CC BY
1914 Riechelmann H. Nasal biomarker profiles in acute and chronic rhinosinusitis / H. Riechelmann, T. Deutschle, A. Rozsasi et al. // Clin. and Experim. Allergy. - 2005. - V. 35. - № 9. - Р. 1186-1191.
15 Rudack C. Cytokine pattern in various forms of sinusitis / C. Rudack, U. Hauser, M. Wagenmann et al. // Laryngor-hinootologie. - 1998. - V. 77. - № l. - Р. 34-37.
16 Yu X. Antigen stimulation of Th2 cells augments acute bacterial sinusitis in mice / X. Yu, A. Sperling, C. Blair еt al. // J. Allergy Clin. Immunol. - 2004. - V. 114. - № 2. - Р. 328-34.
Рукопись получена: 5 октября 2016 г. Принята к публикации: 12 октября 2016 г.
УДК 617.55-007.43-089.843/.844:616-089.15
РОЛЬ ФАКТОРА НАТЯЖЕНИЯ В БИОСОВМЕСТИМОСТИ ПРОТЕЗИРУЮЩИХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ ГЕРНИОПЛАСТИКИ
© 2016 Ю.В. Пономарева1, Л.Т. Волова1, В.И. Белоконев1
1 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения
Российской Федерации
Применение протезирующего материала, независимо от его положения в тканях, не гарантирует закрытие дефекта передней брюшной стенки без натяжения. Наличие последнего в патологически измененных тканях ухудшает биосовместимость синтетических имплантов. Целью исследования было выявить в эксперименте морфологические изменения в различных мышцах живота при действии фактора натяжения и оценить реакцию тканей на протезирующий материал в этих условиях. Эксперименты выполнены с использованием трех групп лабораторных крыс. Показано, что при закрытии дефекта передней брюшной стенки с натяжением в прямых мышцах живота патоморфологические изменения соответсвуют липоматозу, а в наружной, внутренней косых и поперечной мышцах - фиброзу. При этом фактор натяжения изменяет соотношение основных популяций клеток вокруг волокон протезирующего материала, что в целом ухудшает показатели биосовместимости импланта с заведомо известными свойствами.
Ключевые слова: биосовместимость, ненатяжная герниопластика, мышечная ткань, синтетический имплант.
Современная герниология располагает более чем ста способами закрытия грыжевых ворот и сотней разновидностей эндопротезов, позволяющих использовать их в качестве материалов-вставок. Применение имплантов стало золотым стандартом и определило развитие ненатяжных способов пластики [2]. Однако в понятие ненатяжного способа включают как факт отсутствия натяжения при сшивании тканей и повышения внутрибрюшного давления после протезирования, так и применение импланта в целом. Применение эндопротезов, с одной стороны, позволило решить проблемы лечения больных с грыжами, снизив число рецидивов, а также наметить положительные тенденции в лечении больных с большими и гигантскими дефектами передней брюшной стенки [3]. С другой стороны, появился ряд серьезных осложнений, связанных с применением имплантов, такие как серомы и свищи. Проведено множество исследований, подтверждающих роль химической структуры, пористости, плотности материала на показатели биосовместимости. Имеются предпосылки комплексной оценки имплантов с позиции предсуществующих патологических изменений в тканях ПБС и фактора натяжения при его имплантации Цель исследования - в эксперименте оценить влия-
ние фактора натяжения на изменение тканей передней брюшной стенки и биосовместимость протезирующих материалов для герниопластики.
Материалы и методы. Проведено две серии экспериментов с использованием лабораторных крыс стока Wistar (n = 72). Содержание последних осуществляли в условиях стационарного сертифицированного вивария (ИСО 9001:2008). Крысы получали полнорационный корм для лабораторных животных, доступ к воде был свободным. При выполнении исследования руководствовались национальным стандартом РФ ГОСТ Р 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики», полностью аутентичным стандартам GLP/OECD.
Все болезненные манипуляции, оперативные вмешательства были проведены с использованием аналгезии и седации разрешенными к применению в ветеринарии препаратами. В ходе выполнения эксперимента осуществляли ежедневный контроль состояния животных. По завершении эксперимента проводили эвтаназию животным введением летальной дозы тиопентала натрия внутрисердечно.
