CC BY
12УДК 57.014:57.014: 615.9
Роль гипераммониемии в формировании летального исхода острой интоксикации циклофосфаном у крыс
Шефер Т.В., Рейнюк В.Л., Ивницкий Ю.Ю.
ФГУН «Институт токсикологии» ФМБА России, г. Санкт-Петербург
Введение крысам циклофосфана в дозах 0,73—3,64 ЛД50 сопровождалось развитием гипераммониемии, обусловленной интенсификацией поступления аммиака из желудочно-кишечного тракта в бассейн каудальной полой вены в обход печени, а также отставанием синтеза глутамина и мочевины в печени от поступления аммиака в бассейн воротной вены. Увеличение пула аммиака в просвете пищева-
рительного тракта отягощало интоксикацию циклофосфаном и обогащало её проявления симптомами острого отравления солями аммония. Таким образом, гипераммониемия является одним из механизмов танатогенеза при острой интоксикации циклофосфаном.
Ключевые слова: крысы; циклофосфан; ацетат аммония; аммиак, глутамин, мочевина крови; средняя продолжительность жизни
Введение. Резорбтивное действие ипритов в виде поражения нервной, пищеварительной и кроветворной систем, как правило, сопутствует местному [7]; при обширной контаминации ипритами и при лечении цитостатика-ми из группы аналогов азотистого иприта оно преобладает в клинике интоксикации [2, 9]. В крайне тяжёлых случаях неврологические расстройства представлены возбуждением, атаксией и судорогами [1]. Одним из механизмов их возникновения может быть увеличение потока аммиака из пищеварительного тракта в центральную нервную систему, обусловленное энтеротоксичностью [2] и гепатотоксич-ностью [10] ипритов. В этом случае можно ожидать усиления токсического действия аналога азотистого иприта — циклофосфана (Ц) — на фоне увеличения пула аммиака в просвете пищеварительного тракта. Целью исследования была проверка этой гипотезы. Дозы Ц, использовавшиеся в настоящей работе, составляли для крыс 0,73 — 3,64 ЛД50 (рассчитано по [11]). Подобный уровень воздействия возможен при миелоабляционных режимах применения Ц — например, при подготовке к пересадке костного мозга [8], а также при инцидентах, связанных с острым воздействием ипритов на организм [1, 2].
Материалы и методы исследования. Работа выполнена на самцах аутбредных крыс-альбиносов массой 200—240 г, приобретённых в питомнике «Рапполово» АМН РФ («Правила лабораторной практики» Приказ Минздрав-соцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н). В течение суток перед экспериментом животных не кормили при неограниченном доступе к воде. Вводили Ц производства АО «Биохимик», ацетат аммония (АА) или ацетат натрия (АН) производства KGaA Merck,
в виде растворов в объёме 10 мл/кг. Крысы, которым Ц не вводили, получали воду в таком же объёме.
В 1-й серии опытов через 1, 3 или 5 ч после в/б, п/к или в/ж введения крысам Ц в дозе 1000 мг/кг определяли содержание аммиака, глутамина и мочевины в крови, полученной из туловища при декапитации. Аммиак определяли с реактивом Несслера [3], глутамин — по аммиаку после кислотного гидролиза [12], мочевину — с диацетилмонооксимом (набор реактивов «Ольвекс Диагностикум», Россия). Для контроля влияния возможной гемокон-центрации на концентрацию в крови метаболитов, в параллельных пробах определяли ге-матокрит.
Во 2-й — 4-й сериях опытов в крови, отобранной из v. portae или v. cava caud., определяли аммиак, глутамин и мочевину через 0,5 (серия 2), 3 (серия 3) или 18 ч (серия 4) после в/б введения Ц в дозах 0, 200, 600 или 1000 мг/ кг. За 2 мин до лапаротомии животных наркотизировали тиопенталом натрия (в/б 75 мг/ кг). V. portae пунктировали краниальнее v. py-lorica; v. cava caud. — в двух точках: (1) кау-дальнее впадения vv. renales и (2) краниальнее впадения vv. hepaticae, на уровне диафрагмы.
