CC BY
26ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ. 2013.Т.15. №3
УДК 616.34-008.87:616.594.171.2:616.7:616-053.4:616.-053.5
РОЛЬ МЕЖМИКРОБНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ CANDIDA SPP. ПРИ ПАТОЛОГИИ ОПОРНО-ДВИГАТЕЛЬНОГО АППАРАТА У ДЕТЕЙ
Бухарин О.В. (г.н.с.)/ ^ерунова Н.Б.* (зав. лаб.), Челпаченко О.Е. (в.н.с.), Иванова Е.В. (в.н.с.), 2Черных Л.П. (зав. отд.)
1 Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Оренбург;2 Муниципальная городская клиническая больница № 6 г. Оренбурга, Россия
© Коллектив авторов, 2013
Представлены результаты клинико-бактериологические исследования кишечной микробиоты детей с патологией опорно-двигательного аппарата (ОДА) в сравнении со здоровыми детьми. Выявлена гиперколонизация Candida spp., поддерживаемая ассоциацией условно-патогенной микробиоты, и ее антагонистический эффект в биокоммуникативных взаимоотношениях с доминантными микросимбионтами - бифидобактериями у детей с патологией ОДА. При изучении межмикробных связей в микросимбиоценозе кишечника у детей с данной патологией установлен синергидный эффект Candida spp. в отношении пер-систентного потенциала ассоциативных микросимбионтов. Представленные материалы служат основой для патогенетического обоснования формирования стойкого дисбиоза у детей с нарушениями ОДА и рассмотрения его в качестве фактора риска развития этой патологии.
Ключевые слова: биокоммуникация, дисбиоз кишечника, Candida spp., патология опорно-двигательного аппарата, перси-стенция
ROLE OF CANDIDA SPP INTERMICROBIAL INTERACTIONS IN PATHOLOGY OF LOCOMOTOR APPARATUS IN CHILDREN
^ukharin O.V. (chief scientific officer), ^erunova N.B. (head of the laboratory), ^helpachenko O.E. (leading scientific collaborator), ^vanova E.V. (leading scientific collaborator), 2Chernyh L.P. (head of the department)
1 Institute for Cellular and Intracellular Symbiosis of Ural Department for the Russian Academy of Sciences, Orenburg; 2Orenburg Municipal Clinical Hospital № 6, Russia
© Collective of authors, 2013
Контактное лицо: Перунова Наталья Борисовна, Тел.: 8 (3532) 77-59-08
Clinico-bacteriological investigations of intestinal microbiota were carried out in children with pathology of locomotor apparatus (LMA) in comparison with healthy children. Hypercolonization of Candida spp. was revealed that was supported by opportunistic pathogenic microbiota and antagonistic effect of fungi in biocomminicative interactions with dominant microsymbionts (bifidobacteria) in children with pathology of LMA. While investigating intermicrobial links in microsymbiocenosis of the bowels in children with the given pathology, synergic effect of Candida spp. on the persistent potential of associative microsymbionts was established. Obtained materials provided insight into pathogenetic formation of persistent dysbiosis in children with a disorder of LMA, and allowed to consider dysbiosis as a microbial risk factor for the development of this pathology.
Key words: biocommunication, Candida spp., dysbiosis of the bowel, pathology of locomotor apparatus in children, persistence
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время имеются работы, указывающие на связь между дисбиозом кишечника с гиперколонизацией Candida spp. и дисплазией соединительной ткани (ДСТ) у детей [1, 2], определяющие роль микробного фактора в формировании соматической патологии. Известно, что дети с патологией опорно-двигательного аппарата (ОДА) имеют симптомы соединительнотканной дисплазии [3,4], что обусловлено особенностями анатомо-гистологического строения опорно-двигательной системы, представленной преимущественно элементами соединительной ткани [5]. Согласно многочисленным данным, существует связь патологии ОДА с микробиотой, в частности, с дрожжевыми грибами, обладающими набором ферментов (гиалуронидаза, хондроитинсульфатаза), разрушающих соединительную ткань, влияя на лами-нин, фибронектин, фибриноген, 4 тип коллагена [6, 7]. В этих исследованиях объяснена высокая частота встречаемости у детей с дисплазией соединительной ткани патологии ОДА и связь с микробиотой человека.
