CC BY
43УДК 616.33-006.6-07.001.8 ББК 569.433.2
И.И. Быков,
к.м.н, врач-хирург университетской клинической больницы № 1 Первого МГМУим. И.М. Сеченова
I.I. Bykov,
PhD, the surgeon of university hospital № 1 of the First MSMUnamed after I.M. Sechenov
РОЛЬ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ В ОПРЕДЕЛЕНИИ ТАКТИКИ ХИРУРГИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЖЕЛУДКА
THE ROLE OF MOLECULAR-GENETIC MARKERS IN THE DETERMINING OF SURGICAL TREATMENT OF STOMACH CANCER PATIENTS
КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ:
Игорь Игоревич Быков, врач-хирург университетской клинической больницы № 1 Адрес: 119435, г. Москва, ул. Большая Пироговская, д. 6, стр. 1 Телефон: 8-499-248-42-28 E-mail: dok.ukbl@mail.ru
Аннотация. В данной работе затрагивается проблема определения способов хирургического лечения больных раком желудка.
Annotation. This article deals with the problem of determining of surgical treatment of the stomach cancer patients.
Ключевые слова. Рак желудка, molecular-genetic markers. Key words. Stomach cancer, молекулярно-генетические маркеры.
В структуре онкологической заболеваемости в России рак желудка занимает 2-е место после рака легкого у мужчин и 3-е место после рака молочной железы и меланомных новообразований у женщин.
В России ежегодно регистрируется 40—50 тысяч новых случаев рака желудка. Более половины пациентов с диагнозом рака желудка поступают на лечение с III или IV стадией заболевания, когда хирургическое лечение малоэффективно.
В структуре онкологической смертности населения России рак желудка у мужчин и женщин занимает 2-е место. Ежегодно в России около 45 тысяч больных умирает от этого заболевания [2].
Улучшение результатов лечения рака желудка во многом связывают с диагностикой и лечением ранних стадий рака желудка [6].
При этом ранние формы рака желудка характеризуются отсутствием патогномоничных клинических симптомов и низкой дифференциально-диагностической ролью лабораторных исследований.
Решающую роль в диагностике рака желудка играют рентгенологическое и эндоскопическое исследования с гистологическим анализом биоптатов [5].
В основе установления диагноза лежат патоги-стологические критерии, в то же время остается
нерешенным вопрос объективной трактовки морфологических изменений слизистой, особенно при тяжелой дисплазии в условиях хронического воспаления и при подслизистом росте опухоли [1].
Вышесказанное подтверждается и данными японских исследователей. В Японии выявляемость раннего рака желудка наиболее высокая в мире, при этом уровень «пропущенных» случаев раннего рака желудка оценивается в 19% [7].
Все перечисленное диктует необходимость поиска дополнительных критериев и методов диагностики рака желудка.
В последнее время большое значение начинают приобретать молекулярно-генетические маркеры, основанные на использовании ДНК и РНК технологий. К этим онкологическим маркерам можно отнести структурные повреждения, выявляемые в геноме опухолевой клетки. Подобные повреждения приводят к изменению экспрессии генов-регуляторов клеточного цикла, к повреждению генов, кодирующих адгезионные белки и факторы активности неоангиогенеза. В связи с этим происходит изменение показателей метастатической и инвазивной активности, аномальное метилирование регуляторных областей генов-супрессоров, изменение активности
и экспрессии теломеразы в клетках опухолей [3]. Подобные онкологические маркеры являются достаточно чувствительными и специфичными, просты в лабораторном исследовании, однако их применение требует тщательной научной разработки и подготовки для внедрения в клиническую практику.
На сегодняшний день решение проблемы ранней диагностики рака желудка лежит на стыке нескольких дисциплин: молекулярной генетики, биохимии и хирургии рака желудка. Для этого необходимо создать систему молекулярно-генетических, им-муногистохимических и биохимических маркеров, определяемых в биоптатах слизистой желудка, которые помогут в более короткие сроки с большим процентом точности подтвердить или опровергнуть диагноз рака желудка, дополнив тем самым результаты гистологического исследования [4].
