CC BY
73
УДК 618.145-07 DOI: 10.17816/JOWD662104-111
РОЛЬ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗ В ТКАНИ ЭНДОМЕТРИЯ: ФАКТЫ, ГИПОТЕЗЫ, ПЕРСПЕКТИВЫ ИЗУЧЕНИЯ
© А.В. Разыграев1, 2, М.О. Матросова 3, И.А. Титович2
1 ФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург;
2 ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия», Санкт-Петербург;
3 Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого, Санкт-Петербург
Для цитирования: Журнал акушерства и женских болезней. - 2017. - Т. 66. - № 2. - С. 104-111. doi: 10.17816/JOWD662104-111
Поступила в редакцию: 02.03.2017 Принята к печати: 07.04.2017
■ Ферменты группы глутатионпероксидаз (GPX) наряду с пероксиредоксинами составляют семейство тиолперокси-даз — ферментов, катализирующих тиолзависимое восстановление H2O2 и органических гидропероксидов. Это обусловливает их защитную роль при окислительном стрессе. Среди GPX у человека различают 8 форм, 5 из которых (GPX1,2,3,4 и 6) — селензависимые. Наибольшее число фактов, подтверждающих большое значение GPX в функционировании эндометрия матки, относятся к ферменту GPX3 (секретируемая GPX). Промотор гена GPX3 содержит больше вероятных прогестерон-чувствительных элементов нежели эстроген-чувствительных; экспрессия гена GPX3 в эндометрии усиливается после овуляции и во время беременности; в строме эндометрия прогестерон усиливает транскрипцию Gpx3 через транскрипционный фактор HIF1a. На лабораторных животных показана сопряженность активации гена Gpx3 и экспрессии белка GPX3 в строме и имплантации бластоцисты в стенку матки. Подтверждено, что GPX3 снижает концентрацию H2O2 в эндометрии при беременности и при децидуализации in vitro. Предполагается уязвимость репродуктивной функции при физиологическом стрессе при недостаточной экспрессии GPX3 в эндометрии. Количественно и селективно ферментативная активность GPX3 в эндометрии изучена очень слабо. Сформирована гипотеза о возможной эффективности селенсодержащих препаратов для повышения рецептивности эндометрия и поддержания нормального развития эмбриона (особенно в условиях физиологического стресса) через усиление посттранскрипционного этапа синтеза GPX3 в эндометрии. Вероятно, экспрессия GPX3 в эндометрии может быть увеличена также за счет применения гестагенных стероидных препаратов (через усиление транскрипции гена GPX3). GPX3 имеет широкую тиоловую специфичность по сравнению с цитозольным ферментом GPX1 и, вероятно, по сравнению с большинством других форм GPX. Исследование ферментативной активности GPX3 предлагается проводить с использованием гомоцистеина и цистеина в качестве тиоловых субстратов вместо глутатиона.
■ Ключевые слова: экспрессия гена GPX3; эндометрий; периодичность; селен; прогестерон.
SIGNIFICANCE OF GLUTATHIONE PEROXIDASES IN ENDOMETRIUM FUNCTION: FACTS, HYPOTHESES, AND RESEARCH PERSPECTIVES
© A.V. Razygraev1, 2, M.O. Matrosova3, I.A. Titovich2
1 FSBSI "The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott", Saint Petersburg, Russia;
2 Saint Petersburg State Chemical-Pharmaceutical Academy, Saint Petersburg, Russia;
3 Peter the Great Saint Petersburg Polytechnic University, Saint Petersburg, Russia
For citation: Journal of Obstetrics and Women's Diseases. 2017;66(2):104-111. doi: 10.17816/JOWD662104-111
Received: 02.03.2017 Accepted: 07.04.2017
■ Enzymes of glutathione peroxidase (GPX) family, together with peroxiredoxins, form thiol peroxidase superfamily, the property of which is the thiol-dependent catalysis of the hydroperoxide reduction. This property determines them as antioxidant protectors. Among human GPXs the eight forms are known, five of which are selenium-dependent (GPX1,2,3,4, and 6). The most number of facts supporting the substantial role of GPX in functioning of endometrium are linked with the GPX3, which is the secretory GPX. The number of candidate progesterone response elements in the promoter of GPX3 gene prevails over the number of candidate estrogen response elements; GPX3 is upregulated gene during postovulatory phase of reproductive cycle and during pregnancy; in the endometrial stroma, the transcription of Gpx3 is stimulated through the transcription factor HIF1a. Using laboratory animals, the spatial and temporal
coincidence of Gpx3 activation and blastocyst implantation was observed. It was confirmed that GPX3 decreases hydrogen peroxide concentration in endometrium in pregnant animals and during in vitro decidualization. The vulnerability of reproductive function to physiological stress at the insufficient expression of GPX3 is hypothesized. The GPX3 enzymatic activity in endometrium is poorly investigated. The has been hypothesized that selenium-containing medications are effective in the endometrium receptivity improvement and in the supporting the normal embryo development (especially during the influence of physiological stressors) by the maintenance of the posttranscriptional, selenium-dependent stage of GPX3 biosynthesis in endometrium. Probably, the GPX3 expression can be increased by the steriods with gestagenic activity (through the increase of Gpx3 transcription, analogously to effect of progesterone). In contrast with the «classic» GPX (GPX1) and probably with most of other members of GPX family, GPX3 has a wide thiol specificity. It is proposed to assess the activity of GPX3 using the reduced homocysteine and cysteine as thiol substrates instead of the reduced glutathione.