Учитывая, что в структуре микросимбиоценоза, наряду с грибами Candida spp., присутствует и бак-териобиота, роль которой при данной патологии далека от своего разрешения, мы предприняли попытку расшифровать значение микробного фактора в регуляции гомеостаза организма и функционировании опорно-двигательного аппарата у детей. При этом, наряду с изучением видового состава и биохарактеристиками микросимбионтов кишечного тракта детей, были определены их биокоммуникативные связи, имеющие существенное значение в условиях ассоциативного симбиоза [8] человека, способствуя пониманию особенностей патогенеза обозначенной патологии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для проведения клинического и бактериологического обследования были сформированы две группы детей и подростков в возрасте от 4 до 17 лет: 1 группа - 38 пациентов с патологией ОДА (остеоартроз, сколиотическая болезнь); 2 группа (сравнения) - 25 условно-здоровых детей. Группы детей с патологией опорно-двигательного аппарата формировали на ос-
новании стандартного клинического и ортопедического обследования с проведением рентгенографии и УЗИ ОДА. Клиническое исследование включало такие параметры, как сгибательная подвижность позвоночника (симптомы Отта, Шобера, Томайера), тест «подбородок - грудина» и тест Ли. Болевой синдром диагностировали по визуально-аналоговой шкале (ВАШ) и индексу Ричи.
Исследование микросимбиоценоза кишечника осуществляли в соответствии с «Методическими рекомендациями по применению бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника» (1986 г.). Оценку состояния микробиоты дистального отдела толстого кишечника (дисбиоз/эубиоз) по степеням проводили в соответствии с приказом МЗ РФ № 231 [9]; выделение и идентификацию анаэробных микроорганизмов -в соответствии с руководством [10]. Выделенные штаммы факультативно-анаэробных микроорганизмов идентифицировали общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных и культуральных свойств. Биохимический профиль изучаемых культур факультативно-анаэробных бактерий и дрожжевых грибов определяли с помощью коммерческих тест-систем фирмы «Lachema» (Чехия) и «API20CAUX» (bioMerieux, Франция).
Численность изолированных микроорганизмов выражали в колониеобразующих единицах в пересчете на грамм исследуемого материала (КОЕ/г). Антилизоцимную (АЛА) и антикомплементарную (АКА) активности определяли фотометрическим методом по Бухарину О.В. с соавт. (1999 г.). Биокоммуникативные связи оценивали через изменения показателей двух базовых функций - размножение и адаптацию (персистентные характеристики) микроорганизмов. Исследование изменений АЛА и АКА микробиоты в условиях межмикробных взаимодействий проводили при добавлении к изучаемым культурам стерильных супернатантов (продуктов жизнедеятельности) микроорганизмов-симбионтов в питательный бульон [11].
Статистическая обработка результатов исследования включала применение общепринятых методов вариационной статистики с использованием программы Excel и SPSS Statistics. При исследовании микросимбиоценоза кишечника вычисляли критерий Стьюдента-Фишера, данные по определению регулирующего влияния экзометаболитов дрожжевых грибов и микроорганизмов-симбионтов в ассоциации оценивали с помощью непараметрического метода вариационной статистики по критерию Манна-Уит-ни. Разницу между сравниваемыми величинами считали достоверной при значении р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При проведении бактериологического исследования микробиоты дистального отдела толстого кишечника у 94,8 ±2,6% пациентов с патологией ОДА
был выявлен дисбиоз кишечника (преимущественно II-III степени). В группе условно-здоровых детей без патологии ОДА отмечали нарушение микросимбиоценоза кишечника (I-II степени) только у 3 из 25 обследуемых детей (12,2±1,2 %) (р<0,001).
При анализе видового состава микробиоты кишечника выявили высокую частоту встречаемости Candida spp. у пациентов с патологией ОДА против группы сравнения (70,1±5,6% против 12±0,5%). Кроме того, установили, что в группе больных с патологией ОДА, численность дрожжевых грибов, в среднем, составляла 7,1±1,5 lg КОЕ/г и более, тогда как в группе условно-здоровых детей показатель микробной об-семененности не превышал 3,2±1,1 lg КОЕ/г.
