CC BY
188
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616.33-006.04-07:577.21.08
м.В. Немцова, И.И. Быков, Н.В. Чекунова, Д.В. залетаев, А.И. Глухов, Т.В. хоробрых СИСТЕМЫ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ПРИ РАКЕ ЖЕЛУДКА
НИИ молекулярной медицины, НИО «хирургия пищевода и гастроэнтерология», кафедры факультетской хирургии № 1 лечебного факультета и биохимии ГБОУ ВпО первый московский государственный университет им. И.м. Сеченова минздрава России
Исследованы аномальное метилирование генов CDH1, RASSF1A, MLH1, N33, DAPK, экспрессию генов hTERT, металло-протеиназ ММР7, ММР9, сурвивина, СОХ-2, р53, а также активности теломеразы в 106 образцах опухоли желудка, полученных интраоперационно, 53 образцах опухоли желудка, полученных эндоскопически, а также в 50 образцах биопсии, полученных от пациентов с хроническим калькулезным холециститом (группа сравнения). Эти изменения могут использоваться в качестве дополнительных маркеров как в диагностике рака желудка, так и при динамическом наблюдении за оперированными пациентами.
Ключевые слова: рак желудка, аномальное метилирование генов, генная экспрессия, молекулярно-генетические маркеры опухолевого роста
M.V. Nemtsova, I.I. Bykov, N.V. Tchekunova, D.V. Zaletayev, A.I. Glukhov, T.V. Khorobrykh THE SYSTEMS OF MOLECULAR GENETIC MARKERS UNDER CANCER OF STOMACH
The research institute of molecular medicine, Moscow, Russia
The I.M. Sechenov first Moscow medical university of Minzdrav of Russia, 119992, Moscow, Russia
The study was organized to investigate the anomalous methylation of genes NA?1, RASSF1A, MLH1, N33, DAPK, the expression of genes hTERT, metalloproteinase MMP7, MMP9, survivin, COX-2, p53. The activity of telomerase in 106 samples of stomach tumors taken through intra-operation way and 53 samples of stomach tumors taken through endoscopic way and 50 samples of biopsy taken from patients with chronic calculous cholecystitis (comparison group) was analyzed too. These changes can be used as additional markers both in diagnostic of cancer of stomach and dynamic monitoring of operated patients.
Key words: cancer of stomach, anomalous methylation, gene, expression of gene, molecular genetic marker, tumor growth
К наиболее важным практическим задачам диагностики злокачественных новообразований, в том числе и рака желудка, можно отнести разработку новых систем генетических и эпигенетических маркеров, создание эффективных и экономичных диагностических протоколов, внедрение которых позволит своевременно диагностировать онкологическое заболевание, а значит и повысит успешность его лечения.
Известно, что канцерогенез представляет собой многостадийный процесс, при котором на разных этапах опухолевого развития происходят различные молекулярные нарушения [2]. Они связаны как с микроокружением опухолевых клеток, так и с генетическими особенностями организма, в котором опухоль развивается. Основными характеристиками опухоли являются молекулярные изменения, приводящие к нарушению регуляции нормального клеточного роста. Эти изменения возникают в результате нарушения генетической и эпигенетической регуляции генной активности, которые специфичны для начала эпигенетических событий. Несмотря на то что опухоли определенного органа или ткани имеют сходный генез, на каждую опухоль оказывают влияние заболевание, его прогрессия и терминальные стадии. Используя молекулярно-генетические нарушения в геноме опухоли, изменение экспрессии определенных генов и нарушение белкового спектра в качестве молекулярных
Для корреспонденции:
Немцова Марина Вячеславовна, д-р биол. наук, проф., вед. науч. сотр. лаб. мол. генетики человека Адрес: 199991, Москва, ул. М. Трубецкая, 8 E-mail: nemtsova_m_v@mail.ru
маркеров можно четко определить стадию злокачественного процесса и проследить молекулярную эволюцию опухолевого процесса [2, 11].
