CC BY
17© С.В.ТИТОВА, Л.П.АЛЕКСЕЕВА, 2017
С.В.Титова, Л.П.Алексеева
РОЛЬ КВОРУМ-СЕНСИНГ В РЕГУЛЯЦИИ ОБРАЗОВАНИЯ БИОПЛЕНОК ХОЛЕРНЫМИ ВИБРИОНАМИ
Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт
Представлены материалы в отношении кворум-сенсинга, который является главным регулятором межклеточных коммуникаций у холерных вибрионов. Передача информации между отдельными вибрионами осуществляется посредством аутоиндукгоров. Их взаимодействие с регуляторными белками способствует активации генов, участвующих в образовании биопленки холерных вибрионов, которая обеспечивает их выживание и распространение.
Журн. микробиол., 2017, № 1, С. 115-119
Ключевые слова: холерные вибрионы, биопленка, окружающая среда, факторы патоген-ности
S. V. Titova, L.P.Alekseeva
THE ROLE OF QUORUM-SENSING IN REGULATION OF FORMATION OF BIOFILMS BY VIBRIO CHOLERAE
Rostov-on-Don Research Institute for Plague Control, Russia
Materials regarding quorum-sensing that is the main regulator of inter-cellular communications in V.cholerae are presented. Information transmission between separate vibrios is executed via autoinductors. Their interaction with regulatory proteins facilitates gene activation that take part in formation of biofilms of V.cholerae which ensures their survival and spread.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2017, No. 2, P. 115-119
Key words: V.cholerae, biofilm, environment, pathogenicity factors
Для сообщения между собой в окружающей среде и в организме человека холерные вибрионы также, как и другие бактерии, используют процесс кворум-сенсинга, который обеспечивает межклеточные коммуникации V.cholerae, регулируя экспрессию нескольких фенотипов, в том числе, формирование биопленки, продукцию факторов вирулентности, подвижность, питательные потребности в ответ на изменение плотности клеток [6, 19, 21]. Регуляция осуществляется в результате продукции малых моле-кул-аутоиндукторов, легко диффундирующих через клеточную стенку возбудителя и связывающихся с регуляторными белками бактерии. Ауто-индукторы осуществляют передачу информации между отдельными клетками бактерий, принадлежащих не только одному, но и разным родам и семействам [11].
Кворум-сенсинг V.cholerae включает внеклеточные сигнальные моле-кулы-аутоиндукторы CAI-1 (5-3-гидрокситридекан-4-она) и связанный с мембраной рецептор CqsS (двухкомпонентная сенсорная гистидинкиназа), которая узнает CAI-1, а фосфорилированный каскад CqsS — >LuxU — >LuxO осуществляет передачу информации, заложенной в CAI-I. Этот каскад спо-
собствует дальнейшей передаче сигналов, что влечет за собой изменение экспрессии регулятора транскрипции HapR. В то же время, двукомпонентная система VarS-VarA, действуя на каскад CqsS — >LuxU — >LuxO, который располагается перед HapR, регулирует уровень его экспрессии. Ее влияние на кворум-сенсинг зависит от малых РНК, которые регулируют метаболизм углерода и интефируют сенсорные сигналы о наличии питательных веществ в окружающей среде [13,19].
Исследования, проведенные Y.Wei et al. [21], показали, что CAI-1 ингиби-рует первоначальное аутофосфорилирование двукомпонентной сенсорной гистидинкиназы (CqsS) и последующие этапы фосфопереноса, а фосфатазная активность CqsS не регулируется CAI-1. При связывании с CqsS молекула CAI-1 вызывает конформационное изменение, приводящее к недоступности Hisl94 в белке CqsS для каталитического домена CqsS. Установлено, что мутанты CqsS с измененной специфичностью узнавания лигандов эффективно регулируются соответствующими им модифицированными лигандами, что согласуется с моделью двух состояний регуляции лигандами гистидинкиназ [21].