При оценке видового состава изолированных дрожжевых грибов в микросимбиоценозе у детей с патологией ОДА обнаружили высокую частоту встречаемости Candida albicans (в 49,1±8,1% случаев) и С. krusei (15,7±2,6%), тогда как С. tropicalis выявляли только в 5,3±0,8% случаев. В группе сравнения С. albicans наблюдали в 0,7±0,1% случаев, С. krusei - в 0,5±0,08%; других видов дрожжевых грибов не отмечали.
Исходя из концепции ассоциативного симбиоза, где симбиотические взаимоотношения организма и его микробиоты оценивают в условиях микросимбиоценоза (совокупность доминантных и ассоциативных микросимбионтов), и имеет место модификация биологических свойств микросимбионтов, определяющая гомеостаз хозяина [8], мы исследовали состав бактериально-грибковых ассоциаций под контролем персистентного потенциала грибов, изолированных от пациентов сравниваемых групп.
В результате исследования структуры микросимбиоценоза кишечника в группе сравнения дрожжевые грибы изолировали преимущественно в ассоциации с одним представителем условно-патогенной микробиоты (УПМ) (88,2±12,1% случаев) и значительно реже - с двумя и более видами УПМ (11,7±2,2%), в отличие от пациентов с патологией ОДА, где грибы высевали чаще с двумя и более представителями условно-патогенных бактерий (84,8± 14,4%), и лишь в 15,2±3,2% случаев микромицеты ассоциировались с одним представителем УПМ.
При изучении видового состава ассоциаций дрожжевых грибов с УПМ были установлены отличия в составе микросимбиоценоза у пациентов обследуемых групп. В группе условно-здоровых лиц в 11,2±1,8% случаев в ассоциации с Candida spp. обнаруживали Е. faecalis, в 7,2±1,2% - коагулазоотри-цательные стафилококки. Частота выявления бакте-рий-ассоциантов других видов (S. aureus, Klebsiella spp., Citrobacter spp., Enterobacter spp.) была значительно ниже и варьировала в пределах 3,6-4,8% случаев (р<0,05).
У обследуемых лиц с патологией ОДА, также как и в группе сравнения, в ассоциации с грибами чаще изолировали микроорганизмы вида Е. faecalis (в 60,1 ±6,8% случаев). Высокая частота встречаемо-
ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ. 2013.ТЛ5. №3
сти была характерна для ассоциаций микромицетов с лазйоз о негативными (lac -) (в 57,5+3,6% случаев) и гемолитическими (hly +) кишечными палочками (в 41,9±3,6% случаев) (р<0,05). Частота встречаемости ассоциаций грибов с другими видами бактерий (Citrobacter Spp., Klebsiella spp. и S. aureus) варьировала в пределах 8,6-26,3% случаев, превышая аналогичные показатели в группе условно-здоровых лиц в 2-7 раз.
При изучении персистентного потенциала грибов показано, что для штаммов Candida spp., изолированных из м икр ос имб и о ценоза лиц с патологией ОД Л, были характерны более высокие значения антилизоцимной (ЛЛЛ) и анти комплементарной (АКЛ) активностей, в сравнении с контингентом условно-здоровых детей. Так, АЛА дрожжевых грибов, выделенных от пациентов с патологией ОДА, составляла 2,0±0,3 мкг/мл'О] t, от здоровых лиц - 0,8 ±0,06 м к г/мл" О П. Различия в экспрессии антикомплементарной активности Candida spp. у детей исследуемых групп носили аналогичный характер: более высокие значения признака были характерны для пациентов с нарушениями ОДЛ (2,0 ±0,2 а нти-Л К К) в сравнении с группой условно-здоровых детей (1,0±0,2 анти-ЛКК),
Таким образом, установили, что патология опорно-двигательного аппарата у детей сопровождается дисбиотическими изменениями микросимбиоце-ноза дистального отдела толстого кишечника с характерным увеличением численности Candida spp. (гиперколонизация), формированием бактериально-грибковых ассоциаций и усилением персистентного потенциала грибов, что обеспечивает длительное сохранение (нерсистенцивд) микромицетов в условиях кишечного микросимбиоценоза.
