Роль гена NO-синтазы в генезе фибрилляции предсердий Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

© ШУЛЬМАН В.А., НИКУЛИНА С.Ю., ДУДКИНА К.В., ВОЕВОДА М.И., МАКСИМОВ В.Н., АКСЮТИНА Н.В., ЧЕРНОВА А. А., ЗЛОДЕЕВ К.В., АЛЛАХВЕРДЯН А. А.

УДК 616.12-008.313-02:575.191

РОЛЬ ГЕНА NO-СИНТАЗЫ В ГЕНЕЗЕ ФИБРИЛЛЯЦИИ

ПРЕДСЕРДИЙ

В.А. Шульман, С.Ю. Никулина, К.В. Дудкина, М.И. Воевода, В.Н. Максимов, Н.В. Аксютина, А. А. Чернова, К.В. Злодеев, А. А. Аллахвердян Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно - Ясенецкого, ректор - д.м.н., проф. И.П. Артюхов, НИИ терапии СО РАМН, Новосибирск, директор - член-корр. РАМН М.И. Воевода.

Резюме. В настоящей работе впервые на клинико - генетическом материале выявлена ассоциация фибрилляции предсердий с полиморфизмом гена NO-синтазы.

Ключевые слова: фибрилляция предсердий, полиморфизм, ген NO-синтазы.

Никулина Светлана Юрьевна - д.м.н., проф. каф. внутренних болезней №1 КрасГМУ, проректор по учебной работе КрасГМУ; тел. 8(391)2640979.

Шульман Владимир Абрамович - д.м.н., проф., зав. каф. внутренних болезней №1 КрасГМУ; тел. 8(391) 2640979.

Дудкина Ксения Владиславовна - очный аспирант каф. внутренних болезней №1 КрасГМУ; e-mail: ksu25_83 @mail.ru.

Фибрилляция предсердий (ФП) одна из наиболее распространенных и опасных аритмий. По данным Фремингемского исследования, ФП удваивает

смертность у кардиологических больных и является причиной 1/3 тромбоэмболических эпизодов.

В большинстве случаев это нарушение ритма является вторичным, то есть обусловлено каким - либо заболеванием. Но по крайней мере в 1/3 случаев этиологию ФП установить не удается. Такую аритмию, как известно, обозначают терминами идиопатическая ФП или lone atrial fibrillation. Предполагают, что в значительной части случаев идиопатическая (первичная) ФП (ПФП) наследственно обусловлена. Однако и при вторичной ФП (ВФП) не исключается наследственный компонент, поскольку у различных пациентов при одинаковой тяжести первичного заболевания ФП возникает далеко не всегда.

Молекулярные исследования ФП сосредоточены в основном в 2 направлениях: 1) выявление генов, мутации в которых приводят к

возникновению аритмий (наследование таких аритмий осуществляется по классическому менделевскому типу); 2) изучение полиморфизма различных генов, так называемых генов подверженности или генов - кандидатов. Скрининг генов подверженности, изучение их полиморфизма - важнейшее направление современной генетики. Цель этих исследований идентифицировать не только триггерные факторы, ответственные за возникновение острых форм ФП, но и факторы, ответственные за ее хронизацию. Ограниченные успехи в терапии ФП частично обусловлены недостаточным пониманием ее молекулярной патофизиологии.

Определенную роль в патогенезе ФП могут играть молекулы оксида азота.

Один из атомов азота R-цепи аминокислоты L - аргинин - доказанный источник атома азота для молекулы NO, синтезируемой клетками

млекопитающих и человека: L - аргинин + О2 - L - цитрулин + NO [1].

Катализатор этой реакции - синтаза NO (NO - синтаза, или NOS, код

фермента 1.14.13.39) [12].

К настоящему времени известны 3 изоформы NOS: 1) нейрональная (NOS -

1, nNOS, NOSn); 2) индуцибельная (NOS - 2, iNOS, NOSi); 3) эндотелиальная (NOS - 3, eNOS, NOSe) [3].