■ Keywords: glutathione peroxidase; gene expression; endometrium; periodicity; selenium; progesterone.
Ферменты группы глутатионпероксидаз (GPX) распространены по всему животному царству [1, 2]. Эти ферменты входят в суперсемейство тиолпероксидаз, катализирующих тиолзависимое восстановление неорганических (H2O2) и органических гидропероксидов.
Восстановленный глутатион (GSH) — тиол, который in vivo является донором электронов, вовлеченным в каталитический цикл GPX [1, 3]. Катализ восстановления гидропероксидов посредством GPX протекает в три этапа, два последних из которых являются тиолзависимыми (GSH-зависимыми); общая схема реакции выглядит следующим образом:
2 GSH + ROOH * GS-SG + H2O + ROH, где GS-SG, ROOH и ROH означают соответственно окисленный глутатион, гидропероксид и гидроксипроизводное (в том случае, если восстанавливаемый гидропероксид H2O2 в качестве гидроксипроизводного выступает вторая молекула воды [1]). Аэробный метаболизм ведет к продукции пероксида водорода и органических гидропероксидов в тканях; GPX наряду с другими тиолпероксидазами принимает участие в регуляции уровня гидропероксидов, которые при повышенной продукции оказывают токсическое действие [4]. Среди других функций GPX — ингибирование апоптоза и воспалительных процессов, модуляция каскадов сигналинга, участие в активации транскрипционных факторов [1].
У человека различают восемь форм GPX, пять из которых (GPX1,2,3,4 и 6) являются селенза-висимыми, а именно содержат остаток селено-цистеина в активном центре. Селензависимые GPX преобладают у позвоночных, тогда как гомологи GPX, у которых вместо селеноцисте-инового остатка в активном центре находится остаток цистеина, найдены у растений, дрожжей, простейших и бактерий. Селеновые GPX
спорадически обнаруживаются у беспозвоночных, таких как членистоногие и трематоды; се-леноцистеин-содержащая GPX также найдена у зеленых водорослей [1].
«Классическая», или цитоплазматическая, GPX ^РХ1) состоит из четырех субъединиц, функционирует внутри клеток тканей и является необходимой в защите от генерализованного окислительного стресса. Мыши, мутант-ные по обоим аллелям гена Орх1, гибнут при остром окислительном стрессе независимо от обеспечения организма селеном, тогда как мыши, имеющие аллели дикого типа, выживают в этих условиях при обеспечении селеном [5].
GPX желудочно-кишечного тракта ^РХ2) — цитозольный гомотетрамер, сходный с GPX1. Экспрессируется главным образом в эпителии пищеварительного тракта, включая эпителий пищевода. У человека экспрессируется также и в печени. Наибольшие концентрации GPX2 найдены у основания крипт кишечника. В развивающемся эмбрионе экспрессия мРНК Орх2 преобладает в быстрорастущих тканях. Очень вероятно, что функции GPX2 тесно связаны с пролиферацией тканей [5, 6].
GPX плазмы, или экстраклеточная GPX ^РХЗ), как и многие белки плазмы крови, является гликопротеином. Так же как GPX1 и GPX2, это гомотетрамерный фермент. Кроме плазмы крови GPX3 обнаруживается в других жидкостях тела, в том числе в амниотиче-ской жидкости. Основной источник секреции GPX3 — почки. GPX3, секретированная почками, обладает способностью связываться с ба-зальными мембранами эпителиальных тканей в других органах. Для плазмы крови характерны низкие концентрации GSH, и поэтому предполагается, что GPX3 не может эффективно с ним взаимодействовать. Функции GPX3 во многом
остаются загадкой. Гиперметилирование промотора гена Gpx3 встречается в подавляющем большинстве образцов при некоторых видах онкологических заболеваний, включая рак эндометрия и простаты [5, 7].