Рак желудка является гетерогенным заболеванием, в котором можно выделить два больших гистологических типа, основанных на классификации Лорен: диффузный и интестинальный (кишечный) типы рака желудка [9]. Эти два типа имеют клинические, морфологические и эпидемиологические различия. Интестинальный (кишечный) тип чаще наблюдается у пожилых пациентов, имеющих мультифокальный атрофический гастрит, который переходит в интестинальную метаплазию или дисплазию. Диффузный тип распространен у молодых пациентов, и его связь с гастритом и метаплазией не очевидна. Клинические различия этих двух типов определяются различными молекулярными механизмами опухолевого развития и прогрессии [12]. Возможность определить основные молекулярные события, которые характеризуют этапы канцерогенеза желудка, позволит создать систему молекулярных маркеров, с целью получения дополнительной клинической информации для диагностики и прогноза рака желудка у каждого конкретного пациента [4].
Материалы и методы. Молекулярно-генетические маркеры исследовали у 156 пациентов, из них у 106 пациентов выявлен рак желудка. В группу сравнения вошли 50 пациентов с диагнозом желчно-каменной болезни (ЖКБ).
В каждом из 106 образцов опухоли желудка, полученных интраоперационно, и в 53 образцах опухоли желудка, полученных эндоскопически, исследовали аномальное метилирование генов CDH1, RASSF1А, MLH1, N33, DAPK, экспрессию генов hTERT, металлопротеи-
биомаркеры при различных формах патологии
наз ММР7, ММР9, сурвивина, СОХ-2, р53. А также проводили исследование активности теломеразы модифицированным методом ТRAP [1]. У каждого пациента изучали не только опухолевый образец, но и фрагменты условно нормальной слизистой оболочки желудка, расположенные на расстоянии 5 см вверх или вниз от опухолевого узла, а также фрагмент, расположенный вблизи линии резекции. Для каждого анализируемого фрагмента проводили гистологический анализ на наличие опухолевых клеток.
Забор материала у 50 пациентов с хроническим каль-кулезным холециститом (группа сравнения) для исследования молекулярно-генетических маркеров проводили при эндоскопическом исследовании из интактной слизистой тела желудка на этапе дооперационного обследования.
Гены, выбранные для анализа метилирования, обладают свойствами опухолевых супрессоров, непосредственно влияют на сдерживание опухолевого роста. Их инактивация посредством аномального метилирования характерна для различных видов опухолей, не выявляется при развитии воспалительных заболеваний различных органов, а также при обратимых гиперпластических процессах [3, 10].
Выбор генов для анализа экспрессии (hTERT, метал-лопротеиназ ММР7, ММР9, сурвивина, СОХ-2, р53) проводили с учетом их функции в канцерогенезе при раке желудка и других типах опухолей [1]. Продукты генной экспрессии сурвивина и СОХ-2 обладают способностью блокировать апоптоз, а также стимулировать ангиогенез опухоли. ММР7, ММР9 обеспечивают неоангиогенез, тем самым способствуют росту и инвазии опухоли [5]. Белок ТР53 функционирует как «хранитель генома», обеспечивая задержку клеточного цикла для последующей репарации повреждений ДНК, или направляет поврежденную клетку в апоптоз [6].
В качестве белкового маркера выбрана теломераза, которая является продуктом экспрессии гена hTERT. Фермент теломераза необходим для поддержания стабильности хромосом в процессе деления клетки, играющий ключевую роль в поддержании пролиферативного потенциала клеток и опухолевого роста [1].
С целью получения дополнительных диагностических и прогностических маркеров рака желудка исследовали связь полученных в результате нашей работы параметров с возрастом, типом опухоли (диффузный или интестинальный рак желудка), распространенностью опухолевого процесса и размерами опухоли. Чтобы доказать, что изменения в геноме и нарушения экспрессии генов происходят в результате образования опухоли, проведено сравнение показателей маркеров у больных раком желудка и больных хроническим калькулезным холециститом.
Результаты и обсуждение. Молекулярные и генетические маркеры в опухолях желудка
Определение метилирования генов. В ходе проведенного исследования метилирование генов выявлено в опухолях у всех пациентов, но с различной интенсивностью. Наибольшая частота метилирования в опухолевой ткани определена у генов N33 - 66% (70/106), CDH1 - 61% (65/106), DAPK - 51% (54/106). Метилирование выявлено как в самой опухоли, так и в морфологически неизмененной слизистой желудка, расположенной на расстоянии 5 см от опухолевого узла. Гены RASSF1А и MLH1 имеют низкую частоту метилирования (до 20%), но процесс регистрируется только в опухолевых образцах. Частота метилирования генов N33, CDH1, DAPK,
RASSF1Â и MLH1, выявленная нами в исследовании в опухолевом материале, совпадает с результатами других авторов [8].