В 5-й серии опытов исследовали влияние АА в нелетальной дозе 12 ммоль/кг (0,4 ЛД50) на клинические проявления токсического действия Ц, вводимого в/б в дозах 200, 600, 1000 или 1400 мг/кг, и на среднюю продолжительность жизни (СПЖ) крыс. Контрольные животные перед введением Ц получали АН в дозе 12 ммоль/кг.
Значимость межгрупповых различий средних величин содержания метаболитов или эритроцитов в крови оценивали с помощью гетероскедастического t-критерия Стьюден-
Рис. 1. Содержание аммиака, мочевины в крови и гематокрит у крыс (М ± т, п = 6) после внутрибрюшинного (1), подкожного (2) или внутрижелудочного (3) введения циклофосфана в дозе 1000 мг/кг. * - Значимое различие с контрольной группой, р < 0,05
та; межгрупповых различий СПЖ — с помощью критерия Манна-Уитни.
Результаты и обсуждение. В/б введение Ц в дозе 200 мг/кг не сопровождалось заметными клиническими проявлениями интоксикации в течение 18 ч; при дозе 600 мг/кг отмечались медленно прогрессирующие сомноленция и ступор. При дозах 1000 — 1400 мг/кг наблюдали тремор, утрату постурального и аудио-моторного рефлекса в ближайшие 3 ч; в интервале 1 — 6 ч на фоне описанного состояния иногда возникали тонические судороги. Ни при одной из доз указанные симптомы не от-
мечались ранее, чем через 0,5 ч после изолированного введения Ц. Интоксикация при п/к или в/ж введении Ц в дозе 1000 мг/кг клинически проявлялась сопором.
Через 1, 3 и 5 ч после в/б введения Ц в дозе 1000 мг/кг содержание аммиака в крови крыс было повышено в 2,8; 3,9 и 3,8 раза; после п/к введения — в 1,9; 2,6; 3,2 раза и после в/ж введения — в 2,1; 2,1 и 2,3 раза. Содержание глу-тамина и мочевины увеличивалось в меньшей степени (рис. 1).
В течение 3 ч после введения Ц в дозах 200, 600 или 1000 мг/кг уровень аммиака в пор-
Рис. 2. Содержание аммиака, глутамина и мочевины в крови из воротной и задней полой вены крыс после вну-трибрюшинного введения циклофосфана
Слева направо: через 0,5; 3 и 18 ч после инъекции. Сплошная линия - v. portae; пунктир - каудальный сегмент v. cava caud.; штрих-пунктир - краниальный сегмент v. cava caud. * - Значимое различие с контролем (нулевой дозой циклофосфана), р < 0,05; + - значимое различие между величинами в крови из v. portae и краниального сегмента v. cava caud., р < 0,05.
тальной крови вырос в 1,4; 1,8 и 2,5 раза, соответственно. Уровень аммиака в крови из v. cava caud. каудальнее впадения vv. renales повысился в 1,5; 2,1 и 3,3 раза, а краниальнее vv. hepaticae - в 1,8; 2,7 и 4,2 раза, соответственно. В дозе 600 или 1000мг/кг Ц отменял положительный порто-кавальный градиент концентрации аммиака; при этом отрицательный порто-кавальный градиент концентрации мочевины сохранялся. Накопление в крови глутамина и мочевины отставало от ги-пераммониемии: в течение 3 ч после введения Ц в дозах 200, 600 или 1000 мг/кг отношение концентраций глутамина и аммиака в крови из краниального сегмента v. cava caud. снижалось в 1,9; 1,6 или 2 раза, а мочевины и аммиака — в 1,5; 1,6 или 2,8 раза, соответственно. Через 18 ч после введения Ц в дозе 600 мг/кг сохранялась гипераммониемия, которая сопровождалась значительным увеличением содержания глутамина и мочевины в крови (рис. 2); отношение концентраций глутамина и аммиака в крови из v. cava caud. повышалось в 1,6—1,8 раза.