GPX гидроперекисей фосфолипидов (GPX4) — мономерный белок, существует в трех изоформах (цитозольная, митохондри-альная и GPX4 ядер клеток спермы), синтезирующихся с одного и того же гена за счет наличия альтернативных транскрипционных стартов. Цитозольная изоформа экспрессируется во всех тканях, тогда как остальные две — преимущественно в семенниках. Системный нокаут всего гена Gpx4 летален (без цитозоль-ной GPX4 невозможен нормальный эмбриогенез), но при нокауте, приводящем к отсутствию митохондриальной формы, мыши полностью жизнеспособны (правда, самцы при этом полностью инфертильны). Цитозольная GPX4 важна не только в эмбриогенезе, она выполняет нейропротекторную функцию у взрослых, возможно, благодаря своему высокому сродству к гидроперекисям липидов [5].
GPX5 — гомотетрамерная неселеновая GPX, специфичная для придатков семенников (образуется в эпителии головки придатка семенника), ее ближайший гомолог — GPX3, вместе с которой они составляют более 95 % мРНК и белков GPX в эпидидимисе. GPX5 секрети-руется в лумен эпидидимиса, связывается с головками сперматозоидов и предотвращает их повреждение гидропероксидами. Возможно, GPX5 предотвращает преждевременную реакцию акросом сперматозоидов во время их хранения в хвосте придатка яичка [5, 8].
GPX6 — гомотетрамер, также гомолог GPX3, селенопротеин у человека и неселеновая GPX у грызунов и других животных. Экспрессия Gpx6 выявлена в эмбрионах мышей и в боуменовых железах под обонятельным эпителием. О функциях GPX6 не известно ничего определенного [5].
GPX7 — мономерная неселеновая GPX гидроперекисей фосфолипидов, гомологичная селеновой GPX4. Это белок цитозоля и лумена эндоплазматического ретикулума, не ткане-специфичен. GPX8 — GPX, по своим структурным характеристикам также относимая к белкам эндоплазматического ретикулума. Предполагается, что GPX7 и GPX8 участвуют в фолдинге белков, включающем в себя формирование дисульфидных связей [5].
Строгая зависимость функционирования селензависимых GPX от GSH характерна
не для всех ферментов этого семейства. Хотя GPX принято называть глутатионзависимы-ми ферментами, GPX3 (секретируемая GPX) хорошо функционирует как тиолпероксидаза с широкой тиоловой специфичностью и может использовать цистеин, тиоредоксин и глутаре-доксин вместо GSH [3, 9], становясь полностью независимой от GSH в своем каталитическом цикле при наличии других тиолов в среде. Статистически обосновано (на фракциях белков плазмы крови), что GPX3 способна использовать гомоцистеин (HcySH) вместо GSH; опять же присутствие GSH в среде совершенно не требуется [10]. Для GPX4 также характерна способность использовать другие тиоловые восстановители вместо GSH — белки хроматина, цистеинбогатые белки, связанные с митохондриями клеток спермы, и даже саму GPX4 в качестве тиолового восстановителя. При этом, правда, GPX4 не способна использовать для своей функции тиоредоксин. Внутриклеточная GPX1, напротив, довольно строго специфична к GSH, но в условиях недостатка GSH GPX1 успешно использует его предшественник (гам-ма-глутамилцистеин) [5]. В старых работах, когда еще не было известно вышеперечисленное разнообразие GPX, для GPX митохондрий печени было установлено, что на одном из двух тиолзависимых этапов каталитической реакции GPX строго специфична к GSH; на другом тиолзависимом этапе GSH может быть заменен на другой тиол [11, 12].
Как GPX могут функционировать и некоторые другие белки, не относимые к данному семейству: это пероксиредоксины, входящие вместе с GPX в суперсемейство тиолпероксидаз, а также глутатионтрансферазы, селенопроте-ин Р и даже сывороточный альбумин. Последние три из упомянутых белков и групп ферментов, правда, имеют иную, более узкую субстратную специфичность по отношению к гидроперокси-дам в тиолпероксидазной реакции [3, 13-15].
Исследования экспрессии глутатионпероксидаз в ткани эндометрия женщин
Эндометрий человека — сложная ткань, подвергающаяся циклическим изменениям, что требует взаимодействия друг с другом сотен биохимических факторов. В идеале нормальный эндометрий человека имеет 28-дневный цикл изменений, контролируемых половыми стероидными гормонами — эстрогеном и прогестероном. Стероидные гормоны осущест-
вляют свое действие посредством связывания со своими рецепторами (эстрогеновые рецепторы-a и -в (ER-a и ER-в) и рецептор прогестерона (PR)). Рецепторы лиганд-зависимым путем регулируют транскрипцию генов в клетках эндометрия. Для запуска транскрипции рецепторы образуют гомодимеры и связываются с соответствующим гормоном; образовавшийся комплекс связывается со стероид-реактивным участком ДНК (стероид-реактивным элементом), регулирующим ген-мишень, что активирует транскрипционные факторы и инициирует транскрипцию гена. Вышеописанные события происходят в стромальных клетках эндометрия, которые в ответ на стероидный стимул продуцируют паракринные факторы, приводящие к митозам клеток эпителия матки [16].
