи SNP Asp299Gly гена TLR4 вгдрГзняються ниж-чими рГвнями HOMA-IR й шсулшу.
Конфлiкт штереав. Автори заявляють про вгдсут-нють конфлГкту штерешв та власно! фшансово! защ-кавленосп при тдготовщ дано! статп.
References
1. Nobili V, Alisi A, Valenti L, Miele L, Feldstein AE, Alkhouri N. NAFLD in children: new genes, new diagnostic modalities and new drugs. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2019;16(9):517-530. doi:10.1038/s41575-019-0169-z.
2. Fitzpatrick E. Understanding susceptibility and targeting treatment in non-alcoholic fatty liver disease in children; moving the fulcrum. Proc Nutr Soc. 2019;78(3):362-371. doi:10.1017/ S0029665118002914.
3. Stepanov YuM, Abaturov OYe, Zavgorodnia NYu, Skyrda IYu. Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in Children: Current View on Diagnostics and Treatment (Part I). Gastroenterologia. 2015; (56) :99-107. doi:10.22141/2308-2097.2.56.2015.81504. (in Ukrainian).
4. Takaki A, Kawai D, Yamamoto K. Molecular mechanisms and new treatment strategies for non-alcoholic steatohepatitis (NASH). Int J Mol Sci. 2014;15(5):7352-7379. doi:10.3390/ ijms15057352.
5. Stepanov YuM, Zavgorodnia NYu, Lukianenko OYu, Zygalo EV, Yagmur VB. Association of small intestinal bacterial overgrowth and non-alcoholic fatty liver disease in children. Gastroenterologia. 2019;53(4):266-272. doi:10.22141/2308-2097.53.3.2019.182406.
6. Arbour NC, Lorenz E, Schutte BC, et al. TLR4 mutations are associated with endotoxin hyporesponsiveness in humans. Nat Genet. 2000;25(2):187-191. doi:10.1038/76048.
7. Garcia-Bermtidez M, Lopez-Mejias R, Gonzalez-Juanatey C, et al. Lack of association between TLR4 rs4986790 polymorphism and risk of cardiovascular disease in patients with rheumatoid arthritis. DNA Cell Biol. 2012;31(7):1214-1220. doi:10.1089/dna.2011.1582.
8. Agnese DM, Calvano JE, Hahm SJ, et al. Human tolllike receptor 4 mutations but not CD14 polymorphisms are associated with an increased risk of gram-negative infections. J InfectDis. 2002;186(10):1522-1525. doi:10.1086/344893.
9. Lorenz E, Mira JP, Frees KL, Schwartz DA. Relevance of mutations in the TLR4 receptor in patients with gram-negative septic shock. Arch Intern Med. 2002;162(9):1028-1032. doi:10.1001/archinte.162.9.1028.
10. Vidyant S, Chatterjee A, Dhole TN. A single-nucleotide polymorphism in TLR4 is linked with the risk of HIV-1 infection. Br J Biomed Sci. 2019;76(2):59-63. doi:10.1080/09674845.20 18.1559486.
11.Sellers RM, Payne JB, Yu F, LeVan TD, Walker C, Mikuls TR. TLR4 Asp299Gly polymorphism may be protective against chronic periodontitis. J Periodontal Res. 2016;51(2):203-211. doi:10.1111/jre.12299.
12. Moaaz M, Youssry S, Moaz A, Abdelrahman M. Study of Toll-Like Receptor 4 Gene Polymorphisms in Colorectal Cancer: Correlation with Clinicopathological Features. Immunol Invest. 2020;49(5):571-584. doi:10.1080/08820139.2020.1716787.
13. Abaturov OYe, Gerasymenko ON, Shlykova OA, Kaidashev IP. Genetic Polymorphism of Toll-Like Receptor 4 ASP299GLY Gene Polymorphism in Children with Helicobacter pylori Infection. Zdorov'e rebenka. 2013; (49): 14-18. doi:22141/2224-0551.6.49.2013.84834. (in Ukrainian).