Учитывая, что при формировании и функционировании микросимбиоценоза имеет значение характер межмикробных взаимодействий, что рассматривают в настоящее время с позиции биокоммуникативной активности микроорганизмов, мы оценили симбиотическиё взаимоотношений (биокоммуникацию) в бактериально-грибковых ассоциациях. В качестве критерия оценки биокоммуникативной активности акцент сделали на антилизоцимной активности микросимбионтов — универсальном показателе, одной из базовых физиологических функций - адаптации микробиоты в организме [8].
По результатам исследований выявили, что для ассоциаций С, albicans с условно-патогенными бактериями, превалирующими в микросимбиоценозе у пациентов с патологией ОДЛ, был характерен преимущественно синергидный тип взаимоотношений. Под действием сунернатантов грибов возникало усиление экспрессии антилизоцимной активности у 90±12,1% исследуемых штаммов гемолитических Е, coli и Klebsiella spp., у культур лактозонегативных Эшерихий - 87,5± 10,2% и у штаммов золотистых стафилококков - 75,8+7,4% (р<0,01) (Рис.).
К. pneumoniae icoli lac- icoli hiy+ S.aureus Bifidobacterium spp.
Рис. Биокоммуникативная активность Candida spp. v\ бактерий-симбионтов при патологии ОДА у детей
Условные обозначения:
1 - влияние метаболитов Candida spp. на ЛЛЛ бактерий; II - влияние метаболитов бактерий на ЛЛЛ Candida spp.
В - снижение экспрессии АЛЛ микрр симбионт о В - увеличение экспрессии АЛЛ микросимбионтов
Аналогичные данные об усилений АЛЛ были получены при изучении влияния супернатантов грамо-трицательных бактериальных ассоциантов на апти-лизоцимную активность С, albicans. Стимуляцию экспрессии ЛЛЛ грибов при соинкубировании с су-пернатантом гемолитических эшерихий отмечали в 54,3±8,4% случаев, под действием экзометаболитов лактозонегативных кишечных палочек - в 50±14,4% и под влиянием супернатантов клебсиелл - в 54,6+8%, Что же касается исследуемых штаммов S. aureus, то его метаболиты только в 16,7+6,2% случае» стимулировали ЛЛЛ культур С, albicans, а в 83,3+6,2% - оказывали ингибирующее воздействие па антилизо-цимную активность микромицетов.
11ротивоположный — антагонистический тип межмикробных взаимоотношений был установлен при взаимодействии Candida spp. в ассоциации с нормобиотой (В. bifldum и В. longum), составляющей доминантную группу микробиоты условно-здоровых лиц. Оказалось, что метаболиты С, albicans в 79+7,6% случаев ин гиб провал и антилизоцимную активность бифидобиоты (р<0,05), которая, в свою очередь, в 85±8,8% случаев снижала экспрессию ЛЛЛ исследуемых штаммов грибов (Рис.),
Исходя из полученных данных, установили роль микробного фактора и состава микросимбиоценоза в патологии опорно-двигательного аппарата у детей. С позиции концепции ассоциативного симбиоза, формирование патологии ОДА сопряжено не только с нарушениями метаболического статуса и работы различных органов и систем (в том числе и системы иммунитета), но и взаимосвязано с нарушениями микросимбиоценоза, сопровождающееся дисбиозом кишечника с гиперколонизацией данного биотона Candida spp. i 1ри изучении биокоммуникативных взаимодействий в бактериально-грибковых ассоциациях выявили способность условно-патогенной микробиоты усиливать персистенгные характеристики С, albicans, что, вероятно, и объясняет феномен гиперколонизации грибов у пациентов с патологией ОДЛ, определяя роль грибкового фактора в нарушении регуляции гомеостаза при данной патологии, i Еодтверждением тому служит и резкое уменьшение
доминантной микробиоты (бифидобактерий}, неспособной выполнять защитную функцию в данных условиях. Выявленные симбиотические взаимоотношения доминантной ассоциативной микробиоты определяют дисбиоз как «мишень», уст ранение которой в клинических условиях представляется первоочередной задачей клинициста.