Отмечена высокая частота метилирования генов CDH1, DAPK в окружающей опухоль слизистой, имеющей признаки хронического гастрита и кишечной метаплазии. Предполагаем, что высокий уровень метилирования генов CDH1, N33, DAPK в морфологически нормальной ткани, пограничной с опухолевой, неслучаен, он косвенно указывает на вовлеченность этой ткани в опухолевый процесс и требует дополнительного контроля над данной категорией пациентов в послеоперационном периоде. Такой вывод возможен вследствие того, что уровень аномального метилирования исследуемых генов в операционных образцах рака желудка и окружающей морфологически нормальной ткани оказался достоверно выше (р < 0,01), чем в группе сравнения в био-птатах пациентов с диагнозом желчно-каменной болезни и хронического калькулезного холецистита. Определяемые изменения потенциально можно использовать в диагностике рака желудка, для оценки прогрессирования опухолевого процесса, а также для изучения изменений слизистой культи желудка в динамике после резекции, что требует дальнейшего детального изучения.
Аномальное метилирование генов N33 и CDH1 является маркером негативного прогноза для рака желудка, что связано с генерализацией опухолевого процесса и метастазированием. А наличие метилирования гена DAPK, напротив, является маркером более благоприятного прогноза. Метилирование данного гена снижается при наличии метастазов в лимфатических узлах. Определение метилирования этого гена может в дальнейшем иметь практическое применение в диагностике поражения лимфатических узлов на дооперационном этапе, однако полученные данные требуют дополнительного анализа на большей группе пациентов и более детального изучения.
В результате работы определено, что уровень метилирования гена CDH1 в опухолях диффузного типа достоверно выше (р < 0,05), чем в опухолях интестиналь-ного типа, что согласуется с данными, представленными в литературе [7]. Эти изменения подтверждают молекулярные различия этих типов опухолей, что в дальнейшем имеет отражение в различном морфогенезе и клиническом поведении опухоли.
Определение экспрессии генов. Увеличение экспрессии генов hTERT, COX-2, MMP7, MMP9 и сурвивина показано для различного типа опухолей, рака молочной железы, рака легкого и др. [1, 5]. В результате нашего исследования выявлено достоверное повышение экспрессии этих генов в опухолях желудка, что свидетельствует о непосредственной роли данных генов в канцерогенезе желудка. В результате исследования экспрессион-ных маркеров нами показано, что экспрессия генов Sur, ММР7 и hTERT достоверно выше в опухоли (р < 0,01) по сравнению с пограничной неопухолевой тканью. Отсутствие различий в экспрессии генов в пограничной ткани желудка и образцах группы сравнения, выявленное в результате проведенного исследования, показывает, что расположенная рядом опухоль не влияет на экспрессию исследуемых генов в окружающей неопухолевой ткани. Таким образом, показана возможность использования экспрессии генов Sur, ММР7 и hTERT в диагностике рака желудка, а также в дифференциальной диагностике с доброкачественными заболеваниями гастродуоденаль-ной зоны на фоне хронического воспаления.
Увеличение экспрессии исследуемых генов можно
использовать и в качестве клинических маркеров. Экспрессия Sur, ММР7, СОХ-2 достоверно выше при генерализованном раке по сравнению с ранним и местно-распространенным раком (р < 0,05), что отражает роль этих генов в распространении опухолевого процесса, увеличении объема опухоли и метастазировании.
Определены достоверно более высокие уровни экспрессии генов Sur и hTERT при интестинальном типе рака желудка по отношению к диффузному. Определенные нами достоверные различия в поведении молекулярных маркеров в клинических группах можно использовать в качестве прогностических показателей течения рака желудка.
Определение активности теломеразы. По результатам нашего исследования уровень активности теломе-разы в опухоли достоверно выше, чем на отдаленных участках, приближенных к краям резекции, и в биопта-тах слизистой желудка неопухолевых больных. Это подтверждает предположение о возможном использовании теломеразы в качестве онкомаркера. Достоверное отличие опухолевой ткани от окружающей слизистой по активности некоторых белков также может быть использовано в послеоперационном наблюдении за состоянием культи желудка после резекции при оценке прогресси-рования онкологического процесса.