Было также обнаружено, что две химические сигнальные системы, кворум-сенсинг и 3'5'-циклическая дигуаниловая кислота (ц-ди-ГМФ, синтезируемая дигуанилатциклазами, содержащими GGDEF домен), аутоиндукторы которых контролируют изменение в образе жизни бактерий, в частности, образования биопленок холерными вибрионами, оказывая при этом противоположное действие на этот процесс. Оказалось, что кворум-сенсинг подавляет, а ц-ди-ГМФ активирует процесс формирования биопленок. Показано, что белок HapR контролирует транскрипцию 14 генов, кодирующих группу белков, которые синтезируют и разрушают ц-ди-ГМФ. Видимо, холерные вибрионы получают сигналы о бактериальном сообществе с помощью внеклеточных аутоиндукторов кворум-сенсинга и внутриклеточную информацию посредством ц-ди-ГМФ для регуляции процесса формирования биопленок [9, 20].
Различные сигналы, поступающие из окружающей среды, регулируют экспрессию сигналов кворум-сенсинга. При высокой плотности клеток у холерных вибрионов включается несколько путей передачи сигналов системы кворум-сенсинга, ведущих к активации основного регулятора белка HapR, который затем репрессирует гены регулона вирулентности, гены формирования биопленки и активирует продукцию протеаз. Идентифицирован также регулятор транскрипции VqmA, который активирует экспрессию гена hapR при низкой плотности клеток. Белок VqmA повышает уровень транскрипции гена hapR. При этом белок VqmA регулирует транскрипцию гена hapR, непосредственно связываясь с его промотором, а экспрессия гена vqmA регулируется и полностью зависит от плотности клеток в среде [8].
Помимо известного регулятора кворум-сенсинга LuxU у бактерий, относящихся к роду Vibrio, был обнаружен другой важный регулятор кворум-сенсинга — AphA, функционирующий также при низкой плотности клеток. Результаты компьютерного анализа показали, что три гена — ahpA, qrr4 и opaR — являются непосредственными мишенями регулятора AphA [17].
Молекулы, которые активируют кворум-сенсинг у холерных вибрионов, потенциально способны контролировать их патогенность. Идентифицировано 11 молекул, активирующих кворум-сенсинг холерных вибрионов: восемь из
них являются антагонистами рецепторов, а три — антагонистами LuxO, который регулирует общий каскад кворум-сенсинга [13,14].
Поедание простейшими организмами является основным фактором гибели вибрионов в воде. В экспериментах с инфузориями Paramecium caudatum их взаимоотношения с холерными вибрионами характеризуются как хищник — жертва, где инфузории выступают в роли хищника [3]. В свою очередь, вибрионы используют хитиновые панцири ракообразных в качестве питательных веществ. Взаимодействие V. cholerae с хитином осуществляется на разных иерархических уровнях. К ним относятся метаболические и физиологические реакции клеток: хемотаксис, размножение клеток, индукция компетентности, формирование биопленок, круговорот питательных веществ [15]. При этом метаболизировать хитин могут все представители семейства Vibrionaceae, содержащие ген хитиназы (chiA) [7].
Изучены ферменты хитинолитического комплекса холерного вибриона, такие как хитиназа и N-ацетил-р-Д-глюкозаминидаза, играющие важную роль в сохранении, выживании, питании и формировании новых форм возбудителя в окружающей среде [1,2].
Глобальный регулятор кворум-сенсинга HapR играет важную роль в обеспечении устойчивости бактерий к поеданию: индуцирует формирование биопленки, повышая уровень экспрессии полисахарида (VPS), что ускоряет переход от гладкого к ругозному морфологическому типу колоний с последующим образованием биопленки. Исследования, проведенные S. Sun et al. [8], показали, что штаммы дикого типа наиболее устойчивы к поеданию, мутанты с повышенным уровнем продукции полисахарида — менее устойчивы, но более устойчивы, чем мутанты по кворум-сенсингу. Было установлено, что кворум-сенсинг участвует в обеспечении устойчивости к поеданию преимущественно на стадии зрелой биопленки. Для формирования зрелой биопленки вибрионам необходима продукция компонентов внеклеточного матрикса, к которым относятся экзополисахарид и белки матрикса. Формирование биопленки положительно регулируется регуляторами транскрипции VpsR и VpsT и отрицательно — регулятором транскрипции системы кворум-сенсинга HapR, а также регуляторным комплексом — цАМФ-рецепторный белок (ЦРБ) [5,18]. Секреция внеклеточных полимерных веществ в виде экзополисахарида (EPS) связывает бактериальные сообщества воедино. Клетки, продуцирующие EPS, обладают селективными преимуществами в сравнении со штаммами, не продуцирующим EPS [12]. Исследования этих авторов показали, что EPS-продуцирующие клетки лишены способности к распространению в новые места обитания. Следовательно, у бактерий существует выбор между преимуществом местной конкуренции и способностью к распространению.