Испанские ученые исследовали влияние синтетазы окиси азота на хроническую ФП. Американские ученые C. Dudley и E. Hoch изучали влияние NO-синтазы на изменение проводящей системы сердца, в частности при ФП [8]. В 2005 году американские ученые M. Kim и J. Guzik показали, что снижение продукции NO-синтазы может вызывать окислительный стресс и приводить к изменениям в проводящей системе миокарда, тем самым способствовать развитию ФП [11].

Одним из наиболее изученных полиморфизмов гена носителя является структурный полиморфизм экзона 7 (замена гуанина тимидином в позиции G894T) гена эндотелиальной NO-синтазы, который приводит к замене глутамина аспарагином в позиции Glu298Asp самого фермента [3]. Полиморфизм Glu298Asp гена эндотелиальной NO-синтазы изучался в нескольких исследованиях. Так, D. Czarnecka, K. Kawecka - Jaszcz изучали зависимость развития гипертрофии левого предсердия от генотипа Glu298Asp [2, 7, 10]. Полученные данные противоречивы. Согласно результатам метаанализа, опубликованного J. Casas с соавт., в период до 2003 года были проведены 26 исследований (общее число обследованных пациентов 9867 и 13 161 человек в контрольной группе), в которых изучалась зависимость между различными полиморфизмами гена эндотелиальной NO-синтазы и ишемической болезни сердца [6]. Гомозиготы Asp298, несмотря на некоторую гетерогенность проведенных исследований, ассоциировались с повышением риска развития ишемической болезни сердца (ИБС). В то же время есть исследования, в которых эти данные не подтверждаются [9]. Т.Ю. Кузнецова с соавт. (2008) изучали влияние полиморфизмов генов

эндотелиальной NO-синтазы на развитие осложнений артериальной гипертензии [1]. Статистически значимых различий между исследуемой

группой и группой контроля выявлено не было. До настоящего времени не было исследовано влияние полиморфизма гена КО-синтазы на развитие ФП.

Цель исследования: выявить частоты генотипов и аллелей по

полиморфизму гена КО-синтазы у больных с ФП, их родственников I, II, III степени родства и лиц контрольной группы.

Материалы и методы Проведено обследование 100 пробандов, у которых диагностирована ФП и 14' их родственников I, II, III степени родства. Всем наблюдаемым индивидам был< проведено клинико-инструментальное исследование: клинико-генеалогический анализ родословной, клинический осмотр, электрокардиография, велоэргометрия холтеровское мониторирование ЭКГ, электрофизиологическое исследовани<

(чреспищеводная стимуляция левого предсердия) при пароксизмальной формі ФП, эхокардиоскопия. Эти семьи составили основную группу нашего исследования. Набор пробандов проводился за период их амбулаторного илі стационарного лечения в кардиологическом центре МУЗ ГКБ № 20 им. И.С Берзона, Красноярск. Родственники пробандов выявлялись методом активного посещения на дому с последующим комплексным обследованием кардиологическом центре.

Нами был обследован также 91 пациент с отсутствием клинико -электрокардиографических проявлений заболевания сердечно - сосудистой системы (контрольная группа). Контрольная группа состояла из 91 пробанда (60 мужчин (65,9%) и 31 женщина (34,1%). Максимальный возраст мужчин - 69 лет, минимальный - 18 лет, средний возраст - 36,1 ± 15,7 лет; максимальный возраст женщин - 71 год, минимальный - 37лет, средний - 51,5 ± 8,2 лет. В основной группе из 100 пробандов были 51 мужчина (51%) и 49 женщин (49%). Максимальный возраст мужчин - 76 лет, минимальный - 18 лет, средний - 48,6 ± 17,3 лет; максимальный возраст женщин - 78 лет, минимальный - 19 лет, средний - 58,8 ± 16,1 лет.

Семьи пробандов с ФП были разделены на две подгруппы:

Первая подгруппа - семьи пробандов с ПФП, где на основании клиникоинструментального исследования не прослеживалось явной причинноследственной связи с какими-либо заболеваниями сердечно-сосудистой системы и другой патологией, осложнением которых может быть ФП.

Вторая подгруппа - семьи пробандов с ВФП, где развитие данного нарушении ритма было следствием определенных заболеваний, таких как ИБС, артериальная гипертония, дилатационная кардиомиопатия, грыжа пищеводного отверстия диафрагмы, тиреотоксикоз и абстинентный синдром.