Суммируя вышесказанное, можно отметить, что аномальное метилирование генов-супрессоров CDH1 , RASSF1Â, MLH1, N33, DAPK, повышенная экспрессия генов металлопротеиназ MMP7, ММР9, сурвивина, hTERT, а также увеличение активности теломеразы являются характерными изменениями для рака желудка, но проявляются с различной интенсивностью. Уровень метилирования генов RASSF1Â, MLH1, а также экспрессии генов hTERT, MMP7, сурвивина, активности теломеразы в опухоли желудка достоверно выше (р < 0,01), чем в морфологически неизмененной окружающей слизистой желудка. Значения параметров исследуемой системы в опухоли достоверно отличаются от группы контроля (биоптаты слизистой желудка пациентов с ЖКБ), поэтому они могут составить систему новых молекулярно-генетических маркеров рака желудка [4]. Эта система может использоваться как в диагностике рака желудка, так и при динамическом наблюдении за оперированными пациентами.
Возможности использования молекулярно-генети-ческих маркеров на дооперационном этапе. Одной из основных задач, поставленных в этом исследовании, была оценка возможности и целесообразности определения молекулярно-генетических маркеров рака желудка в дооперационном периоде. Изучение материала, полученного при эндоскопическом исследовании в дооперационном периоде, существенно повышает уровень диагностики рака желудка. В сложных случаях использование молекулярных маркеров позволяет дополнить гистологическое исследование, дифференцировать опухолевые и неопухолевые образования желудка. Так, в нашей работе у 3 больных результаты предоперационного гистологического анализа биоптатов слизистой желудка, полученных при эндоскопическом исследовании, не подтвердили диагноз рака желудка. При морфологическом исследовании материала раковых клеток в биопсии не выявлено. Однако больные были оперированы с учетом результатов других методов исследования, в том числе и по наличию молекулярно-генетических маркеров, подтвердивших наличие опухолевого процесса. При исследовании операционного материала диагноз рака желудка не вызывал сомнений. В нашей работе из
106 больных раком желудка только 3 пациента имели неподтвержденный цитологически и гистологически диагноз рака желудка на дооперационном этапе, однако в практической деятельности такая ситуация встречается значительно чаще.
Иногда эндоскопически полученный материал может несколько отличаться от операционного, что связано с техникой забора и особенностями визуализации при эндоскопии. По итогам нашего исследования доказано, что в материале, полученном на дооперационном этапе и интраоперационно из области опухоли у больных раком желудка, достоверной разницы между уровнями метилирования генов, экспрессионными маркерами, а также активностью теломеразы не выявлено. Таким образом, в ходе проведенного исследования подтверждена возможность использования для лабораторной диагностики биопсийного материала, полученного в результате дооперационного эндоскопического исследования. Определено, что количество ДНК и РНК, получаемое из эндоскопического образца, вполне достаточно для проведения серии молекулярно-генетических исследований. Использование эндоскопического материала наравне с материалом, полученным в процессе операции, позволит повысить выявление опухолей желудка на этапе предоперационной диагностики, что приведет к улучшению диагностики рака на ранних стадиях.
Молекулярно-генетические маркеры, определяемые в биоптатах слизистой желудка, вместе с клиническими, лабораторными и инструментальными показателями позволяют увеличить точность дооперационной диагностики, в более короткие сроки подтвердить или опровергнуть диагноз рака желудка и определить показания к операции.
Уточнение хирургической тактики с учетом показателей молекулярных и генетических маркеров. Учитывая наличие достоверной разницы показателей нашей системы, состоящей из определения метилирования генов, экспрессии генов, а также активности теломеразы в опухолевом материале, по отношению к показателям в биоптатах слизистой желудка больных ЖКБ, можно утверждать, что опухоль отличается наличием определенных изменений, которые не происходят в слизистой желудка в отсутствие опухолевого поражения. Определив границу этих изменений в слизистой желудка, можно предположить границу между опухолью и нормальной слизистой и уточнить границу резекции при хирургическом лечении.