Введение АА усиливало летальное действие Ц: величина СПЖ снижалась в 1,5; 2,1; 2,8 или 6,1 раза при дозах Ц 200, 600, 1000 или 1400 мг/кг, соответственно (рис. 3). На фоне совместного применения токсикантов при дозах Ц 1000 или 1400 мг/кг (но не при изолированном действии АА) у животных наблюдали признаки, характерные для отравления солями аммония в летальных дозах — экзофтальм, атаксию, периодическое возбуждение, крупный тремор, сменявшиеся опистотону-сом и апноэ.
Таким образом, введение крысам Ц в испытанных дозах вело к развитию гипераммони-емии. Её уровень был близок к наблюдаемому при печёночной энцефалопатии у людей и при атаксии, вызванной ацетатом аммония, у крыс [5]. Повышение уровня азотистых метаболитов в крови не было обусловлено гемо-концентрацией, поскольку гематокрит у этих же крыс возрастал не более чем в 1,3 раза. Оно не было связано и с поражением почек: несмотря на то, что почечная недостаточность характерна для действия Ц [13], при ней в крови накапливается преимущественно мочевина, а не аммиак [4]. Частично гипераммониемия могла быть обусловлена нарушением синтеза глутамина и мочевины в печени, что следует из снижения коэффициентов глутамин/ аммиак и мочевина/аммиак в крови из краниального сегмента задней полой вены через 3 ч после введения Ц в дозах 600 или 1000 мг/кг. Эта гипотеза подтверждается исчезновением положительного порто-кавального градиента концентрации аммиака. Но повышение уровня аммиака в крови из каудального сегмента
ДбЗа ииклофо^тна. мг/кг
Рис. 3. Влияние внутрижелудочного введения ацетата аммония в дозе 12 ммоль/кг на среднюю продолжительность жизни крыс (М ± т, п = 11) после последующего внутрибрюшинного введения циклофосфана 1 - контроль; 2 - ацетат аммония. * - Значимое различие с контрольной группой, р < 0,05
задней полой вены (рис. 2) говорит об интенсификации поступления аммиака в кровь также и в обход печени.
У крыс пул аммиака в просвете пищеварительного тракта составляет 1,1 ммоль на 1 кг массы тела (рассчитано по данным [6]), поэтому в/ж введение ацетата аммония в дозе 12 ммоль/кг увеличило его на порядок. При физиологических значениях рН 6% люми-нального аммиака тонкой кишки (против 3% в крови), представлены липофильными незаряженными молекулами (МН3), способными преодолевать биомембраны по градиенту концентрации. Поэтому появление в клинике поражения Ц симптомов отравления солями аммония, равно как и ускоренная гибель животных с увеличенным пулом аммиака в просвете пищеварительного тракта, могут быть связаны с интенсификацией поступления аммиака в кровь и в головной мозг.
Выводы. 1. Введение крысам циклофосфана в дозах 0,73 — 3,64 ЛД50 сопровождалось развитием гипераммониемии. Её ведущими механизмами были интенсификация поступления аммиака из желудочно-кишечного тракта в бассейн каудальной полой вены в обход печени, а также отставание синтеза глутамина и мочевины в печени от возросшего поступления аммиака в бассейн воротной вены.
2. Гипераммониемия усугубляла летальное действие циклофосфана на крыс; этот эффект был связан с возрастанием роли неврологических расстройств в формировании летального исхода интоксикации.
^СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Alexander S. F. Medical Report of the Bari Harbor Mustard Casualties // The Military Surgeon, 1947. - V. 101. -P. 2-17.
2. Balali-Mood M., Hefazi M. The pharmacology, toxicology, and medical treatment of sulfur mustard poisoning.Fundam // Clin. Pharmacol., 2005. -V. 19. - P. 297-315.
3. Barrett J.F. A modified Nessler's reagent for the microdetermination of urea in tungstic acid blood filtrate // Biochem J., 1935. - V.29. № 11. - P. 2442-2445.
4. Dinour, D., Brezis, M. Acute renal failure / Comprehensive toxicology, V.7. Cambridge: University Press, 1997. - P. 143-159.
