CC BY
37
Т. А. ПЕТРОПАВЛОВСКАЯ1, И. Л. ЧЕРЕДНИК1, Ю. Р. ШЕЙХ-ЗАДЕ1, С. К. БОГУС2, О. А. ДОЛЬСКАЯ2
РОЛЬ нейрогенного звена в механизме антиаритмического влияния анилокаина
кафедра нормальной физиологии, 2кафедра фармакологии Кубанского государственного медицинского университета, г. Краснодар, ул. Седина, 4. Тел. 8-918-39-41-419
В острых опытах на наркотизированных и искусственно вентилируемых кошках изучали влияние местного анестетика анилокаина на нейрогенную фибрилляцию предсердий. Анилокаин проявлял продолжительную противофибрилляторную активность, четко коррелирующую по силе и времени с его холиноблокирующим влиянием. Анилокаин обладал также выраженным мем-бранотропным действием, проявляющимся в дозозависимом угнетении натриевых, кальциевых и калиевых трансмембранных ионных токов через потенциалоуправляемые ионные каналы нейронов моллюска. На основании полученных результатов можно сделать заключение, что в основе антиаритмического эффекта анилокаина лежит прежде всего подавление ионной проницаемости мембраны в нейронах вегетативной нервной системы, опосредующих аритмогенные влияния на электрогенез миокарда.
Ключевые слова: анилокаин, нейрогенная фибрилляция предсердий, антиаритмическое действие, нейроны моллюска, ионные токи.
T. A. PETROPAVLOVSKAYA1,I. L. CHEREDNIK1, YU. R. SHEIKH-ZADE1, S. К. BOGUS2, O. A. DOLSKAYA2
ROLE OF THE NEUROGENIC LINK IN MECHANISM OF ANTIARRHYTHMIC INFLUENCE OF ANILOCAIN
1Chair of normal physiology, 2Chair of pharmacology, Kuban State Medical University,
Krasnodar, 4 Sedina str. Тел. 8918-39-41-419.
In acute experiments on anesthetized and artificially ventilated cats the influence of local anesthetic anilocain on neurogenic atrial fibrillation was studied. Anilocain revealed a long antifibrillation activity, which strictly correlated by strength and time with its vagolytic activity. Anilocain possessed a high pronounced membrane tropic activity, revealed in dose-dependent suppression of Na+-, K+- and Ca2+-ionic currents via potential-controlled ion channels of the neurons of the great pond snail. On basis of the received data it can be concluded, that the base of antiarrhythmic effect of anilocain lies first of all in suppression of the ion penetration of membrane in neurons of vegetative nervous system, mediated their arrhythmogenic influence on myocardial electrogenesis.
Key words: anilocain, neurogenous atrial fibrillation, antiarrhythmic effect, neurons of the mollusk, ionic currents.
Введение
Ранее в экспериментах на кошках нами было исследовано антиаритмическое действие местных анестетиков лидокаина, дикаина и леокаина [5, 10] на модели нейрогенной фибрилляции предсердий (НФП) [9, 12], рекомендованной Фармакологическим комитетом МЗ РФ в качестве стандартной методики для скрининга новых антиаритмических средств [2].
Ключевым механизмом антиаритмического эффекта анестезирующих веществ традиционно считается их миотропное влияние, обусловленное угнетением быстрого натриевого тока (1Ма) в кардиомиоцитах и сопровождающееся уменьшением длительности потенциала действия и рефрактерности миокарда [6, 8]. Однако в условиях НФП противофибрилляторный эффект всех исследованных нами анестетиков [5, 10] был четко связан не с кардиотропным, а с нейротропным действием, проявляющимся в блокаде хронотропного эффекта (ХЭ) блуждающего нерва (БН). Полученный факт явился аргументом для предположения, что в основе антиаритмического эффекта местно-анестезирующих средств лежит прежде всего подавление ими ионной проницаемости мембраны в нейронах вегетативной нервной системы, опосредующей аритмогенные влияния на электрогенез миокарда [14].