14. Dubinska GM, Sizov LM, Koval TI, Shlykova OA. Prevalence of gene TLR4 Asp299Gly polymorphism among patients with chronic hepatitis C in Poltava region. Actual Problems of the Modern Medicine. 2015;15(1):81-84. (in Ukrainian).
15. Sizova LM. Peculiarities of clinical and laboratory characteristics of chronic hepatitis c in patients with polymorphism Asp299Gly of TLR4 gene and Gln11Leu of TLR7 gene. Actual Problems of the Modern Medicine. 2016;16(56):183-188. (in Ukrainian).
16. Kiechl S, Lorenz E, Reindl M, et al. Toll-like receptor 4 polymorphisms and atherogenesis. N Engl J Med. 2002;347(3):185-192. doi:10.1056/NEJMoa012673.
17. Lee YH, Bae SC, Song GG. Meta-analysis demonstrates association between TLR polymorphisms and rheumatoid arthritis. GenetMolRes. 2013;12(1):328-334. doi:10.4238/2013. February. 7.2.
18. Lee YH, Bae SC, Kim JH, Song GG. Toll-like receptor polymorphisms and rheumatoid arthritis: a systematic review. Rheumatol Int. 2014;34(1):111-116. doi:10.1007/s00296-013-2666-7.
19. Hajjar AM, Ernst RK, Yi J, Yam CS, Miller SI. Expression level of human TLR4 rather than sequence is the key determinant of LPS responsiveness. PLoS One. 2017;12(10):e0186308. doi:10.1371/journal.pone.0186308.
20. Wood MJ, Powell LW, Dixon JL, Subramaniam VN, Ramm GA. Transforming growth factor-ß and toll-like receptor-4 polymorphisms are not associated with fibrosis in haemochromatosis. World J Gastroenterol. 2013;19(48):9366-9376. doi:10.3748/wjg.v19.i48.9366.
21. Ferwerda B, McCall MB, Alonso S, et al. TLR4 polymorphisms, infectious diseases, and evolutionary pressure during migration of modern humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007,-104(42).-16645-16650. doi:10.1073/pnas.0704828104.
22. Kapil S, Duseja A, Sharma BK, et al. Genetic polymorphism in CD14 gene, a co-receptor of TLR4 associated with non-alcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 2016;22(42):9346-9355. doi:10.3748/wjg.v22.i42.9346.
23. Kiziltas S, Ata P, Colak Y, et al. TLR4 gene polymorphism in patients with nonalcoholic fatty liver disease in comparison to healthy controls. Metab Syndr RelatDisord. 2014;12(3):165-170. doi:10.1089/met.2013.0120.
24. Miura K, Ishioka M, Iijima K. The Roles of the Gut Microbiota and Toll-like Receptors in Obesity and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. J Obes Metab Syndr. 2017;26(2):86-96. doi:10.7570/jomes.2017.26.2.86.
25. Abaturov OYe, Gerasymenko ON. Modulation of activity TLR4 epithelial cells of the gastric mucosa at helicobacter pylori of infection (review of literature). Sovremennaia pediatriya. 2009;(28):141-146. (in Ukrainian).
26. Bessone F, Razori MV, Roma MG. Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression. CellMolLife Sci. 2019;76(1):99-128. doi:10.1007/s00018-018-2947-0.
27. Jin C, Henao-Mejia J, Flavell RA. Innate immune receptors: key regulators of metabolic disease progression. Cell Metab. 2013;17(6):873-882. doi:10.1016/j.cmet.2013.05.011.
28. Steinhardt AP, Aranguren F, Tellechea ML, et al. A functionalnonsynonymous toll-like receptor 4gene polymorphism is associated with metabolic syndrome, surrogates of insulin resistance, and syndromes of lipid accumulation. Metabolism. 2010;59(5):711-717. doi:10.1016/j.metabol.2009.09.015.