Существует ряд работ по изучению транскрипционного профиля эндометрия человека в ходе менструального цикла и при нарушениях рецептивности эндометрия; при этом среди генов ферментов группы GPX исследователи наблюдают существенные изменения в активности гена GPX3 [16-20]. GPX3--транскрипт имеет очень низкий уровень в эндометриаль-ной ткани в пролиферативной фазе менструального цикла, тогда как в секреторной фазе, когда доминирует уровень прогестерона, уровень GPX3-транскрипта повышается в десятки раз [16]. При этом в промоторной части гена GPX3 идентифицируется три вероятных прогестерон-реактивных элемента и два вероятных эстроген-реактивных элемента. (Аналогичным образом у других генов, транскрибируемых преимущественно в секреторной фазе, количество вероятных прогестерон-реактивных элементов преобладает над количеством вероятных эстроген-реактивных элементов.) Данные факты свидетельствуют в пользу того, что ген GPX3 позитивно регулируется прогестероном [16]. Поскольку уровень экспрессии гена GPX3 растет и после времени имплантации (т. е. далее после 7-го дня, считая от времени пика секреции лютеинизирующего гормона), есть мнение, что экспрессия GPX3 в эндометрии важна больше в процессах, связанных с менструацией нежели с имплантацией эмбриона [19].
Свободнорадикальные повреждения вовлечены в патофизиологию многих органов и тканей, включая эндометрий. Биосинтез се-кретируемой GPX, GPX3, устраняющей продукты перекисного окисления биомолекул во внеклеточной среде, зависит от наличия селена.
При этом имеются данные о том, что дефицит селена ассоциирован со спонтанными абортами и бесплодием [21]. На основании этих данных и совокупности перечисленных данных о GPX3 остается обоснованным предположение, что GPX3 эндометрия функционирует в периимплантационный период для защиты развивающегося эмбриона от окислительных повреждений, в том числе для обеспечения его безопасной (в этом же смысле) имплантации в стенку матки [16].
Другим ферментом семейства GPX, для которого показаны циклические изменения экспрессии в эндометрии в ходе менструального цикла, является GPX1 [16, 22]. Экспрессия GPX1 была идентифицирована в поверхностных и железистых эпителиальных клетках иммуногисто-химически с использованием поликлональных антител к белку-ферменту. Уровень экспрессии GPX1 в железистых клетках эпителия был низким в ранней пролиферативной фазе, затем постепенно увеличивался, достигал максимума в ранней секреторной фазе и снижался к концу секреторной фазы. В поверхностном эпителии динамика экспрессии была аналогичной. Получается, что, в отличие от экспрессии GPX3, уровень мРНК которой высок в период имплантации, уровень экспрессии GPX1 в данный период уже снижается. Вероятно, цикличность продукции GPX1 в эпителии эндометрия и цикличность экспрессии GPX3 эндометрием имеют существенные различия в функциональном отношении.
Исследования экспрессии глутатионпероксидаз в ткани эндометрия лабораторных животных
В 2014 г. в FEBS Letters была опубликована работа [23], выполненная главным образом на мышах, указывающая на тесную связь экспрессии GPX3 в стромальных клетках эндометрия с децидуализацией эндометрия и имплантацией бластоцисты в стенку матки. Результаты этой работы объясняют механизмы, по которым происходит регуляция экспрессии GPX3 в эндометрии.
Заранее оговоримся, что у грызунов имплантация эмбриона в стенку матки у разных особей может происходить очень несинхронно, начиная с начала 4-го дня беременности. Даже в конце 5-го дня нормальной беременности имплантация может все еще не произойти [24]. Но, вероятно, мыши, используемые в работе [23], были очень сходны между собой по времени имплантации
при нормальной беременности. С использованием меченной дигоксигенином кРНК (комплементарной к мРНК Gpx3 (метод гибридизации in situ)) было установлено, что мРНК Gpx3 не экспрессируется в регистрируемых количествах с 1-го по 4-й день нормальной беременности. Начиная с 5-го дня мРНК Gpx3 проявляется в строме эндометрия ближе к просвету матки, причем непосредственно вокруг имплантирующейся бластоцисты. В последующие дни беременности экспрессия мРНК Gpx3 усиливается и распространяется по строме в процессе деци-дуализации. В ходе количественной оценки методом ПЦР (ПЦР в реальном времени) установлено, что к 8-му дню беременности экспрессия мРНК Gpx3 в эндометрии возрастает в сотни раз по сравнению с 4-м днем (при использовании этого метода в эндометрии на 4-й день беременности регистрируется некоторый (не нулевой) уровень мРНК Gpx3, принятый за единицу). Экспрессия мРНК Gpx4 тоже повышается к 8-му дню по сравнению с уровнями в 4-й и 5-й дни, но не столь значительно, а экспрессия мРНК Gpx2, наоборот, к 8-му дню сильно снижается. Выявленное авторами увеличение экспрессии мРНК Gpxl на 8-й день беременности, возможно, не является статистически значимым, поскольку из работы не ясно, каким методом пользовались авторы для статистических сравнений, а прирост экспрессии по сравнению с 4-м и 5-м днями сравнительно мал. Экспрессия мРНК Gpx5, Gpx6 и Gpx7 в эндометрии была очень слабой в исследуемый период (1-8-й дни беременности) [23].