Анилокаин (2-броманилид-3-диэтиламинопропановой кислоты гидрохлорид) является анестетиком широкого спектра действия, обладающим небольшой острой токсичностью и превосходящим по продолжительности и глубине анестезирующего влияния лидокаин, тримекаин и новокаин [7]. Поэтому, исходя из наших представлений о ключевой роли нейрогенного звена в механизме развития сердечных аритмий [14], глубокое анестезирующее действие анилокаина должно сочетаться с выраженной антиаритмической эффективностью, обусловленной угнетением трансмембранных ионных токов в нейронах вегетативной нервной системы.
В связи с вышеизложенным целью настоящей работы явилось исследование антиаритмического действия анилокаина на НФП, а также изучение влияния анилокаина на основные ионные токи в нейронах ганглиев моллюсков, мембранные свойства которых не имеют принципиальных отличий от таковых у теплокровных животных [4].
Методика исследования
Первая часть исследования проводилась на 8 искусственно вентилируемых кошках обоего пола массой 3,0-4,0 кг, находившихся под хлоралозо-нембутало-вым наркозом (75+15 мг/кг внутрибрюшинно) в условиях
Кубанский научный медицинский вестник № 1 (106) 2009 УДК 612.014.465-092.8
Кубанский научный медицинский вестник № 1 (106) 2009
автоматического поддержания температуры тела на уровне 37° С. Через яремную и бедренную вены животным вводили в правое предсердие 2 биполярных платиновых зонда, один из которых служил для раздражения миокарда, а другой - для регистрации внут-рипредсердной ЭКГ. Для получения НФП на эндокард правого предсердия наносили 2 электрических импульса (5 мс, 4 порога) с интервалом 40 мс на фоне вагусной остановки сердца, вызываемой ритмичной стимуляцией шейного отдела правого БН (2 мс, 40 Гц, 6 порогов) с помощью универсального электростимулятора ЭСУ-2 (Россия). Запись внутрипредсердной ЭКГ производили через кардиоинтервалометр на самописце Н338-2 (Россия), а визуальный контроль событий - с помощью 8-канального индикатора ИМ-789 (Литва).
Анилокаин вводили внутривенно в дозе 3,5 мг/кг. В начале эксперимента, а также через 5, 30, 60 и 120 минут после введения вещества определяли интервалы Р-Р и Р^ ЭКГ, порог возбуждения и эффективный рефрактерный период предсердий, время синоатриального проведения возбуждения [15], порог возбуждения БН и компоненты его ХЭ [11], а также длительность НФП. Синхронизирующий компонент хронотропного влияния БН оценивали по скачкообразному удлинению текущего интервала Р-Р при нанесении на нерв 3 электрических импульсов (2 мс, 6 порогов, 40 Гц) синхронно с зубцом Р ЭКГ. Выраженность тонического компонента ХЭ БН определяли по максимальному приросту предсердного цикла после исчезновения синхронизирующего компонента.
Вторая часть исследования проводилась на изолированных неидентифицированных нейронах брюхоногого моллюска прудовика обыкновенного ^утпаеа 8(адпа11з). Для выделения нейронов использовался способ М. А. Костенко (1972), позволяющий сохранять
жизнеспособность и электрогенные свойства клеток на протяжении нескольких суток.
В ходе экспериментов из тела моллюсков вырезалось окологлоточное кольцо нервных ганглиев, которое после обработки 0,25%-ным раствором трипсина помещалось в раствор «Рингер К» ^аС! - 100 мМ, КС1 - 5 мМ, СаС12 - 2 мМ, МдС12 - 1,5 мМ, Тпв-ОН - 2 мМ; рН=7,5). Через 5-10 минут ганглии механически разделялись под бинокулярным микроскопом при помощи вольфрамовых игл и полиэтиленовой микропипетки. Полученные нейроны обладали высокой жизнеспособностью и сохраняли свои электрические характеристики в течение 1-3 суток. С раствором в полиэтиленовой микропипетке контактировал агаровый мостик с непо-ляризующимся хлорсеребряным электродом, через который с помощью усилителей поддерживался фиксированный потенциал. Помещенный в камеру второй электрод использовался для регистрации ионных токов с помощью усилителя-преобразователя «ток - напряжение». Для измерения трансмембранных ионных токов применялся метод внутриклеточной перфузии изолированных нейронов и фиксации мембранного потенциала [3]. Блок-схема установки для регистрации ионных токов представлена на рисунке.