29. Chang WW, Zhang L, Jin YL, Yao YS. Toll-like receptor 4 gene Asp299Gly and Thr399Ile polymorphisms in type 2 diabetes mellitus: A meta-analysis of 15,059 subjects: Need for clarification of data in a recent meta-analysis. Diabetes Res Clin Pract. 2015;110(3):e31-e32. doi:10.1016/j. diabres.2015.08.001.
30. Weyrich P, Staiger H, Stancakova A, et al. The D299G/ T399I Toll-like receptor 4 variant associates with body and liver fat: results from the TULIP and METSIM Studies. PLoS One. 2010;5(11):e13980. doi:10.1371/journal.pone.0013980.
Отримано/Received 03.06.2020 Рецензовано/Revised 12.06.2020 Прийнято до друку/Accepted 18.06.2020 ■
Information about authors
Yu. Stepanov, MD, PhD, Professor, Director of the State Institution "Institute of Gastroenterology of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine', Dnipro, Ukraine
N.Yu. Zavhorodnia, PhD, Head of the Department of pediatrics gastroenterology, State Institution "Institute of Gastroenterology of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine', Dnipro,
Ukraine
0.1. Grabovska, State Institution "Institute of Gastroenterology of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine'; Dnipro, Ukraine
1.A. Klenina, State Institution "Institute of Gastroenterology of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine', Dnipro, Ukraine O.M. Tatarchuk, State Institution "Institute of Gastroenterology of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine', Dnipro, Ukraine
Степанов Ю.М., Завгородня Н.Ю., Грабовская Е.И., Кленина И.А., Татарчук О.М. ГУ «Институт гастроэнтерологии НАМН Украины», г. Днепр, Украина
Роль однонуклеотидного полиморфизма Кй4 в развитии неалкогольной жировой болезни печени у детей
Резюме. Актуальность. Прогрессирование неалкогольной жировой болезни пчени (НАЖБП) от простого стеатоза до стеатогепатита происходит у генетически предрасположенных индивидуумов вследствие нарушения иммунного гомео-стаза и развития системного и локального воспалительного ответа. Несинонимические однонуклеотидные полиморфизмы гена TLR4, изменяя пространственную структуру и, вероятно, чувствительность рецептора к его лигандам, обусловливают определенные функциональные аберрации, которые могут влиять на характер и активность воспаления. Цель исследования: изучить ассоциации Asp299Gly
ге4986790 гена TLR.4 со структурными изменениями печени, показателями врожденного иммунитета и углеводного обмена у детей с НАЖБП. Материалы и методы. Под наблюдением находились 76 детей с избыточным весом и ожирением в возрасте от 9 до 17 лет. Наличие стеатоза печени определялось с помощью транзиентной эластометрии. По наличию стеа-тоза печени дети были разделены на 2 группы, по наличию 8КР Asp299Gly (ге4986790) гена TLR4 каждая из групп разделена на 2 подгруппы: дети с нормальным (А8р299А8р) и полиморфным (Asp299Gly) вариантами гена TLR.4. Содержание инсулина, 1Ь-6, П-10, ТКБ-а в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом, рассчитывали индекс НОМА-Ш.. Результаты. Частота выявления Asp299Gly ге4986790 гена TLR.4 в гетерозиготном состоянии среди обследованных детей составила 15,8 %, у детей с НАЖБП — 20,0 %, у детей
без стеатоза — 11,1 % (р > 0,05). Значимых различий показателей жесткости и степени жировой инфильтрации печени пациентов с АА и AG генотипами 8КР ге4986790 гена TLR4 не найдено (р > 0,05). У детей с НАЖБП с вариантом Asp299Gly гена TLR4 уровень П-10 был достоверно выше по сравнению с больными с вариантом А$р299А$р гена TLR.4. В то же время у детей с вариантом А8р299А8р без стеатоза печени наблюдался достоверно более высокий уровень 1Ь-6 (р < 0,05) по сравнению с лицами с полиморфным вариантом Asp299Gly гена TLR.4. Обнаружена прямая корреляционная связь умеренной силы между вариантом Asp299Gly гена TLR4 и уровнем П-10 (г = 0,459, р < 0,05). У детей с вариантом А8р299А8р гена TLR4, больных НАЖБП, отмечались более высокие значения НОМА-Ш по сравнению с больными с вариантом Asp299Gly гена TLR.4 (р > 0,05). Обнаружена прямая корреляционная связь между уровнем П-6 и инсулином (г = 0,398; р < 0,01), индексом НОМА-Ш (г = 0,364; р < 0,05) у детей, больных НАЖБП. Выводы. Дети с НАЖБП и Asp299Gly гена TLR.4 характеризуются достоверно более высоким уровнем продукции П-10 и низкими уровнями инсулина и НОМА-Ш, что может свидетельствовать о протективных свойствах 8КР Asp299Gly ге4986790 гена TLR4 в развитии и прогрессирова-нии НАЖБП.