Однако из проведенного исследования следует, что морфологически нормальная слизистая, отдаленная от опухоли, у некоторых больных раком желудка характеризуется наличием эпигенетических изменений, свойственных больше опухолевой ткани, чем нормальной (слизистая желудка пациентов с ЖКБ). Высокий уровень метилирования генов CDH1, N33, DAPK в морфологически непораженной слизистой, пограничной с опухолью, у некоторых больных раком желудка косвенно может указывать на вовлеченность этой ткани в опухолевый процесс и требует контроля в послеоперационном периоде. Изучение этого вопроса еще до конца не завершено, требует более углубленного исследования опухолевого материала и окружающей его неопухолевой ткани. Таким образом, уровень метилирования генов CDH1, N33, DAPK в настоящее время нельзя использовать в системе для определения границы резекции. Для этой цели хорошо подходят экспрессионные маркеры hTERT, ММР7, сурвивин, а также определение активности теломеразы, уровень которых повышается только в опухоли и до-
биомаркеры при различных формах патологии
стоверно снижается в окружающей слизистой, расположенной на 5 см ниже и выше опухолевого узла. Исследуемые нами точки морфологически нормальной слизистой, расположенные на 5 см выше и ниже опухоли, находятся ближе к узлу, чем проксимальная и дисталь-ная линии резекции. Отсутствие изменений экспрес-сионных маркеров позволяет заключить, что операции (субтотальная дистальная резекция, или проксимальная резекция желудка), выполняемые при ограниченном ан-тральном или проксимальном росте опухоли, являются правомочными, поскольку выполняются в пределах не только морфологически неизмененных тканей, но и на фоне незначимых молекулярных и генетических изменений. С учетом полученных нами данных по использованию новых молекулярно-генетических маркеров, можно утверждать, что объемы операции (субтотальная дистальная резекция и проксимальная резекция) являются адекватными и не требуют увеличения, а сами маркеры могут служить дополнительными показателями «молекулярно-генетической чистоты линии резекции», коррелирующими с данными гистологического исследования.
Хотя молекулярно-генетические маркеры не позволяют со 100% точностью дифференцировать злокачественное поражение желудка, они вполне способны стать весьма ценным дополнительным диагностическим инструментом для уточнения характера поражения в сложных диагностических случаях, таких как несоответствие клинических и инструментальных, а также лабораторных данных результатам дооперационного цитологического и гистологического исследований.
В результате проведенной работы можно заключить, что для адекватной оценки молекулярно-генетических изменений слизистой у больных раком желудка целесообразно использовать комплексную панель, включающую маркеры различных стадий канцерогенеза и пригодную как на этапах диагностики, так и лечения. Определение экспрессии генов ММР7, hTERT, сурвивина, а также активности теломеразы целесообразно использовать для диагностики рака желудка в сочетании с другими методами исследования. Анализ аномального метилирования генов CDH1, RASSF1А, МШ1, N33, DAPK и экспрессии генов ММР9, СОХ-2 можно проводить для оценки состояния слизистой после резекции желудка по поводу ракового процесса при динамическом наблюдении за больными с целью исключения истинного рецидива опухоли, а также для определения прогноза течения злокачественного процесса у больных раком желудка.
ЛИТЕРАТУРА
1. Глухов А.И., Высоцкая О.В., Гордеев С.А. и др. Теломераза, сер-вивин и циклооксигеназа-2 как мишени для диагностики опухолевых заболеваний человека. В кн.: Введение в молекулярную диагностику (под ред. акад. М.А. Пальцева). М.: Медицина. 2010; 225-261.
2. Залетаев Д.В., Стрельников В.В., Немцова М.В. Системы генетических и эпигенетических маркеров в ДНК-диагностике злокачественных образованиях. В кн.: Системы генетических и эпигенетических маркеров в диагностике онкологических заболеваний (под ред. М.А. Пальцева и Д.В. Залетаева). М.; 2009: 7-76.
3. Немцова М.В., Бабаян А.Ю., Быков И.И. и др. Аномальное метилирование генов CDH1, RASSF1A, MLH1, N33, DAPK в опухолевом и морфологически неизмененном (неопухолевом)
эпителии желудка. Российский онкологический журнал. 2011; 5: 21-5.
4. Черноусов А.Ф., Хоробрых Т.В., Быков И.И., Немцова М.В. и др. Первый опыт использования маркеров молекулярно-генетической нестабильности слизистой в диагностике рака желудка. Вестник хирургической гастроэнтерологии. 2011; 4: 4-13.