При задержке имплантации с последующей ее активацией эстрогеном опять-таки выявлено увеличение экспрессии мРНК Gpx3 методом гибридизации in situ до хорошо детектируемого уровня в строме, окружающей имплантирующийся эмбрион. При искусственной дециду-ализации посредством инъекции масла в рог матки также выявлен высокий уровень экспрессии мРНК Gpx3 в клетках стромы. В роге матки, который не подвергался инъекции, экспрессия мРНК Gpx3 регистрировалась в поверхностном эпителии эндометрия и в меньшей степени в железистом эпителии, но не в клетках стромы [23].
На овариэктомированных мышах и на эн-дометриальных стромальных клетках in vitro было установлено, что прогестерон усиливает экспрессию мРНК Gpx3; этот эффект опосредован рецептором прогестерона и транскрипционным фактором HIFla. При децидуализации in vitro (при обработке прогестероном вместе
с эстрогеном) экспрессия мРНК Gpx3 усиливается в клетках стромы в несколько десятков раз в течение 96 часов от начала обработки. В опытах in vitro установлена необходимость добавления соединений селена (селенит натрия — в концентрациях порядка 0,1 мкМ) в культуральную среду с клетками эндометрия для экспрессии в них белка GPX3, что понятно, поскольку селен включается в состав молекулы фермента при трансляции (без него белковая молекула не синтезируется [25]). Получены данные, свидетельствующие в пользу того, что GPX3 снижает концентрацию пероксида водорода в строме [23].
В других исследованиях показано наличие GPX3 в жидкостях, окружающих развивающийся эмбрион. Gpx3 экспрессируется в тканях на контакте развивающегося эмбриона и материнского организма — материнском децидууме, эндодерме желточного мешка и в эмбриональной коже [21].
Ранние этапы беременности уязвимы для стрессовых состояний, что может выражаться как в нарушении имплантации, так и в патологиях развития раннего эмбриона. Реактивные формы кислорода часто вовлечены в возникновение различных патологий, включая инфертильность. Как видно из рассмотренных данных, среди GPX, устраняющих продукты реакций свободнорадикальных соединений кислорода, в эндометриальной ткани во время беременности, по-видимому, основную роль в защите развивающегося плода (в этом смысле) со стороны материнского организма играет секретируемая эндометрием GPX3. Большинство генов других ферментов группы GPX не претерпевают столь серьезных изменений экспрессии в эндометрии во время беременности, как это имеет место в случае Gpx3; сопоставимого внимания, вероятно, заслуживает лишь факт сильного снижения экспрессии Gpx2, отмеченный в работе X. Xu et al [23].
Хотя Gpx3 обильно экспрессируется в децидууме, мыши, генетически дефектные по обоим аллелям Gpx3, не проявляют отклонений в репродуктивной функции по сравнению с мышами дикого типа. При этом неизвестно, что происходит с другими GPX в эндометрии, компенсируют ли они отсутствие GPX3 у таких генетически дефектных мышей. В отношении одного маркера децидуализации, белка DTPRP, известно, что мыши, гомозиготные по его выключенному гену, Dtprp, жизнеспособны, фертильны и дают
приплод нормальной численности — явление, сходное с тем, что наблюдается при выключенном гене Gpx3. Однако у Dtprp-дефектных мышей протекание беременности уязвимо к гипоксии — количество погибших и подвергшихся резорбции зародышей значимо больше в условиях гипоксии, чем у мышей дикого типа в тех же условиях. Это свидетельствует об утрате материнской способности адаптироваться к влиянию стрессирующего фактора в ходе беременности. Возможно, в случае утраты нормальных аллелей Gpx3 могут быть получены аналогичные результаты в условиях стресса. GPX3, возможно, является белком, присутствие которого в эндометрии необходимо для сохранения беременности в условиях гипоксии, в стрессовых условиях. На возможность этого также указывает известный факт зависимости экспрессии Gpx3 от гипоксия-индуцибельного фактора HIF1a [23, 26].
