CC BY
55
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© НИКУЛИНА С.Ю., ШУЛЬМАН В.А., ЧЕРНОВА А. А., ДУДКИНА К. В., НИКУЛИН Д. А., ВОЕВОДА М.И., МАКСИМОВ В. Н.
РОЛЬ ГЕНА АЛЬФА2В-АДРЕНЕРГИЧЕСКОГО РЕЦЕТОРА В ГЕНЕЗЕ НАСЛЕДСТВЕННОГО СИНДРОМА СЛАБОСТИ
СИНУСОВОГО УЗЛА
С.Ю.Никулина, В. А. Шульман, А.А. Чернова, К. В. Дудкина,
Д. А. Никулин, М.И. Воевода, В. Н. Максимов Красноярский государственный медицинский университет
им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого, ректор - д. м. н., проф. И. П. Артюхов,
ГУ НИИ терапии СО РАМН г. Новосибирск, директор - чл.-корр. РАМН
М. И. Воевода.
Резюме. В настоящей работе впервые на клинико-генетическом материале выявлена ассоциация наследственного синдрома слабости синусового узла с полиморфизмом гена альфа2В-адренергического рецептора (ADRA2B).
Ключевые слова: синдром слабости синусового узла, полиморфизм, ген альфа2В адренорецептора (ADRA2B).
Никулина Светлана Юрьевна - проректор по учебной работе КрасГМУ, профессор каф. внутренних болезней №1 КрасГМУ; e-mail: nicoulina@mail.ru, тел. 8(391)2200914.
Шульман Владимир Абрамович - д.м.н., проф. зав. каф. внутренних болезней № 1 КрасГМУ; тел. 8(391)2640979.
Чернова Анна Александровна - клинический ординатор каф. внутренних болезеней № 1 КрасГМУ; тел. 8(391)2640979.
Г ен альфа2В-адренергического рецептора (ADRA2B) расположен на
2-й хромосоме, не имеет интронов. Данный ген кодирует а2В-адренергический рецептор [11], который является членом семейства а2-адренергических рецепторов, куда помимо него входят также субтипы а2А- и а2С [7, 10].
Рецепторы семейства а2 являются важными компонентами вегетативной нервной системы и обеспечивают физиологический ответ на симпатическую стимуляцию. Подтипы а2А и а2С являются ингибиторами высвобождения нейротрансмиттеров, причем а2А функционируют при высоких частотах нервной стимуляции, а а2С - при низких. Таким образом, стимуляция а2А и а2С-адренорецепторов приводит к стойкому гипотензивному эффекту. Стимуляция же а2В-адренорецепторов, расположенных в гладкой мускулатуре сосудов, напротив, вызывает гипертензию и нивелирует эффект от стимуляции рецепторов подтипа а2С. Активация а2В - адренергических рецепторов приводит к снижению интенсивности липолиза, секреции ренина, секреции инсулина; уменьшению сократимости гладких мышц желудочнокишечного тракта, а также увеличению сократимости гладкой мускулатуры сосудов [10].
Впервые I/D полиморфизм гена ADRA2B был описан в 1999 году. Делеция имеет небольшой размер (9 пар нуклеотидов) и приводит к исчезновению 3 глутаминовых кислот в 3-й внеклеточной петле белка, что существенно влияет на функционирование рецептора (Ins>Del Codon 299). Вариант Del Codon 299 часто встречается у славян (31%) и связан in vivo со снижением поточно-опосредованной дилятации брахиальной артерии и снижением кровотока по коронарным сосудам [8]. DD гомозиготы имеют повышенный риск нарушения функции эндотелия, что повышает частоту инфаркта миокарда в популяции. Хотя остается неясным вопрос, как влияет I/D полиморфизм на функцию эндотелия: прямо или опосредованно (через нарушение симпатической активации).
Ученые J. Ham, D.A. Rees выявили роль гена ADRA2B в индукции воспалительного процесса [6].
A. Grenz et al. установили, что наличие определенного генотипа гена ADRA2B включает защитные механизмы в почках в условиях ишемии [5].
P. Heinoren et al. [9] R. Vasudevan et al. [15] определили, что наличие DD генотипа и носительство D-аллеля гена ADRA2B может быть важным генетическим маркером развития эссенциальной гипертензии у пациентов как с сахарным диабетом II типа, так и без него в одинаковом проценте случаев.
H. Zhang et al. показали связь данного генотипа с кардиоваскулярными событиями в Китайской популяции [17].
A. Snapir et al. в 2001 году установили, что инсерционно-делеционный полиморфизм гена ADRA2B является фактором риска острых коронарных событий. DD генотип гена ADRA2B был ассоциирован со снижением потокзависимой вазодилятации плечевой и сонной артерий как индикатора доклинического атеросклероза. Помимо этого, установлена связь между данным полиморфизмом и резким повышением коронарного тока крови в ответ на инфузию адреналина [12]. В 2003 году эти же авторы выявили, что данный полиморфизм является также фактором риска артериальной гипертонии и сахарного диабета II типа [13].