Цель исследования — улучшить результаты лечения больных раком желудка за счет внедрения молекулярно-генетических методов анализа слизистой желудка для комплексной дифференциальной диагностики рака на дооперационном этапе.
Задачи исследования следующие.
1. Разработать панель молекулярно-генетических маркеров для оценки изменений слизистой у больных раком желудка, для чего оценить частоту метилирования генов-супрессоров СБН1, ИАББ¥1А, МЬН1, N33, БАРК, экспрессию генов металлопротеиназ ММР7, ММР9, БШС5, ТР53, РТОБ2, кТЕЯТ, а также активность теломеразы в операционном материале у больных раком желудка и в биоптатах слизистой желудка у больных неопухолевыми заболеваниями.
2. Определить связь исследуемых маркеров (аномального метилирования генов СБН1, ДАББГМ, МЬН1, N33, БАРК и экспрессии генов металлопротеиназ ММР7, ММР9, БШС5, ТР53, РТОБ2, кТЕЯТ, а также активности теломеразы) с основными клиническими показателями и морфологическими характеристиками опухоли у больных раком желудка.
3. Изучить диагностическое значение полученной панели молекулярно-генетических маркеров в морфологически нормальной пограничной ткани у больных, оперированных по поводу рака желудка.
4. Установить возможность и целесообразность использования выбранной панели молекулярно-ге-нетических маркеров для предоперационной диагностики у больных с подозрением на рак желудка в материале биоптатов, полученных при эндоскопическом исследовании.
5. Оценить перспективы использования молекулярно-генетических маркеров для уточнения хирургической тактики лечения больных раком желудка.
Всего в исследование было включено 156 пациентов с нозологиями: рак желудка — 106 пациентов (группа исследования) и желчнокаменная болезнь — 50 пациентов (группа сравнения), находившихся в Клинике факультетской хирургии им.
Н.Н. Бурденко УКБ № 1 ГБОУ ВПО ПМГМУ им. И.М. Сеченова в период с декабря 2008 г. по декабрь 2010 г.
Все 106 пациентов группы исследования (больные раком желудка) прошли стандартное обследование, которое включало лабораторные (ОАК, ОАМ, БХАК, коагулограмму) и инструментальные (ЭКГ, ФВД, УЗИ органов брюшной полости, ЭГДС, рентгенологическое исследование, КТ органов грудной клетки и брюшной полости с в/в контрастированием) методы исследования, а также консультации профильных специалистов. Во время ЭГДС всем пациентам производили забор материала для гистологического и цитологического исследований. У 53 больных материал, полученный при ЭГДС, был исследован на молекулярно-генетические маркеры.
Все 50 пациентов из группы сравнения (больные ЖКБ) прошли предоперационное обследование, включавшее ЭГДС, при котором были получены биоптаты для проведения цитологического, гистологического исследований, а также определения молекулярно-генетических маркеров.
Всем 106 пациентам из группы исследования (больные раком желудка) было проведено плановое оперативное вмешательство: в объеме гастрэктомии 42 пациентам (40%) или резекции желудка 64 пациентам (60%) с лимфаденэктомией в объеме Д1 — 9 пациентам (8%), Д2 — 85 пациентам (87%), Д3 — 13 пациентам (12%). Во всех случаях в материале, взятом из опухоли интраоперационно, в последующем, при гистологическом исследовании, подтверждено наличие опухолевых клеток. Во всех биопсийных образцах из краев резекции подтверждено отсутствие опухолевых клеток, определен атрофический гастрит в сочетании с кишечной метаплазией и/или дисплазией различной степени.
Всем 50 пациентам из группы сравнения (больные ЖКБ) была проведена плановая холецистэк-томия. Во всех биопсийных образцах от пациентов с ЖКБ было подтверждено отсутствие опухолевых клеток и установлен атрофический гастрит без кишечной метаплазии и дисплазии эпителия.