Установлено, что приобретение генетического материала посредством естественной компетентности и трансформации между бактериями происходит в верхнем отделе кишечника и на поверхности хитина, где индуцируется программа осуществления трансформации — горизонтального переноса генов. Естественная компетентность способствует поглощению свободной ДНК и ее рекомбинации в бактериальном геноме. Хитин играет важную роль в развитии природной компетентности бактерий, необходимой для преобразований у некоторых видов рода Vibrio. Исследования, проведенные G. Suckow et al. [16], показали, что в процессе этих преобразований на уровне
поглощения ДНК холерный вибрион не различает ее как видоспецифическую структуру. Однако при этом наблюдалась положительная корреляция между кворум-сенсингом и естественной трансформацией. Показано, что именно видоспецифическая сигнальная молекула CAI-1 играет главную роль в природной компетентности, необходимой для появления вибрионов с приобретенными генами [16].
По мнению М. Lo Scrudato et al. [10], несмотря на то, что хитиновые поверхности необходимы, их одних недостаточно для индукции компетентности. В процессе компетентности участвуют главные регуляторы кворум-сенсинга — TfoX и HapR, а также два дополнительных регуляторных пути — катаболит-ная репрессия и кворум-сенсинг. Они и являются компонентами регуляторной сети, осуществляющей регуляцию естественной компетентности. Изучение связи между индукцией хитином и кворум-сенсингом выявило, что белок HapR специфично связывается с промотором гена qstR, что указывает на роль белка HapR как активатора гена qstR, а белок QstR подавляет индуцируемую хитином активность белка TfoX, являющегося регулятором кворум-сенсинга. Можно сказать, что белок OstR необходим для экспрессии небольшой, но, тем не менее, значимой подгруппы генов компетентности [10].
В биопленках, состоящих из смешанных видов бактерий, образованных на хитиновых поверхностях, холерные вибрионы также приобретают естественную компетентность и поглощают внеклеточную ДНК. Показано, что транскрипция гена компетентности сошЕА и поглощение ДНК бактерий индуцируют CAI-1 и AG-2, а также аутоиндукторы других представителей вибрионов, образующих совместно с V. cholerae биопленку [4].
Таким образом, система кворум-сенсинга контролирует групповое поведение холерных вибрионов: обеспечивает формирование биопленок в кишечнике человека и в окружающей среде, создает селективное преимущество патогенным вибрионам, способствуя их распространению и естественной трансформации.
Установлено, что кворум-сенсинг — это особый вид регуляции экспрессии холерных вибрионов, зависимый от плотности популяции бактерий. Процесс кворум-сенсинга включает низкомолекулярные сигнальные молекулы, аутоиндукторы, способные диффундировать через бактериальную клеточную стенку и связываться с регуляторными белками. По мере роста популяции бактерий и достижения ими критического уровня аутоиндукторы взаимодействуют с регуляторными белками, и это приводит к активации генов, в том числе таких факторов, как вирулентность и образование биопленки. Благодаря кворум-сенсингу холерные вибрионы получают возможность координирование контролировать экспрессию генов во всем сообществе. Функциональная система кворум-сенсинга обеспечивает бактериям значительное преимущество в выживании как в организме людей, так и в окружающей среде, в частности, биопленках, образующихся как в кишечнике, так и на хитиновых поверхностях водных животных и растений, где возбудитель приобретает естественную компетентность для поглощения внеклеточной ДНК.
ЛИТЕРАТУРА
1. Дуванова О.В., Мишанькин Б.Н., Водопьянов A.C. Некоторые свойства N-auemn-ß-Д-глюкозаминидазы холерного вибриона. Холера и патогенные для человека вибрионы. Материалы проблемной комиссии. Ростов-на-Дону, 2014, 27: 105-108.
2. Мишанькин Б.Н., Шиманюк Н.Я., Водопьянов С.О. Изучение хитинолитического комплекса холерного вибриона сероварианта 0139. Биотехнология. 2010,1: 32-40.