Изолированная живая клетка помещалась на полиэтиленовую пипетку при фиксированном потенциале на уровне -80 мВ (при изучении кальциевых и натриевых токов) и -70 мВ (при изучении медленных калиевых токов). Амплитуда тестирующих сдвигов потенциала достигала соответственно ±10, ±10 и +30 мВ. В микропипетке создавались толчки отрицательного гидростатического давления, вследствие которого в области поры мембрана разрушалась, создавая электрический контакт неполяризующего-ся электрода с внутриклеточным содержимым. При
Блок-схема установки для регистрации трансмембранных ионных токов.
1 - камера (полиэтиленовая пипетка, нейрон, кювета с перфузирующим раствором, электроды),
2 - усилители для фиксации потенциала,
3 - осциллограф С1-93 (Россия),
4 - программируемый генератор импульсов ПГИ-100 (Россия),
5 - блок питания усилителей для фиксации потенциала,
6 - персональный компьютер,
7 - принтер
Влияние анилокаина (3,5 мг/кг) на физиологические свойства предсердий, ХЭ БН и длительность НФП у кошек (n=8, M±m)
Изучаемые показатели Исходные значения (100%) Динамика показателей во времени (мин) после введения вещества
5 30 60 120
Интервал Р-Р ЭКГ, мс 352±4 456±37 (129)* 389±15 (111)* 358±5 (102) 355±4 (101)
Порог раздражения миокарда, мВ 400±40 620±90 (155)* 410±40 (103) 410±40 (102) 440±60 (110)
Эффективный рефрактерный период миокарда, мс 134±5 168±15 (125)* 138±5 (103) 137±6 (102) 134±7 (100)
Время синоатриального проведения возбуждения, мс 20±0,5 25±1 (125)* 22±1 (110)* 21±1 (105) 20±0,4 (100)
Интервал Р^ ЭКГ, мс 72±2 81±2 (113)* 77±1 (107)* 73±2 (101) 73±2 (101)
Порог раздражения БН, мВ 400±40 610±50 (152)* 410±40 (103) 400±40 (100) 400±40 (100)
Синхронизирующий компонент ХЭ БН, мс 254±25 37±5 (15)* 159±29 (62)* 242±28 (95)* 252±26 (99)
Тонический компонент ХЭ БН, мс 104±16 14±2 (14)* 79±18 (76)* 95±19 (91)* 104±19 (100)
Длительность НФП, с 242±64 7±2 (3)* 158±39 (65)* 230±61 (95)* 236±63 (97)
Примечание: в скобках - значения в процентах относительно исходного уровня; * - р<0,05 по сравнению с исходными данными.
гиперполяризующем сдвиге мембранного потенциала на экране осциллографа визуально определялись емкостные токи мембраны и неспецифический ток утечки, который «вычитали» из общего тока. При переключении тестирующего импульса на деполяризацию регистрировался входящий натриевый и кальциевый, а также выходящий быстрый и медленный калиевый токи. После регистрации суммарных ионных токов производилась замена диализирую-щего и перфузирующего растворов на растворы для регистрации конкретного тока. Выделение чистых кальциевых или натриевых токов со стабильными параметрами происходило через 3-5 минут после полной замены растворов. Затем раствор в камере, где находился нейрон, заменялся на раствор с ани-локаином. Регистрировали значения ионных токов при действии анестетика после стабилизации ионной проницаемости, продолжающейся 2-3 минуты. После этого производили замену на раствор с возрастающей концентрацией, а в конце - на исходный и наблюдали динамику восстановления ионных токов.
Изучали влияние анилокаина в концентрациях от 0,1 до 1000 мкМ на быстрые натриевые (п=12), медленные калиевые (п=6) и быстрые кальциевые (п=10) токи при внеклеточном действии на нейроны.