5. Jayakumar A.R., Sujatha R., Paul V. Effect of ammonia on motor function in adult rats // Brain Res. Bull., 1997. - V. 43. - P. 275278.
6. Kim K., Lee W., Benevenga N.J. Feeding diets containing high levels of milk products or cellulose decrease urease activity and ammonia production in rat intestine // J. Nutr., 1998. - V. 128. -P. 1186-1191.
7. Kehe K., Szinicz L. Medical aspects of sulfur mustard poisoning // Toxicology, 2005. -V. 214. - P. 198-209.
8. Kugi S., Kugi Z., Latifi-Pupovci, H., et al. Adult cells as an alternative
source of multipotential (pluripotential) cells in regenerative medicine // Curr. Stem Cell Res. Ther., 2009. - V. 4. - P. 107-117.
9. Lorch A., Kollmannsberger C., Hartmann J.T., et al. Single versus sequential high-dose chemotherapy in patients with relapsed or refractory germ cell tumors: a prospective randomized multicenter trial of the German Testicular Cancer Study Group. // J. Clin. Oncol., 2007. - V. 25. - P. 2778-2784.
10. McDonald G.B., Slattery J.T., Bouvier M.E., et al. Cyclophosphamide metabolism, liver toxicity, and mortality following hematopoietic stem cell transplantation // Blood, 2003, - V. 101. - P. 2043-2048.
11. Meistrich M.L., Nandakishore Parchuri, Wilson G., et al. Hormonal protection from cyclophosphamide-induced inactivation of rat stem spermatogonia // J. Androl., 1995. - V. 16. - P. 334-341.
12. Whitehead T.P., Whittaker S.R.F. A method for the determination of glutamine in cerebrospinal fluid and the results in hepatic coma // J. Clin. Pathol., 1955. - V. 8. - P. 81-84.
13. Wolfgang G.H.J., Leibbrandt M.E.I. Antineoplastic agents / Comprehensive toxicology, V. 7. - Cambridge: University Press, 1997. P. - 525-547.
Schafer T.V., Reynyuk V.L., Ivnitskiy Yu.Yu.
Role of hyperammonemia in lethal outcome of acute intoxication by cyclophosphamide in rats
Institute of Toxicology, Federal Medical Biological Agency, St.Petersburg
The administration of cyclophosphamide in doses of LD50 0.73-3.64 to rats was followed by hyperammonemia stipulated by an intensified outflow of ammonia from the gastrointestinal tract into the portal of caudal caval vain by-passing the liver, and by a lagged behind synthesis of glutamine and urea in the liver in relation to the income of ammonia into the portal vein . An enhanced ammonia pool in the lumen of the digestive tract aggravated the intoxication by cyclophosphamide and added symptoms of acute intoxication by ammonia salts. Thus, hyperammonemia is one of thanatogenesis mechanisms at acute intoxication by cyclophosphamide.
Материал поступил в редакцию 10.11.2009 г.
УДК 547.3:615.9
Сравнение противосудорожной активности и токсических эффектов фенобарбитала в различных лекарственных формах для парентерального введения
Иванов И.М., Быков В.Н., Чепур С.В., Никифоров А.С., Анохин А.Г., Курпякова А.Ф., Юдин М.А., Тюнин М.А.
Научно-исследовательский испытательный центр (медико-биологической защиты) ФГУ «Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины Минобороны России», С-Петербург
Разработана лекарственная форма фенобарбитала для парентерального введения на основе фармацевтической композиции, включающей в себя гидроксипропил-бета-циклодекстрин (40 %) и органические раство-
рители (1,2-пропиленгликоль 33,5 % и этанол 5 %), стабильная при хранении более 6 лет, с концентрацией активного вещества 165 мг/мл.
Ключевые слова: фенобарбитал, циклодек-стрин, парентеральное введение
Введение. Отсутствие лекарственных ряда фармакологических препаратов. Осо-форм для парентерального введения являет- бую актуальность эта проблема приобретает ся серьезной проблемой применения целого при купировании неотложных состояний, на-