Активация а2В- адренергических рецепторов, локализованных в гладкомышечных клетках сосудов, приводит к вазоконстрикции. У гомозиготных лиц по делеции 9 нуклеотидных пар, кодирующих 3 остатка глутаминовой кислоты (Glu 301-303) гена ADRA2B, выявлена ассоциация с риском развития инфаркта миокарда, артериальной гипертензии и ожирения [6,8,16]. Отрицательная ассоциативная связь между данным полиморфизмом и артериальной гипертензией представлена в исследованиях C.T. Baldwin [3] и J.P. Etzel et al. [4].
Исследование 380 здоровых японцев показало, что I/D полиморфизм гена ADRA2B является достаточно распространённым в данной этнической
группе [14]. Частота редкого аллеля составляет 0,35. Число сердечных сокращений у гомозигот ББ было значительно ниже по сравнению с другими генотипами. Поэтому представляется интересным выяснение частот этого аллеля у больных синдромом слабости синусового узла (СССУ) и их родственников по сравнению с контрольной группой.
Материалы и методы
Настоящее исследование было проспективным. Из базы данных кафедры терапии №1 Красноярского государственного медицинского университета были отобраны 29 семей, имеющих первичный, наследственный СССУ.
Всем пробандам и их родственникам I, II, III степени родства было проведено клинико-инструментальное исследование: клинический осмотр,
электрокардиография, велоэргометрия, холтеровское мониторирование ЭКГ, атропиновая проба, электрофизиологическое исследование (чреспищеводная стимуляция левого предсердия до и после медикаментозной вегетативной блокады), эхокардиоскопия, кардиоритмография.
Молекулярно-генетическое исследование больных СССУ и их родственников I, II и III степени родства проводилось в лаборатории медицинской генетики ГУ НИИ терапии СО РАМН города Новосибирска.
Взяты образцы крови 294 человек, из которых 75 - больные с диагнозом СССУ, подтвержденным с помощью чреспищеводной стимуляции левого предсердия (ЧПСЛП), 49 их здоровых родственников I, II, III степени родства и 89 человек контрольной группы без заболеваний сердечно-сосудистой системы и СССУ.
Экстракция ДНК из крови осуществлялась методом фенол-хлороформной экстракции [1, 2].
Генотипирование делеционного полиморфизма гена АОКА2В проводили через амплификацию соответствующего локуса гена и анализ длины ПЦР продуктов. Структура праймеров : прямой - 5’-АОООТ-ОТТТО-ТОООО-САТСТ-СС-3’, обратный - 5’-СААаС-ТаАаа-ССааА-аАСАС-Та-3\
Смесь для ПЦР объемом 12,5 мкл включала: Трис-ИО (pH 9,0) 75 мМ, (КИ4 )2 Б04 20 мМ, Тween-20 0,01 %, каждого праймера по 0.4 мкМ, по 0,24 мМ раствора каждого из четырех ёКТР, MgCI2 2,5 мМ, 0,6 единиц Тag полимеразы; 0,5мкг ДНК. Амплификацию проводили в следующем
температурном режиме: 95°С/1мин, 68°С/1 мин, 72°С/1мин - 10 циклов, 95°С/30 сек, 68°С/30 сек, 72°С/30 сек - 20 циклов. Наличие ПЦР продукта идентифицировали методом гель-электрофореза в 4 % полиакриламидном геле с последующей окраской бромистым этидием. Длина продукта составляла 112 п.н. для нормального аллеля и 103 п.н. для мутантного. Таким образом, при генотипе II детектировался только продукт размером 112 п.н., при генотипе ББ - размером 103 п.н., про генотипе ГО - оба указанных продукта.
Статистическую обработку данных проводили на персональном компьютере типа "ГВМ РС" с использованием пакета программ '^айБйеа 7.0". Первым этапом определяли частоты аллелей и генотипов изучаемых генов-кандидатов.
Соответствие распределения аллелей и генотипов равновесию Харди-Вайнберга, сравнительный анализ частот генотипов вышеперечисленных генов с контрольной группой выполнялось с использованием критерия X2, двустороннего критерия Фишера.
Результаты и обсуждение
По полиморфизму Ю гена альфа2В-адренорецептора нами прогенотипировано 75 больных с СССУ, 49 их здоровых родственников I, II и III степени родства и 89 лиц контрольной группы.
По результатам аллель-специфической полимеразной цепной реакции выявлены 3 вида генотипов альфа2В - адренорецептора у больных СССУ, их здоровых родственников и лиц контрольной группы: II - гомозиготный дикий, ГО - гетерозиготный, ББ - гомозиготный мутантный.
80
70
60
50
40
30
20
10
0
ID
DD
И-СССУ(п=75) □-Родственники здоровые (n=49) 0-Популяция (n=89)
Рис. 1. Частота встречаемости генотипов гена альфа2В- адренорецептора у больных СССУ, их здоровых родственников и лиц контрольной группы.
Установлено (рис.1) статистически значимое преобладание гомозиготного генотипа по более редкому аллелю DD у больных СССУ (28,0±5,2%) по сравнению с лицами контрольной группы (8,99±3,0%).