Из 100 пробандов 60 пациентов имели (60%) ВФП. Ишемическая болезнь сердца выявлялась у 28 (46,66%) человек, артериальная гипертония 2-3 степени

- у 24 (40%), дилатационная кардиомиопатия - у 3 пациентов (5%), грыжа пищеводного отверстия диафрагмы - у 1 (1,67%) пробанда, тиреотоксикоз с явлениями эутиреоза - у 1 (1,67%) пробанда с ВФП, абстинентный синдром - у 3 (5%) пробандов с ВФП.

Молекулярно-генетическое исследование больным с ФП и их родственникам I, II и III степени родства, а также контрольной группе проводилось в лаборатории медицинской генетики ГУ НИИ терапии СО РАМН (Новосибирска). Выделение ДНК из крови осуществлялась методом фенол-хлороформной экстракции [4,5].

Г енотипирование делеционного полиморфизма гена КО-синтазы проводили через амплификацию соответствующего локуса гена и анализ длины ПЦР продуктов. Амплификацию осуществляли в следующем температурном режиме: 95°С/1 мин., 68°С/1 мин., 72°С/1 мин. - 10 циклов, 95°С/30 сек., 68°С/30 сек., 72°С/30 сек. - 20 циклов. Наличие ПЦР продукта идентифицировали методом гель-электрофореза в 4% полиакриламидном геле с последующей окраской бромистым этидием.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ 81айвйеа у.7,0 (81а1 Бой, ША). Первым этапом определяли частоты аллелей и генотипов изучаемых генов - кандидатов. Соответствие распределения аллелей и генотипов равновесию Харди -

Вайнберга, сравнительный анализ частот генотипов вышеперечисленных генов с контрольной группой выполнялось с использованием критерия X или точного критерия Фишера. Описательная статистика представлена в виде процентных долей и стандартной ошибки доли. Различия считались статистически значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение

По результатам аллель-специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР), выявлены 3 вида генотипов NO-синтазы у больных с ФП, их здоровых родственников и лиц контрольной группы: GG -гомозиготный дикий , GT -гетерозиготный, TT - гомозиготный мутантный.

Установлено статистически значимое преобладание гомозиготного генотипа GG у больных с ФП (58,4%) по сравнению с контрольной группой (41,7%) за счет аллеля G; различие статистически значимо (р =0,028) (табл. 1).

Таблица 1

Частоты генотипов и аллелей G/T полиморфизма гена NO-синтазы у больных с фибрилляцией предсердий, их родственников и лиц

контрольной группы

Примечании: различия по исследуемым показателям рассчитаны с использованием критерия X или точного критерия Фишера (в случае если ожидаемые частоты менее 5 встречались более чем в 25% ячеек).

1 — все больные с ФП; 2 — родственники без ФП; 3 — группа контроля.

При разделении групп больных с ФП на подгруппы первичной ФП и вторичной ФП установлено статистически значимое преобладание гомозиготного генотипа GG именно у больных с первичной ФП (62,2%) по сравнению с контрольной группой (41,7%) за счет аллеля G; различие статистически значимо (р =0,006) (табл. 2)

Таблица 2

Частоты генотипов и аллелей G/T полиморфизма гена NO — синтазы у больных с первичной фибрилляцией предсердий, их родственников и лиц

контрольной группы

Примечании: различия по исследуемым показателям рассчитаны с использованием критерия X или

точного критерия Фишера (в случае если ожидаемые частоты менее 5 встречались более чем в 25% ячеек).

1 — все больные с ПФП; 2 — родственники без ФП; 3 — группа контроля.

При сравнении частот генотипов G/T полиморфизма гена NO-синтазы у больных с ВФП, их родственников и лиц контрольной группы, статистически значимых различий не выявлено (табл. 3).

Таблица 3

Частоты генотипов и аллелей G/T полиморфизма гена NO — синтазы у больных с вторичной фибрилляцией предсердий, их родственников и лиц

контрольной группы

Примечание: различия по исследуемым показателям рассчитаны с использованием критерия X или точного критерия Фишера (в случае если ожидаемые частоты менее 5 встречались более чем в 25% ячеек).