Результаты исследования обрабатывали статистически методом прямых разностей с определением средней арифметической (М), стандартной ошибки (±т) и показателя достоверности различий (р) [1].
Результаты исследования
В опытах на кошках через 5 минут после введения анилокаина происходило снижение продолжительности НФП до 3% от исходного уровня (р<0,05) при одновременном подавлении параметров авто-матии, возбудимости и проводимости миокарда, а также резком угнетении обоих компонентов ХЭ БН (табл. 1).
Через 30 минут антиаритмическое влияние анилокаина снижалось, поскольку длительность НФП на этом этапе контроля составляла 65% от исходного уровня (р<0,05) на фоне уже менее выраженного холиноблокирующего действия и полного восстановления возбудимости миокарда предсердий. Через 1 час все показатели кардиотропного влияния анилокаина восстанавливались до исходного уровня, но при этом еще сохранялся незначительный антиаритмический эффект, сочетавшийся с небольшим снижением тонического и синхронизирующего компонентов вагусного ХЭ. Через 2 часа продолжительность НФП, показатели функционального состояния сердца и ХЭ БН не имели достоверных отличий от исходного уровня.
В экспериментах на изолированных нейронах моллюска исходные средние значения кальциевых, натриевых и калиевых токов составляли соответственно около 15, 15 и 40 нА. Динамику установившихся трансмембранных ионных токов при воздействии анилокаина описывали в процентах по отношению к фоновому уровню, принятому за 100%.
Кубанский научный медицинский вестник № 1 (106) 2009
Кубанский научный медицинский вестник № 1 (106) 2009
Влияние анилокаина на трансмембранные ионные токи в нейроне брюхоногого моллюска Lymnaea 8(адпаНэ
Ионные токи (n) Статистические показатели Амплитуда ионных токов (%) при внеклеточной концентрации анилокаина в мкМ ЕС^ мкМ ЕС^ мкМ
0,1 1 10 100 1000
Са++ М± 90,4* 93,1* 88,7* 74,58* 47,8* 864,3 1974,5
(10) m 2,35 2,42 3,26 3,85 3,41 89,1 167,6
Na+ М± 89,98* 88,8* 83,67* 63,63* 43,2* 685,9 1657,7
(12) m 4,55 2,3 3,27 6,61 4,97 22,3 120,9
K+ М± 105,0 106,0 103,19 94,0* 51,62* 1012,4 1953,9
(6) m 4,8 4,2 5,7 2,9 7,3 121,2 141,7
Примечание: 1) п - количество наблюдений;
* - р<0,05 по сравнению с исходным значением, равным 100%.
Как следует из таблицы 2, анилокаин в концентрациях 0,1^1000 мкМ обладал достоверным мембра-нотропным действием, проявляющимся в изменении трансмембранных ионных токов через потенциалоуправляемые ионные каналы нейронов моллюска. При этом обратимость эффектов угнетения кальциевых и натриевых ионных токов достигала соответственно 90,5±5,58% и 95,4±3,69% от исходного уровня через 5-7 минут после отмывания препарата исходным раствором.
Влияние анилокаина на медленные калиевые токи носило менее выраженный характер, достигая достоверных значений при концентрации анилокаина 100 и более мкМ. Обратимость эффекта угнетения калиевых токов через 7-8 минут отмывания препарата достигала 90±14% от исходного значения.
Обсуждение результатов
Как следует из полученных фактов, анилокаин в условиях НФП обнаруживает продолжительную противофиб-рилляторную активность, резко выраженную уже через 5 минут после инфузии, а также четко коррелированную по силе и времени с его холиноблокирующим влиянием.
Результаты исследования на моллюсках подтвердили наше предположение о подавлении трансмембранных ионных токов нейронов вегетативных ганглиев при действии анилокаина. Молекулярный механизм подавления ионных токов может быть объяснен снижением количества функционирующих каналов вследствие связывания молекул анилокаина со структурами ионных каналов [16]. Изменение кинетики развития ионных токов не исключает возможности угнетения ионных токов и в результате уменьшения времени открытого состояния ионных каналов или снижения частоты их открывания. В высоких концентрациях анилокаин подавлял ионные токи примерно в равной степени, что свидетельствует об отсутствии избирательности влияния анестетика на разные ионные каналы.