5. CoussensL.M., Fingleton B., Matrisian L.M. Matrix metalloproteinase inhibitors and cancer: trials and tribulations. Science. 2002; 295: 2387-92.
6. Fenoglio-Preiser C., Wang J., Stemmermann G., Noffsinger A. TP53 and gastric carcinoma: a review. Hum. Mutat. 2003; 21: 258-70.
7. Humar B., Blair V., Charlton A., More H., Martin I., Guilford P. E-cadherin deficiency initiates gastric signet-ring cell carcinoma in mice and man. Cancer Res. 2009; 69: 2050-6.
8. Issa J.P. CpG island methylator phenotype in cancer. Nat. Rev. Cancer. 2004; 4: 988-93.
9. Jang B.-G., Kim W.H. Molecular Pathology of Gastric Carcinoma. Pathobiology. 2011; 78: 302-10.
10. Jee C.D., Kim M.A., Jung E.J., Kim J., Kim W.H. Identification of genes epigenetically silenced by CpG methylation in human gastric carcinoma. Eur. J. Cancer. 2009; 45: 1282-93.
11. Nobili S., Bruno L., Landini I., Napoli C., Bechi P. Genomic and genetic alterations influence the progression of gastric cancer. World J. Gastroenterol. 2011; 17 (3): 290-9.
12. Vauhkonen M., Vauhkonen H., Sipponen P. Pathology and molecular biology of gastric cancer. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 2006; 20: 651-74.
REFERENCES
1. Glukhov A.I., Vysotskaya O.V., Gordeev S.A. Telomerase, servivin and cyclooxygenase-2 as a target for the diagnostics of human cancers. In: The introduction in molecular diagnostics / M.A. Pal'tsev, ed. M.: Meditsina. 2010; 225-61 (in Russian).
2. Zaletaev D.V., Strel'nikov V.V., Nemtsova M.V. Systems of genetic and epigenetic markers in the DNA-diagnostics of tumors. In: Systems of genetic and epigenetic markers in diagnostic of cancer / M.A. Pal'tsev, D.V. Zaletaev, eds. M.; 2009: 7-76 (in Russian).
3. Nemtsova M.V, Babayan A.Yu., Bykov I.I. Abnormal methylation of CDH1, RASSF1A, MLH1, N33, DAPK genes in tumor and their adjacent non-tumor areas in gastric carcinomas. Rossiyskiy onkolog-icheskiy zhurnal. 2011; 5: 21-5 (in Russian).
4. Chernousov A.F., Khorobrykh T.V., Bykov I.I., Nemtsova M.V. The first application of molecular genetic markers in the diagnostics of stomach cancer. Vestnik khirurgicheskoy gastroenterologii. 2011; 4: 4-13 (in Russian).
5. Coussens L.M., Fingleton B., Matrisian L.M. Matrix metallopro-teinase inhibitors and cancer: trials and tribulations. Science. 2002; 295: 2387-92.
6. Fenoglio-Preiser C., Wang J., Stemmermann G., Noffsinger A. TP53 and gastric carcinoma: a review. Hum. Mutat. 2003; 21: 258-70.
7. Humar B., Blair V., Charlton A., More H., Martin I., Guilford P. E-cadherin deficiency initiates gastric signet-ring cell carcinoma in mice and man. Cancer Res. 2009; 69: 2050-6.
8. Issa J.P. CpG island methylator phenotype in cancer. Nat. Rev. Cancer. 2004; 4: 988-93.
9. Jang B.-G., Kim W.H. Molecular Pathology of Gastric Carcinoma. Pathobiology. 2011; 78: 302-10.
10. Jee C.D., Kim M.A., Jung E.J., Kim J., Kim W.H. Identification of genes epigenetically silenced by CpG methylation in human gastric carcinoma. Eur. J. Cancer. 2009; 45: 1282-93.
11. Nobili S., Bruno L., Landini I., Napoli C., Bechi P. Genomic and genetic alterations influence the progression of gastric cancer. World J. Gastroenterol. 2011; 17 (3): 290-9.
12. Vauhkonen M., Vauhkonen H., Sipponen P. Pathology and molecular biology of gastric cancer. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 2006; 20: 651-74.
Поступила 18.02.13