В работе использована оригинальная панель мо-лекулярно-генетических маркеров, состоящая из трех частей.
Первая часть включала определение метилирования генов СБН1, ЯАББГМ, МЬН1, N33, БАРК, т.е. определение непосредственно эпигенетических изменений ДНК, которые, однако, в дальнейшем могут быть и не реализованы в виде инициации роста опухоли.
Вторая часть панели молекулярных маркеров включала определение экспрессии генов НТЕЯТ, ММР7, ММР9, БШС5, РТОБ2, ТР53, т.е. оценку реализации информации, заключенной в ДНК на этапе синтеза РНК как факта уже произошедшего и далее реализующегося в синтезе белка.
Третьей частью панели являлось определение активности теломеразы — активного белка, синтезируемого опухолевой клеткой.
Метилирование ДНК — процесс ковалентного присоединения метильной группы к цитозину в составе CpG-динуклеотида. Метилирование вызывает эффекты, способствующие полной инактивации экспрессии гена. Аномальное метилирование генов СБИ1, ЯЛББПА, ЫЬИ1, N33, БАРК приводит к функциональной инактивации этих генов. Аномальное метилирование генов-супрессоров — одно из самых ранних событий канцерогенеза и может выявляться задолго до клинического проявления опухолевого роста.
Ген СБИ1 кодирует белок Е-кадгерин, который отвечает за адгезию клеток. Снижение активности гена приводит к утрате клеточных контактов и приобретению опухолевой клеткой способности к инвазии и метастазированию.
Ген ЕАББЕМ — ген-супрессор, участвует в регуляции клеточной пролиферации и в апоптозе, кодирует фактор, контролирующий клеточный цикл.
Ген МШ1 — ген-супрессор, кодирует фактор, участвующий в репарации неспаренных оснований, возникающих вследствие ошибок репликации ДНК.
Ген N33 проявляет супрессорные функции и демонстрирует высокий уровень метилирования в различных типах опухолей, происходящих из эпителия.
Ген БАРК кодирует белковую киназу, обеспечивающую апоптоз и предотвращающую опухолевую прогрессию в результате ингибирования поляризации клетки. Инактивация гена DAP-киназы приводит к миграции и инвазии опухолевых клеток, препятствует апоптозу.
Матриксные металлопротеиназы — протеазы, способные лизировать все структурные компоненты экстраклеточного матрикса, продуцируются клетками стромы вокруг опухоли; их высокую продукцию связывают с метастазированием, неоангиогенензом.
ММР7 (матрилизин) — металлопротеиназа, се-кретируемая эпителием опухоли; ее экспрессия коррелирует с гистологической агрессивностью опухоли.
ММР9 (желатиназа В) — металлопротеиназа, определяемая в здоровых растущих клетках, играет ведущую роль в ангиогенезе, в опухоли обеспечивает не-оангиогенез, тем самым способствуя росту опухоли.
Сурвивин ^игушп) — эндогенный белок, относящийся к семейству белков-ингибиторов апоптоза. В норме он участвует в процессах митоза и эмбрионального развития, поэтому присутствует преимущественно в эмбриональных клетках и в нормальных соматических клетках в течение краткого периода митоза. В опухолях ген сурвивина (ВШС5) экспрессируется в больших количествах и подавляет апоптоз.
Циклооксигеназа-2 (СОХ-2) катализирует превращение арахидоновой кислоты в простагландин Н2 на первой стадии биосинтеза простагландинов, тромбоксанов и простациклинов. СОХ-2 увеличивает темп развития кровеносных сосудов и рост опухоли, а также блокирует развитие апоптоза.
Ген циклооксигеназы-2 — РТОБ2.
Ген ТР53 кодирует транскрипционный фактор (р53), который при повреждении генома вызывает задержку клеточного цикла в фазе G1 и способствует апоптозу. В опухолевых клетках происходит нарушение функции гена: программа апоптоза переключается на программу неограниченной пролиферации.