Таким образом, мембранотропное действие анилокаина способствует расширению представлений о механизме противофибрилляторного действия анестетиков, антиаритмический эффект которых обусловлен не только традиционно предполагаемым кардиотроп-ным влиянием, но и выраженным воздействием на нейротропное звено в механизме развития сердечных
аритмий. Поэтому согласно предложенной нами гипотезе происхождения тахиаритмий сердца [13] можно утверждать, что антиаритмическое влияние анилокаина является результатом ослабления гиперрефлектор-ных эффектов вегетативной нервной системы, вызывающих критическое сближение во времени входящих и выходящих ионных токов в кардиомиоцитах.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гланс С. Медико-биологическая статистика: Пер. с англ. -М.: Практика. - 1998. - 459 с.
2. КаверинаН. В., Бердяев С. Ю., КищукЕ. П., Пасхина О. Е. Экспериментальное изучение новых антиаритмических средств // Ведомости фармакологического комитета. - 1998. - № 2. -С. 11-18.
3. Костенко М.А. Выделение одиночных нервных клеток моллюска (Lymnaea stagnalis) для дальнейшего культивирования // Цитология. - 1972. - Т. 14. - № 28. - С. 1274-1278.
4. Костюк П. Г., Крышталь О. А. Механизмы электрической возбудимости нервной клетки. - М.: Наука. - 1981. - 208 с.
5. Леонидов Н. Б., Галенко-Ярошевский П. А., Шейх-Заде Ю. Р. и др. Сравнительная оценка антиаритмического действия КЛН-93, дикаина и лидокаина в условиях нейрогенной фибрилляции предсердий // Бюл. экспер. биол. и мед. - 1997. - Т. 124. -№ 7. - С. 77-80.
6. Метелица В. И. Справочник по клинической фармакологии сердечно-сосудистых лекарственных средств. - М.: Мед-практика. - 1996. - 784 с.
7. Панцуркин В. И., Алексеева И. В. Анилокаин, поиск, свойства. Начальный опыт применения лекарственных форм в медицинской практике. - Пермь: ГОУ ВПО «ПГФА Росздрава». - 2006. - 174 с.
8. Фогорос Р. Н. Антиаритмические средства: Пер. с англ. -М.; СПб: БИНОМ-Невский Диалект. - 1999. - 190 с.
9. Чередник И. Л. Модель нейрогенной фибрилляции предсердий для исследования антиаритмической эффективности лекарственных средств // Progress in Biomedical Reseach. - 1999. -Т. 4. - № 1. - С. 13.
10. Чередник И. Л., Барташевич В. В., Шейх-Заде Ю. Р., Га-ленко-Ярошевский П. А. Антиаритмическое действие дикаина и лидокаина // Человек и лекарство: Тез. докл. IV Рос. нац. конгр. -М., 1997. - С. 303.
11. Шейх-Заде Ю. Р., Чередник И. Л. Компоненты отрицательного хронотропного влияния блуждающего нерва на сердце и способ их определения // Физиол. журн. им. И. М. Сеченова. -1996. - Т. 82. - № 10. - С. 58-63.
12. Шейх-Заде Ю. Р., Чередник И. Л. Методика получения нейрогенной фибрилляции предсердий у теплокровных животных // Вестник аритмологии. - 1998. - № 8. - Сообщение 473. - С. 121.
13. Шейх-Заде Ю. Р., Галенко-Ярошевский П. А., Чередник И. Л. Фибрилляция предсердий: новое объяснение старого явления // Бюл. экспер. биол. и мед. - 2002. - Т. 134. - № 7. - С. 4-8.
14. Шейх-Заде Ю. Р., Чередник И. Л., Галенко-Ярошевский П. А. Значение нейротропного компонента в терапевтическом действии антиаритмических средств // Бюл. экспер. биол. и мед. - 1999. -Т. 127. - № 3. - С. 353-356.