Таким образом, изученные генетические маркеры могут быть использованы для выявления предрасположенности к наследственному синдрому слабости синусового узла.
GENE OF ALFA2 ADRENERGIC RECEPTOR IN GENESIS OF INHERITS SICK SINUS SYNDROME
S.U. Nikulina, V.A. Shulman, A.A. Chernova, K.V. Dudkina, D.A.
Nikulin, M.I. Voevoda, V.N. Maksimov Krasnoyarsk State Medical University named after prof. V.F. Voyno-
Yesenetsky
Abstract. We first revealed association between inherit sick sinus syndrome and polymorphism of alfa2adrenergicreceptor gene (ADRA2B) on clinical and genetic material.
II
Key words: sick sinus syndrome, polymorphism, gene of alfa2adrenergic receptor (ADRA2B).
Литература
1. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. - М.: Мир. - 1984. - С. 357.
2. Смит К., Калко С., Кантор Ч. Пульс-электрофорез и методы работы с большими молекулами ДНК. - /Анализ генома / Под ред. К. Дейвиса, пер. с англ. - М: Мир. - 1990. - С. 58-94.
3. Baldwin C. T., Schwartz F., Baima J. et al. Identification of a polymorphic glutamic acid stretch in the alpha2B-adrenergic receptor and lack of linkage with essential hypertension // Am. J. Hypertens. - 1999. -Vol.12, № 9. - P. 853-857.
4. Etzel J. P., Rana B. K., Wen G. et al. Genetic variation at the human alpha2B-adrenergic receptor locus: role in blood pressure variation and yohimbine response // Hypertension. - 2005. - Vol.45, №6. - P.1207-1213.
5. Grenz A., Osswald H., Eckle T. et al. The reno-vascular A2B adenosine receptor protects the kidney from ischemia // PloSMed. - 2008. -Vol. 24, № 5(6). - P. 137.
6. Ham J., Rees D.A. The adenosine a2b receptor: its role in inflammation // Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. - 2008. -Vol.8, №4. - P. 244-254.
7. Hein L., Altman J. D., Kobilka B. K. Two functionally distinct alpha2-adrenergic receptors regulate sympathetic neurotransmission // Nature. - 1999. - Vol. 11, № 402(6758). - P.181-184.
8. Heinonen P., Koulu M., Pesonen U. et al. Identification of a three-amino acid deletion in the alpha2B-adrenergic receptor that is associated with reduced basal metabolic rate in obese subjects // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 1999. - Vol.84, №7. - P. 429-433.
9. Heinonen P., Pettersson-Fernholm K., Forsblom C. et al. A deletion polymorphism of the alpha2B-adrenergic receptor gene is not associated with late complications in Type 1 diabetic patients // Diabet. Med. - 2005. -Vol.22, №2. - P. 226-228.
10. Link Richard E., Kavin Desai, Lutz Hein et al. Cardiovascular Regulation in Mice Lacking 2-Adrenergic Receptor Subtypes b and c // Science. - 1996. - Vol. 273, № 5276. - P. 803-805.
11. Siitonen N., Lindstrom J., Eriksson J. et al. Association between a deletion/insertion polymorphism in the alpha2B-adrenergic receptor gene and insulin secretion and Type 2 diabetes // The Finnish Diabetes Prevention Study. Diabetologia. - 2004. - Vol. 47, №8. - P. 1416-1424.
12. Snapir A., Heinonen P., Tuomainen T. P. et al. An insertion/deletion polymorphism in the alpha2B-adrenergic receptor gene is a novel genetic risk factor for acute coronary events // J. Am. Coll. Cardiol. - 2001. - Vol. 37, №6. - P.1516-1522.
13. Snapir A., Scheinin M., Groop L.C. et al. The insertion/deletion variation in the a2B-adrenoceptor does not seem to modify the risk for acute myocardial infarction, but may modify the risk for hypertension in sib-pairs from families with type 2 diabetes // Cardiovasc. Diabetol. - 2003. - Vol.24. - P. 2-15.
14. Suzuki N., Matsunaga T., Nagasumi K. et al. Alpha(2B)-adrenergic receptor deletion polymorphism associates with autonomic nervous system activity in young healthy Japanese // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 2003. -Vol. 88, №3. - P. 1184-1187.
15. Vasudevan R., Patimah Ismail., Johnson Stanslas et al. Association of Insertion/Deletion Polymorphism of Alpha-Adrenoceptor Gene in Essential Hypertension with or without Type 2 Diabetes Mellitus in Malaysian Subjects // Int. J. Biol. Sci. - 2008. - Vol.4. - P. 362-367.
16. Von Wowern F., Bengtsson K., Lindblad U. et al. Functional variant in the (alpha)2B adrenoceptor gene, a positional candidate on chromosome
2, associates with hypertension // Hypertension. - 2004. - Vol. 43, №3. - P. 592-597.
17. Zhang H., Li X., Huang J. et al. Cardiovascular and metabolic phenotypes in relation to the ADRA2B insertion/deletion polymorphism in a Chinese population // J. Hypertens. - 2005. - Vol.23, №12. - P. 2201-2207.