Перспективы определения активности и исследования роли глутатионпероксидаз в функционировании эндометрия
Обратим внимание на то, что в большинстве вышеперечисленных работ для изучения была доступна экспрессия генов разных GPX; также регистрировались уровни белков GPX. Об изменениях ферментативной активности судили косвенно [23]; при этом не проводились полноценные количественные измерения активности различных форм GPX как скорости каталитической реакции, отнесенной к количеству биоматериала (или конкретнее — белка-фермента). Между тем именно каталитическая активность является показателем функциональной активности фермента, а не само количество белка-фермента, измеренное, например, иммунохимиче-ски, и тем более не уровень экспрессии его гена.
В наших пилотных исследованиях выявлено, что как в гомогенатах цельной матки, так и в гомогенатах эндометрия лабораторных животных принципиально возможно определять ферментативную активность тиол-пероксидаз, причем можно подобрать условия, в которых определяется очень высокая активность. В цельной матке мышей тиолперокси-дазная активность (Me (q1-q3)) составляет 154 (122-214) нмоль HcySH/мин/мг белка (субстраты — HcySH (0,9-1,1 мМ) и трет-бутилгидропероксид (1,6 мМ), рН 8,5, t = 37 °C; другие параметры метода см. в работе [27]). Тиолпероксидазная активность (Me (q1-q3)) в эндометрии матки крыс составляет 112 (98-112) нмоль HcySH/мин/мг
белка (субстраты — HcySH (1,1 мМ) и пероксид водорода (0,192 мМ), рН 8,5, X = 37 °С; использовался метод из работы [10]). Отметим, что в случае сочетания HcySH и пероксида водорода нами получено статистическое подтверждение того, что такая тиолпероксидазная активность принадлежит ферменту GPX3 [10] (при этом использовалась плазма крови в качестве источника ферментативной активности). Цистеин, также являясь хорошим субстратом для GPX3, аналогичным образом может быть использован для определения активности этой формы GPX [9, 10, 28, 29].
Как показано в вышеизложенном обзоре, существуют данные, служащие основаниями для гипотезы о том, что GPX3 является ферментом, активность которого служит фактором, обеспечивающим успешную имплантацию бластоци-сты в стенку матки и последующую защиту эмбриона от окислительного стресса. В связи с этим перспективным подходом для проверки этой гипотезы являются оценка размера приплода у животных, содержащихся на селенодефицитной диете в периимплантационный период и подвергающихся воздействию стрессовых факторов, и оценка гомоцистеинпероксидазной активности в эндометрии в тех же условиях и в тот же период. Как известно, помещение генетически нормальных мышей в условия гипобарической гипоксии (концентрация кислорода — 11 %) с 5,5-го по 11,5-й день беременности приводит к гибели части эмбрионов [26]. Перспективной представляется попытка предотвращения гибели имплантировавшихся эмбрионов в данных условиях за счет применения препаратов селена. Оценка гомоцистеинпероксидазной активности в ткани стенки матки, проводимая в параллельной группе в тех же условиях, позволит оценить связь между изменениями в количестве погибших эмбрионов и активностью GPX3.
Актуально также провести измерение динамики активности GPX3 в эндометрии при искусственной задержке и активации имплантации, а также в децидуоме, вызванной инъекцией масла в рог матки животного. Это также, вероятно, позволит дополнительно подтвердить увеличение активности фермента при децидуализации (напомним, что ранее аналогичные опыты проводились с изучением экспрессии гена ОрхЗ, а не с изучением активности фермента GPX3 [23]).
Как уже упоминалось выше, перспективным является получение нокаутных животных по гену ОрхЗ с последующей оценкой влияния гипоксии
в пери- или постимплантационный период на исход беременности. Контроль над гомоцистеин-пероксидазной активностью (с высокой вероятностью, свойственной ферменту GPX3) в ткани стенки матки остается актуальным и в таких экспериментах, несмотря на генетический дефект по Gpx3. Таким образом может быть получен ответ на вопрос об активации компенсаторных биохимических механизмов в условиях физиологического стресса во время беременности при отсутствии данного фермента.
Такого рода исследования не только могут подтвердить необходимость минимизации физиологического стресса в периимплантацион-ный и ранний постимплантационный периоды, вскрывая при этом механизмы его негативного влияния на исход беременности, но и могут послужить обоснованием увеличения потребления физиологически безопасных соединений селена в рационе в период ранней беременности (в особенности, если в силу обстоятельств не удается полностью устранить стрессовые состояния в организме матери).
Поскольку получены свидетельства того, что экспрессия Gpx3 в эндометрии лабораторных животных и человека активируется прогестероном [16, 23], перспективным представляется определение активности GPX3 при проверке гестагенной активности новых синтетических стероидов в экспериментах in vivo и в культуре клеток эндометрия (при обязательном добавлении соединений селена в культуральную среду). Уровень активации GPX3 может послужить показателем эффективности препаратов с предполагаемой гестагенной активностью.
Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.
Авторы признательны ведущему научному сотруднику группы фармакологии НИИ АГиР им. Д.О. Отта, канд. биол. наук М.А. Петросян и директору Центра фармакологических исследований СПХФА, канд. биол. наук Д.Ю. Ивкину за предоставленную возможность выполнения проверочных опытов по оценке гомоцистеин-пероксидазной активности в эндометрии лабораторных животных.
Литература
1. Flohé L, Brigelius-Flohé R. Selenoproteins of the glutathione peroxidase family. In: Yatfield DL, et al. (Éd.) Selenium: Its Molecular Biology and Role in Human Health. New York: Springer; 2012. P. 167-180. doi: 10.1007/978-1-4614-1025-6_13.
2. Mittapalli O, Neal JJ, Shukle RH. Antioxidant defense response in a galling insect. PNAS. 2007;104(6):1889-94. doi: 10.1073/pnas.0604722104.
3. Torres WH. Biología de las especies de oxigeno reactivas. Mensaje Bioquimico. 2002;26:19-54.
4. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиокси-данты. - М.: Слово, 2006. [Men'shhikova EB, Lankin VZ, Zenkov NK, et al. Okislitel'nyj stress. Prooksidanty i antioksidanty. Moscow: Slovo; 2006. (In Russ.)]
5. Brigelius-Flohé R, Maiorino M. Glutathione peroxidases. Biochimica et Biophysica Acta. 2013;1830(5):3289-3303. doi: 10.1016/j.bbagen.2012.11.020.
6. Chu FF, Doroshow JH, Esworthy RS. Expression, characterization, and tissue distribution of a new cellular selenium-dependent glutathione peroxidase, GSHPx-GI. J Biol Chem. 1993;268(4):2571-2576.
7. Avissar N, Ornt DB, Yagil Y, et al. Human kidney proximal tubules are the main source of plasma glutathione peroxidase. Am J Physiol. 1994;266(2):367-375.
8. Okamura N, Iwaki Y, Hiramoto S, et al. Molecular cloning and characterization of the epididymis-specific glutathione peroxidase-like protein secreted in the porcine epididymal fluid. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1997;1336(1):99-109. doi: 10.1016/S0304-4165(97)00016-0.
9. Takebe G, Yarimuzu J, Saito Y, et al. A comparative study on the hydroperoxide and thiol specificity of the glutathione peroxidase family and selenoprotein P. J Biol Chem. 2002;277(43):41254-8. doi: 10.1074/jbc.M202773200.
10. Разыграев А.В., Таборская К.И., Петросян М.А., Ту-масова Ж.Н. Тиолпероксидазные активности плазмы крови крыс, определяемые с использованием перок-сида водорода и 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) // Биомедицинская химия. - 2016. - Т. 62. - № 4. -С. 431-438. [Razygraev AV, Taborskaya KI, Petrosyan MA, Tumasova ZhN. Thiol peroxidase activities in rat blood plasma determined with hydrogen peroxide and 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid). Biomed Khim. 2016;62(4):431-8. (In Russ.)] doi: 10.18097/PBMC20166204431.
11. Wendel A. Glutathione peroxidase. In: Jakoby WB. (Ed.) Enzymatic Basis of Detoxication. V. 1. N.Y.: Academic Press; 1980. P. 333-353.
12. Zakowski JJ, Tappel AL. A semiautomated system for measurement of glutathione in the assay of glutathione peroxidase. Anal Biochem. 1978;89(2):430-436.
13. Колесниченко Л.С., Кулинский В.И. Глутати-онтрансферазы // Успехи современной биологии. -1989. - Т. 107. - С. 179-194. [Kolesnichenko LS, Kulinskij VI. Glutationtransferazy. Uspekhi sovremennoj biologii. 1989;107:179-194. (In Russ.)]
14. Hurst R, Bao Y, Ridley S. Williamson G. Phospholipid hydroperoxide cysteine peroxidase activity of human serum albumin. Biochem J. 1999;338:723-728.
15. Saito Y, Hayashi T, Tanaka T, et al. Selenoprotein P in human plasma as an extracellular phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase. Isolation and enzymatic characterization of human selenoprotein P. J Biol Chem. 1999;274:2866-2871. doi: 10.1074/ jbc.274.5.2866.
16. Borthwick JM, Charnock Jones DS, Tom BD, et al. Determination of the transcript profile of human endome-trium. Mol Hum Reprod. 2003;9(1):19-33.
17. Horcajadas JA, Riesewijk A, Polman J, et al. Effect of controlled ovarian hyperstimulation in IVF on endometrial gene expression profiles. Mol Hum Reprod. 2004;11(3):195-205.