3. Титова С.В. Взаимоотношения холерных вибрионов с представителями планктона водоемов средних широт в условиях эксперимента: Автореф. дис. канд. мед. наук. Ростов-на-Дону, 2000.
4. Antonova E.S., Hammer В.К. Quorum-sensing autoinducer molecules produced by members of a multispecies biofflm promote horizontal gene transfer to Vibrio cholera. FEMS Microbiol. Lett. 2011,322(1): 68-76.
5. Fong J.C., Yildiz F.H. Interplay between cAMP-CRP and c-di-GMP signaling in Vibrio chol-erae biofflm formation. J. Bacteriol. 2008,190 (20): 6646-6659.
6. Hammer B.K., BasslerB.L. Quorum sensing controls biofflm formation in Vibrio cholera. Mol. Microbiol. 2003, 50 (1): 101-104.
7. Hunt D.E., Gevers D., Vahora N.M. et al. Conservation of the chitin utilization pathway in the Vibrionaceae. Appl. Environ. Microbiol. 2008,74 (1): 44-51.
8. Liu X., Beyhan S., Lim B. et al. Identification and characterization of a phosphodiesterase that inversely regulates motility and biofflm formation in Vibrio cholera. J. Bacteriol. 2010,192 (18): 4541-4552.
9. Liu Z., Hsiao A., Joelsson A., Zhu J. The transcriptional regulator VqmA increases expression of the quorum-sensing activator HapR in Vibrio cholera. J. Bacteriol. 2006, 188 (7): 24462453.
10. Lo Scrudato M., Blokesch M. A transcriptional regulator linking quorum sensing and chitin induction to render Vibrio cholerae naturally transformable. Nucleic Acids Res. 2013; 41(6): 3644-3658.
11. Miller J., Miller M.C., Nielsen A.T. et al. vpsA- and luxO-independent biofflms of Vibrio cholera. FEMS Microbiol. Lett. 2007, 275 (2): 199-206.
12. Nadell C. D., Bassler B. L. A fitness trade-off between local competition and dicpersal in Vibrio cholera biofflms. PNAS USA. 2011, 108 (34): 14181-14185.
13. Ng W.L., Perez L., Cong J. et al. Broad spectrum pro-quorum-sensing molecules as inhibitors of virulence in vibrios. PLoS Pathog. 2012, 8 (6): el002767.
14. Perez L.J., Ng W.L., Marano P. et al. Role of the CAI-1 fatty acid tail in the Vibrio cholerae quorum sensing response. J. Med. Chem. 2012, 55 (22): 9669-9681.
15. Pruzzo C., Vezzulli L., Colwell R.R. Global impact ofVibrio cholerae interactions with chitin. Environ. Microbiol. 2008,10 (6): 1400-1410.
16. Suckow G., Seitz P., Blokesch M. Quorum sensing contributes to natural transformation of Vibrio cholerae in a species-specific manner. J. Bacteriol. 2011,193 (18): 4914-4924.
17. Sun F., Zhang Y., Wang L. et al. Molecular characterization of direct target genes and cis-acting consensus recognized by quorum-sensing regulator AphA in Vibrio parahaemolyticus. PLoS One. 2012, 7 (9): 44210.
18.Sun S., Kjelleberg S., McDougald D. Relative contributions ofVibrio polysaccharide and quorum sensing to the resistance of Vibrio cholerae to predation by heterotrophic protists. PLoS One. 2013, 8 (2): e56338.
19. Tsou A.M., Liu Z., Cai T. et al. The VarS/VarA two-component system modulates the activity of the Vibrio cholerae quorum-sensing transcriptional regulator HapR. Microbiology. 2011, 157 (Pt6): 1620-1628.
20. WktersC.M., Lu W., RabinowitzJ.D. etal. Quorum sensing control biofilm formation in Vibrio cholerae through modulation of cyclic Di-GMP levels and repression of vpsT. J. Bacteriol. 2008, 190 (7): 2527-2536.
21. Wei Y., Ng W.L., Cong J. et al. Ligand and antagonist driven regulation of the Vibrio cholerae quorum-sensing receptor CqsS. Mol. Microbiol. 2012, 83 (6): 1095-1108.
Поступила 04.08.16
Контактная информация: Алексеева Людмила Павловна, д.б.н.,
344002, Ростов-на-Дону, ул. Горького, 117/40, р.т. (863)240-27-03