Теломераза — фермент, кодируемый геном НТЕКТ, необходимый для поддержания стабильности хромосом в процессе деления клетки и присутствующий в норме лишь в небольшом пуле активно делящихся клеток. В злокачественной опухоли теломераза играет ключевую роль в поддержании пролиферативного потенциала клеток и дальнейшего роста опухоли.
У 53 (50%) пациентов группы исследования эндоскопически из края опухоли (точка П-э) был взят материал на этапе дооперационного обследования, т.е. по тем же принципам, по которым он отбирается для проведения предоперационного цитологического и гистологического исследований.
Забор материала для исследования маркеров в послеоперационном периоде у больных раком желудка проводили следующим образом. Первый образец ткани (точка Ьо) забирали из верхнего края резекции, 5 см вверх от верхнего видимого края опухоли. Второй образец ткани (точка П-о) забирали из визуально определяемой области опухоли. Третий образец ткани (точка Ш-о) забирали из нижнего края резекции, 5 см вниз от нижнего видимого края опухоли. Четвертый образец ткани (точка ^—о) забирали на расстоянии 0,5 см от видимого края опухоли (рис. 1). В последующем все участки забора ткани
Рис. 1. Области забора тканевого материала в исследуемой группе пациентов
маркировали для возможности их идентификации патоморфологом и получения максимально точного патогистологического заключения. Для каждого образца (точки I-, II-, III-, 1У-о, П-э) было проведено гистологическое исследование на выявление опухолевых клеток, при определении опухоли проводилось ее гистотипирование. У всех 106 (100%) пациентов в каждом (точки I-, II-, III-, ГУ-о) из образцов, полученных интраоперационно, и у 53 (50%) пациентов — из образцов, полученных эндоскопически
(точка П-э), исследовали аномальное метилирование генов СБН1, ЯАББГМ, МЬН1, N33, БАРК методом метил-чувствительной ПЦР, с использованием рестрикционной эндонуклеазы НраП. Анализ экспрессии исследуемых генов НТЕЯТ, металлопротеи-наз ММР7, ММР9, БШС5, РТОБ2, ТР53 проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. Для чего первым этапом выделяли тотальную клеточную РНК из образцов ткани, далее проводили обратную транскрипцию
15,0%
32,0%
□ высокодифференцированная аденокарцинома
□ умереннодифференцированная аденокарцинома
□ недифференцированная аденокарцинома
□ перстне вид ноклеточный рак ■ недифференцированный рак
Распределение пациентов по гистологическим вариантам опухоли (в %)
Распределение пациентов в зависимости от стадии заболевания (в %)
28
Распределение больных в зависимости от поражения л/у в абсолютных числах
16
□ до 2 см ■ 2-4 см □ более 4 см
Распределение больных по размеру опухоли в абсолютных числах
Распределение больных по распространенности опухолевого процесса в абсолютных числах
Распределение больных по классификации Р. Lauгen в абсолютных числах
Рис. 2 (а, б, в, г, д, е). Распределение пациентов по клиническим подгруппам
(синтез кДНК) и полученную кДНК амплифици-ровали методом ПЦР с использованием олигону-клеотидных праймеров, специфичных первичной структуре кДНК исследуемых генов. Также у всех 106 (100%) пациентов в каждом (I-, II-, III-, IV-о) из образцов, полученных интраоперационно, и у 53 (50%) пациентов из образцов, полученных эндоскопически (II-э), исследовали активность теломеразы модифицированным методом TRAP.
Забор материала в группе сравнения — у больных ЖКБ — для исследования молекулярно-генетиче-ских маркеров проводили следующим образом. Эндоскопически из интактной слизистой тела желудка (точка II-э) был взят материал на этапе доопераци-онного обследования для последующего проведения предоперационного цитологического и гистологического исследований. В каждом из образцов (II-э) исследовали аномальное метилирование генов CDH1, RASSF1A, MLH1, N33, DAPK, экспрессию генов hTERT, металлопротеиназ ММР7, ММР9, BIRC5, PTGS2, TP53 и активность теломеразы.