ВЫВОДЫ
1. Патология опорно-двигательного аппарата у детей сопровождается гиперколонизацией Candida spp. за счет усиления экспрессии персистентных свойств грибов (антилизоцимной и антикомнлемен-тарной активностей) и образования бактериально-грибковых ассоциаций, способствуя формированию дисбиоза дистального отдела толстого кишечника.
2, Экспериментально in vitro установлено, что условно-патогенные бактерии усиливают нерсистсит-ный потенциал (антилизоцимную активность) С.
albicans, которые, в свою очередь, оказывают синер-гидный эффект на АЛЛ бактериальных ассоциатор что обеспечивает длительное переживание грибов в кишечном м икр ос и мби о ценозе в условиях дисбиоза.
3, Биокоммуникативная активность Candida spp,, в ассоциации с доминантной микробиотой (бифидо-бактериями), характеризуется антагонистическим типом взаимоотношений, что также объясняет факт формирования стойких диебиотических изменений микросимбиоценоза кишечника у детей с патологией ОДА, обусловленное снижением защитного действия представителей нормобиоты.
Работа выполнена по проектам фундаментальных исследований программ I [резидиума РАН № 12-П-4-1015 «Инфектологические механизмы ассоциативного симбиоза человека» и № 12-i 1-4-1045 «Изучение интеграционных механизмов межмикробных взаимодействий микросимбионтов кишечной микробиоты в паре «доминант-ассоциант».
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Бухарин О. В., Малышев А. В., Перу нона Н.Б. и др. Бактериально-грибковые ассоциации кишечника и условиях колонизации дрожженодобными грибами рода Candida // Жури, микробиол. - 2002. — № 5. — С. 45-48.
2. Челпаченко О.Е. \ Ьпогенетическое значение микробиоценоза кишечника у детей с синдромом дне плаз и и соединительной ткани и возможные пути коррекции: Автореф. дисс... док. мед. наук. - О., 2003. - 42 с,
3. Правдюк Н.Г., Шостак Н.А, Гинермобильный синдром: клинические проявления, дифференциальный диагноз, подходы к терапии // Рациональная фармакотерапия в кардиологии. - 2008, - №3, - С. 70-75.
4. Кадурина Т.И., Горбунова В.Н. Дисплазия соединительной ткани. - СПб., '2009. - 722 с.
5. Денисов-Никольский К).И., Омелъяненщ И.П., Миронов С.П., Матнейчук И.В. Костная ткань. Структурыо-функци-ональная характеристика её основных компонентов II Актуальные проблемы теоретической и клинической осте* оартрологии. - М., '2005. - С. 335-336.
6. Souza-Moreira Т.М., Sever: J.A., Lee К,, et. al, Anti-Candida targets and cytotoxicity of casuarinin isolated from Plinia caulijlora leaves in a binactivity-guided study // Molecules. - 2013, - Vol. 18, №7. - P. 8095-8108.
7. van Asbeck E.C., Clemons K.V., Stevens D.A. Candida parapsilosis: a review of its epidemiology, pathogenesis, clinical aspects, typing and antimicrobial susceptibility II Critical Rev, in Microbiol. - 2009. - Vol. 35, №4. - P. 283-309,
8. Бухарин O.B., Лобанова E.C., Перу нова Н.Б., и dp. Симбиоз и его роль в инфекции. - Екатеринбург: УрО РЛ11, 2011, - 301 с.
9. Отраслевой стандарт «Протокол ведения больных. Дисбакгериоз кишечника» (QCT 91500.11.0004-2003, утвержден 11риказом Министерства здравоохранения РФ № 231 от 09.06.2003)
10. Jousimies-Somer H.R., Suwm&nen P., Baron Б. J., et cd. Wads worth-KTL anaerobic bacteriology manual. 6th ed. - Belmont, СЛ: Star Publishing, - 2002. - 287 p.
П. Перуном Н.Б., Иванова Б. В. Влияние биф идо бактерий на антилизоцимную активность микроорганизмов и их способность к образованию бионленок П Журн. микробиол, - 2009, - № 4, - С. 4-6-49,
Поступила в редакцию журнала 02.09,2013
Рецензенты: ТЖ Тимохина, А.В, Лазарева