1 — все больные с ВФП; 2 — родственники без ФП; 3 — группа контроля.

Таким образом, установлено статистически значимое преобладание гомозиготного генотипа GG гена NO-синтазы у больных с ПФП (62,2%) по сравнению с лицами контрольной группы (41,7%) за счет аллеля G, то есть, аллель G является предрасполагающим фактором в развитии ВФП. Изученные генетические маркеры могут быть использованы для выявления предрасположенности к ПФП.

NO-SYNTHASE GENE IN ATRIUM FIBRILLATION GENESIS

V.A. Shulman, S.U. Nikulina, K.V. Dudkina, M.I. Voevoda, V.N. Maksimov, N.V. Aksutina, A.A.Chernova, K.V. Zlodeev, A.A. Allachverdyn

Krasnoyarsk State Medical University named after prof. V.F. Voino-Yasenetsky

Abstract. The paper presents study that revealed the association among atrium fibrillation and polymorphism of NO-synthase gene on clinical and genetic material.

Key words: atrium fibrillation, polymorphism, NO-synthase gene.

Литература

1. Кузнецова Т.Ю., Гаврилов Д.В. Влияние полиморфизмов генов эндотелиальной NO-синтазы на развитие осложнений артериальной гипертензии // Кардиология. - 2008. - T.3, №1. - C. 37 - 41.

2. Минушкина Л.О., Затейщиков Д.А., Затейщикова А.А. и др. Полиморфизм гена эндотелиальной NO-синтазы и гипертрофии миокарда у больных артериальной гипертензией // Кардиология. - 2002. - № 3. - C. 3034.

3. Покровский В.И., Виноградов Н.А. Оксид азота, его физиологические и патофизиологические свойства // Терапевт. архив. - 2005. - T. 3, №1. - C. 82

- 87.

4. Ромащенко А.Г., Кузнецова Т.Н., Рузанкина Я.С. и др. Обнаружение двух полиморфных сайтов в гене c-fms человека: частоты аллелей и генотипов в некоторых популяциях России // Генетика. - 2002. - T. 38, №1. -

С. 33 - 40.

5. Смит К., Калко С., Кантор Ч. Пульс-электрофорез и методы работы с большими молекулами ДНК / Анализ генома / Под ред. К. Дейвиса. Пер. с англ. - М: Мир, 1990. - С. 58-94.

6. Cacas J.P., Bautista L.E., Humphrier S.E. et al. Endothelial nitric oxide synthase genotype and ischemic heart disease: meta-analysis of 26 studies involving 23028 subjects // Circulation. - 2004. - Vol. 109. - P. 1359-1365.

7. Czarnecka D., Kawecka - Jaszcz K., Stolarz K. et al. Ambulatory blood pressure, left ventricular mass and vascular phenotypes in relation to the endothelial nitric oxide synthase gene Glu298Asp and intron 4 polymorphisms in population-based family study // J. Hum. Hypertens. - 2005. - Vol. 19. - P. 413 - 420.

8. Dudley C., Hoch E. Atrial fibrillation increases production of superoxide by the left atrium and left atrial appendage: role of the NADPH and xanthine oxidases // Circulation. - 2005. - Vol. - 112. - P. 1266-1273.

9. Granath B., Taylor R. et al. Lack of evidence for association between endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms and coronary artery disease in the Australian Caucasian population // J. Cardiovasc. Risk. - 2001. - Vol. 8.- P. 235 - 241.

10. Karvonen J., Kauma H., Kervinen K. et al. Endothelial nitric oxide synthase gene Glu298Asp polymorphism and blood pressure, left ventricular mass and carotid artery atherosclerosis in a population - based cohort // J. Intern. Med. -2002. - Vol. 251. - P. 102- 110.

11. Kim M., Guzik J. A myocardial Nox2 containing NAD(P)H oxidase contributes to oxidative. stress in human atrial fibrillation // Circ. Res. - 2005. -Vol. 97. - P. 629-636.

12. Nasti S., Spalarossa P., Altieri P., et al. C242T polymorphism in CYBA gene and risk of coronary artery disease in a population of Caucasian Italians // Dis. Markers. - 2006. - Vol. 22. - P. 167 - 173.