Ключевые слова: однонуклеотидный полиморфизм; ЮП-подобный рецептор 4; неалкогольная жировая болезнь печени; дети
Yu.M. Stepanov, N.Yu. Zavhorodnia, O.I. Grabovska, I.A. Klenlna, O.M. Tatarchuk
State Institution "Institute of Gastroenterology of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine", Dnlpro, Ukraine
The role of single nucleotide polymorphism TLR4 in the development of the non-alcoholic fatty liver disease in children
Abstract. Background. The TLR4 non-synonymous single nucleotide polymorphism (SNPs) changes the spatial structure and, probably, the sensitivity of the receptor to its ligands, determines the certain functional aberrations that can affect the nature and activity of inflammation. The purpose of the study was to examine the associations of the SNP Asp299Gly rs4986790 of the TLR4 gene with liver structural changes, innate immunity, and carbohydrate metabolism parameters in children with NAFLD. Materials and methods. The study included 76 children with overweight and obesity aged 9 to 17 years. The presence of liver steatosis was determined using transient elastometry. According to the presence of liver steatosis, the children were divided into 2 groups; following the presence of SNP Asp299Gly (rs4986790) of the TLR4 gene, each group was divided into two subgroups: children with normal (Asp299Asp) and polymorphic (Asp299Gly) variants of the TLR4 gene. The blood serum content of insulin, IL-6, IL-10, TNF-a was determined by enzyme immunoassay, the HOMA-IR index was calculated. Results. The SNP Asp299Gly rs4986790 of the TLR4 gene detection rate in the heterozygous state among all children was 15.8 %, in children with NAFLD — 20.0 %, and in children without steatosis — 11.1 % (p > 0.05). Significant differences in the stiffness and degree of fatty liver in patients with AA and AG SNP
rs4986790 genotypes were not found (p > 0.05). In children with NAFLD with the Asp299Gly variant of the TLR4 gene, the level of IL-10 was significantly higher compared to patients with the As-p299Asp variant of the TLR4 gene. At the same time, in children with the Asp299Asp variant without liver steatosis, a significantly higher level of IL-6 concentration was observed (p < 0.05) compared with individuals with the TLR4 gene Asp299Gly polymorphic variant. A moderate direct correlation was found between the Asp299Gly variant of the TLR4 gene and IL-10 level (r = 0.459, p < 0.05). In children with the Asp299Asp variant of the TLR4 gene with NAFLD, higher HOMA-IR values were observed compared to patients with the Asp299Asp variant of the TLR4 gene (p > 0.05). A direct correlation was found between the level of IL-6 and insulin (r = 0.398; p < 0.01), the HOMA-IR index (r = 0.364; p < 0.05) in children with NAFLD. Conclusions. Children with NAFLD and SNP Asp299Gly rs4986790 TLR4 are characterized by significantly higher levels of IL-10 production and lower levels of insulin and HOMA-IR, which may indicate the protective properties of the SNP Asp299Gly rs4986790 TLR4 in the NAFLD development and progression.
Keywords: single nucleotide polymorphism; toll-like receptor 4; non-alcoholic fatty liver disease; children