Проведен анализ молекулярно-генетических маркеров внутри группы больных раком желудка по клиническим подгруппам, разделенным по ги-
Частота
стологическим вариантам опухоли, по распространенности опухолевого процесса, по классификации TNM, по классификации Р. Lauren, по поражению лимфоузлов, по размеру опухоли (рис. 2).
Частота метилирования генов CDH1, RASSF1A, MLH1, N33, DAPK, экспрессия ММР7, PTGS2, активность теломеразы возрастают с увеличением размера опухоли.
Аномальное метилирование генов N33, CDH1 и увеличение экспрессии BIRC5, ММР7, PTGS2являются маркерами негативного прогноза для рака желудка, связаны с генерализацией опухолевого процесса и метастазированием.
Метилирование гена DAPK является маркером благоприятного прогноза, коррелирует с малой вероятностью метастазирования в лимфатические узлы.
Частота метилирования гена CDH1 достоверно выше, а уровни экспрессии генов BIRC5 и hTERT достоверно ниже в опухолях диффузного типа, чем в опухолях интестинального типа.
Проведен анализ молекулярно-генетических маркеров в группе больных раком желудка в зависимости от области забора (точки I-, II-, III-, IV-о) (табл. 1, 2, 3).
Таблица 1
ювания генов
N33 CDH1 RASSF1A MLH1 DAPK
I-o точка
55,0±6,8 61,25+6,7 4,5+2,7 3,0+2,3 41,5+6,7
II-o точка
61,15+6,7 53,25+6,8 14,75+4,7 15,15+3,7 35,55+6,6
III-o точка
58,6+6,7 54,2+6,8 2,8+2,3 2,9+2,3 40,5+6,7
IV-o точка
68,05+6,5 65,25+6,5 4,85+2,7 5,7+3,3 52,65+6,8
Таблица 2
Уровни экспрессии генов
Показатель экспрессии гена Точка забора I-o Точка забора II-o ОПУХОЛЬ Точка забора III-o Точка забора IV-o Интервал для участка II-o (95%)
BIRC5 0,57+0,06 0,97+0,06* 0,78+0,078 0,61+0,06 0,86-1,1
ММР9 0,3+0,04 0,65+0,06 0,38+0,04 0,35+0,05 0,54-0,77
ММР7 0,3+0,06 0,8+0,07 0,3+0,04 0,40+0,067 0,66-0,93
PTGS2 0,16+0,03 0,52+0,06 0,16+0,02 0,16+0,026 0,39-0,64
hTERT 0,15+0,02 0,42+0,043 0,26+0,038 0,25+0,028 0,33-0,5
ТР53 0,25+0,08 0,27+0,05 0,13+0,05 0,36+0,09 0,13-0,4
Таблица 3
Анализ активности теломеразы
Точка забора I-o Точка забора II-o Точка забора III-o Точка забора IV-o Интервал для II-o (95%)
31,0+4,8 66,1+5,8 32,6+4,9 27,6+5,1 77,7-54,5
1 п .1 ] 66,1
5* .5
| 36,6
+ 30.6 г (.в
АТ
гочьа заос^д н-о юироль
Рис. 3. Уровни экспрессии генов (95% ДИ
Рис. 4. Уровни активности теломеразы (95% ДИ)
Анализ активности маркеров при заборе в разных участках слизистой желудка в группе исследования показал, что в точке П-о (опухоль)_метилирование генов ЯАББР1А, МЬН1, экспрессия генов ИТЕЯТ, РТОБ2, ММП7, ММП9, Б1ЯС5 и активность теломеразы достоверно выше, чем в точках I-, III-, ПУ-о (слизистая близлежащих и отдаленных от опухоли участков). Показатели маркеров прилежащих к опухоли участков и отдаленных от нее участков слизистой (I-, III-, 