15. Strauss H. G., Bigger J. T., Saroff A. L., Giardina E.-Y. V. Electrophysiologic evaluation of sinus node function in patients with sinus node dysfunction // Circulation. - 1976. - Vol. 53. - № 5. -P. 763-776.
16. Yarov-Yarovoy V., Brown J., Sharp E. M. et al. Molecular determinants of volta dependent gating and binding of pore-blocking drugs in transmembrane segment IIIS6 of Na(+) channel alpha subunit // J. Biol. Chem. - 2001. - Vol. 5. - № 276 (1). - P. 20-27.
Поступила 05.12.2008
Т. М. ПОКРОВСКАЯ, А. В. ПОГРЕБНЯК, Э. Ф. СТЕПАНОВА
РАСЧЕТ ВОЗМОЖНОГО ВЗАИМНОГО ВЛИЯНИЯ КОМПОНЕНТОВ В КОМПОЗИТНЫХ ТАБЛЕТКАХ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ МЕТОДАМИ МОЛЕКУЛЯРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ И КВАНТОВОЙ ХИМИИ
Кафедра фармакологии Курского государственного медицинского университета; кафедра технологии Пятигорской государственной фармацевтической академии
Предложен новый способ оценки взаимного влияния компонентов лекарственной формы на химическую деструкцию, заключающийся в сравнительном анализе рассчитанных квантово-химическим методом энергетических характеристик граничных молекулярных орбиталей.
Исследовано взаимное влияние компонентов твёрдой лекарственной формы комплексного анальгетика на основе ибу-профена (КАНОИ). Ранжирование соединений-ингредиентов по степени их электрондонорной, электронакцепторной способности, а также по критерию их химической жесткости позволяет качественно и количественно оценивать влияние каждого вещества на общую стабильность смеси многокомпонентного анальгетика на основе ибупрофена. Сравнение теоретически найденной стабильности и химической активности веществ с их фактическим количественным содержанием позволяет сделать однозначные выводы в пользу данного соотношения компонентов.
Ключевые слова: комплексный анальгетик, геометрия молекул, энергетическая щель, молекулярная орбиталь, химическая активность.
T. M. POKROVSKAYA, A. V. POGREBNYAK, E. F. STEPANOVA
ASSESSMENT OF POTENTIAL MUTUAL COMPONENTS' INFLUENCE IN COMPOSITE TABLETS WITH ANTI-INFLAMMATORY EFFECTS BY THE METHODS OF MOLECULAR MODELING
AND QUANTUM CHEMISTRY
Department of Pharmacology Kursk State Medical University, Department of Technology Pyatigorsk State
Pharmacetiutical Academy
A new way in assessment of mutual components’ influence of a medicinal form on the chemical destruction, consisting in comparative analysis of the power characteristics of boundary molecular orbitals calculated by quantum-chemical method is offered.
Mutual components’ influence of the solid medicinal form of a complex analgetic on the basis of Ibuprofen (CAOBI) was investigated. Ranging of bonds-ingredients by the degree of their electron-donating, electron-accepting abilities and chemical rigidity gives us the possibility of qualitative and quantitative assessment of each component’s effect on the general stability of complex analgetic mixture. Comparison of theoretically determined stability and activity of these substances with their actual quantitative content allows us to draw unequivocal conclusions in favor of yielded relations between the components.
Key words: complex analgetic, molecular geometry, energy gap, molecular orbital, reactivity.
Хранение любого лекарственного препарата, особенно комбинированного состава, неизбежно сопровождается процессами деструкции его компонентов под действием внешних факторов (химических и физических), а также в результате внутренних процессов окислительно-восстанови-
тельного взаимодействия между отдельными его составляющими.
В настоящей работе мы предлагаем новый способ теоретического анализа взаимного влияния компонентов лекарственной формы (таблеток), основанный на сравнении тонкого электронного строения молекул,
Кубанский научный медицинский вестник № 1 (106) 2009 УДК 615.014.21: 615.212