18. Horcajadas JA, Minguez P, Dopazo J, et al. Controlled ovarian stimulation induces a functional genomic delay of the endometrium with potential clinical implications. J Clin Endocrinol Metab. 2008;93(11):4500-4510. doi: 10.1210/jc.2008-0588.
19. Ponnampalam AP, Weston GC, Trajstman AC, et al. Molecular classification of human endometrial cycle stages by transcriptional profiling. Mol Hum Reprod. 2004;10(12):879-893. doi: 10.1093/molehr/gah121.
20. Riesewijk A, Martin J, van OsR, et al. Gene expression profiling of human endometrial receptivity on days LH+ 2 versus LH+ 7 by microarray technology. Mol Hum Reprod. 2003;9(5):253-264. doi: 10.1093/molehr/ gag037.
21. Kingsley PD, Whitin JC, Cohen HJ, Pails J. Developmental expression of extracellular glutathione peroxidase suggests antioxidant roles in deciduum, visceral yolk sac and skin. Mol Reprod Dev. 1998;44:343-355.
22. Ota H, Igarashi S, Kato N, Tanaka T. Aberrant expression of glutathione peroxidase in eutopic and ectopic endometrium in endometriosis and adenomyosis. Fertil Steril. 2000;74:313-318. doi: 10.1016/S0015-0282(00)00638-5.
23. Xu X, Leng JY, Gao F, et al. Differential expression and antioxidant function of glutathione peroxidase 3 in mouse uterus during decidualization. FEBS Letters. 2014;588(9):1580-9. doi: 10.1016/j.febslet.2014.02.043.
24. Christofferson RH, Wassberg BE, Nilsson BO. An-giogenesis in the rat uterus during pregnancy. In: S.R. Glasser et al. (Ed.) Endocrinology of Embryo-En-dometrium Interactions. Springer US; 1994. P. 77-92.
25. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Структура, свойства, биологическая роль и регуляция глу-татионпероксидазы // Успехи современной биологии. - 1993. - Т. 113. - С. 107-122. [Kulinskij VI, Kolesnichenko LS. Struktura, svojstva, biologicheskaja rol' i reguljatsija glutationperoksidazy. Uspekhi sovremennoj biologii. 1993;113:107-122. (In Russ.)]
26. Alam SK, Konno T, Dai G, et al. A uterine decidual cell cytokine ensures pregnancy-dependent adaptations to a physiological stressor. Development. 2007;134(2):407-415. doi: 10.1242/dev.02743.
27.Разыграев А.В. Определение тиолпероксидазной активности в сыворотке крови крыс с использованием трет-бутилгидропероксида и гомоцисте-ина // Бутлеровские сообщения. - 2016. - Т. 47. -№ 9. - С. 156-162. [Razygraev AV. Determination of thiol peroxidase activity in the rat blood serum using tert-butyl hydroperoxide and homocysteine. Butlerov Communications. 2016;47(9):156-162. (In Russ.)]
28. Разыграев А.В. Опыт использования цистеина для определения тиолпероксидазной активности в плазме и сыворотке крови // Фундаментальная наука и клиническая медицина. Человек и его здоровье: тезисы XVIII Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (с международным участием). - СПб., 2015. -С. 449-450. [Razygraev AV. Opyt ispol'zovanija tsisteina dlja opredelenija tiolperoksidaznoj aktivnosti v plazme i syvorotke krovi. Fundamental'naja nauka i klinicheskaja meditsina. Chelovek i ego zdorov'e: tezisy XVIII Vserossijskoj mediko-biologicheskoj konferentsii molodyh issledovatelej (conference proceedings). Saint Petersburg; 2015. P. 449-50. (In Russ.)]
29. Razygraev AV. Cysteine peroxidase activity in rat blood plasma. Egyptian Journal of Biology. 2013;15:54-58. doi: 10.4314/ejb.v15i1.8.
■ Адреса авторов для переписки (Information about the authors)
Алексей Вячеславович Разыграев — канд. биол. наук, научный сотрудник. НИИ АГиР им. Д.О. Отта; научный сотрудник СПХФА, Санкт-Петербург. E-mail: [email protected].
Мария Олеговна Матросова — студент. СПбПУ Петра Великого, Санкт-Петербург. E-mail: [email protected].
Ирина Александровна Титович — аспирант СПХФА. Санкт-Петербург. E-mail: [email protected].
Alexey V. Razygraev — PhD, scientific researcher, D.O. Ott Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology. St Petersburg State Chemical-Pharmaceutical Academy, Saint Peterburg, Russia. E-mail: [email protected].
Mariya O. Matrosova — student, Peter the Great Saint Petersburg Polytechnic University, Saint Petersburg, Russia. E-mail: [email protected].
Irina A. Titovich — graduate student, St Petersburg State Chemical-Pharmaceutical Academy, Saint Petersburg, Russia. E-mail: irina. [email protected].