В соответствии с целями эксперимента все животные были разделены на группы: N1 -(n = 24) - произведен срединный разрез кожи с выделением средней линии живота и прямых мышц с последующей имплантацией одного из тестируемых материалов, где в зависимости от вида импланта были выделены подгруппы: N1 - Э - «Эсфил стандарт» (ЗАО «Линтекс, Россия); N1 - ОТ - Optomesh Thinlight (Tricomed, Польша); N1 - Ti - «Титановый шелк» (НПФ «Темп», Россия); N1 - Ф - «Фторэкс» (ЗАО «Линтекс, Россия). N2 - (n = 24) - выполнен срединный дефект ПБС с одноэтапным его закрытием методом мышечно-апоневротической пластики по типу дупликатуры без применения синтетического импланта; N3 - группа крыс (n = 24), которым смоделирован срединный дефект ПБС с последующим одноэтапным его закрытием по типу дупликатуры с размещением синтетического импланта в тканях прямой мышцы живота в позиции on lay. В зависимости от примененного импланта также были выделены подгруппы: N3 - Э - «Эсфил стандарт»; N3 - ОТ - Optomesh Thinlight; N3 - Ti - «Титановый шелк»; N3 - Ф - «Фторэкс». Сроки наблюдения за животными составили 30, 90, 180 суток. По истечении контрольных сроков получали макрообъекты из зоны прямых мышц живота по средней линии, а также фрагменты наружной, внутренней косых и поперечной мышц. Полученные образцы биоматериала размерами 0,7*0,7 см помещали на тонкую пластиковую подложку, а затем погружали в 10 % раствор нейтрального формалина. Промывку производили проточной водой. Обезвоживание образцов осуществляли в спиртах восходящей крепости, после чего заливали в парафин и изготавливали серийные срезы толщиной 5-7 мкм на микротоме Sakura Accu-Cut SRM200 (Sakura, Finetek, Япония). Производили окраску препаратов гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизон, крезило-вым фиолетовым для оценки популяций клеток, орсеином, железным гематоксилином по стандартным методикам.
Морфологическое исследование полученных препаратов и морфометрический анализ провели с использованием аппаратурного комплекса (микроскоп Nikon Alphaphot-2 YS2-H и видеокамера KCC-31 OPD) с программным обеспечением «Морфология 5.2». (ООО «Видеотест», Санкт-Петербург, Россия). В ходе морфометрического анализа зоной интереса была как мышечная ткань, так и микроокружение вокруг волокон протезирующих материалов. Не менее чем в 10 полях зрения производили измерения: толщины капсулы (мкм), толщины коллагеновых волокон (мкм); соотношение различных популяций клеток (%) (макрофаги, лимфоциты, фибробласты); количества ГКИТ (шт.) и число ядер в них (шт.).
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием парного i-теста Стьюдента для независимых выборок, а также однофакторного дисперсионного анализа ANOVA. Достоверными считали различия при р < 0,05.
Полученные результаты. В группе животных N1, у которых тестируемые материалы были размещены в позиции on lay, без нарушения целостности подлежащих тканей независимо от срока исследования не было выявлено каких-либо значимых морфологических изменений в мышечной ткани ПБС. Относительные плотности (прямые мышцы): мышечной ткани - 91,7 ± 1,5 %, жировой - 0,0 %; соединительной - 8,3 ± 2,2 %. Толщина мышечных волокон - 58,6 ± 1,9 мкм. Относительные плотности (боковые мышцы): мышечной ткани -
92.2 ± 3,5 %, жировой - 0,0 %; соединительной - 7,7 ± 2,0 %. Толщина мышечных волокон -
56.3 ± 2,6 мкм.
В подгруппе N1 - Э отмечено развитие реакции на инородное тело с формированием гранулемы, протяженность которой достоверно нарастала до 90 суток, затем распространенность реакции увеличивалась (р > 0,05). Со сроком присутствия импланта в тканях изменялась структура формирующейся гранулемы, в ее составе были обнаружены коллагеновые волокна, толщина которых имела тенденцию к прогрессивному избыточному нарастанию (р < 0,05), что свидетельствовало о развитии фиброза. В динамике произошло уменьшение числа макрофагов (р > 0,05) и увеличение числа ГКИТ (р < 0,05) и числа ядер в них (р < 0,05). Лимфоцитарная инфильтрация на всех сроках эксперимента оставалась стабильной величиной.
В подгруппе N1 - Ti также имело место развитие реакции на имплантированный материал с формированием капсулы, толщина которой нарастала на сроке до 90 суток (р < 0,05); на сроке 90-180 суток (р > 0,05). Снижение доли макрофагов в структуре капсулы достоверно происходило на сроке 90-180 суток. Число ГКИТ и количество их ядер нарастало (р < 0,05) на протяжении всех сроков эксперимента. Достоверное снижение лимфоцитарной инфильтрации имело место на сроках 30 и 90 суток, а затем следовало ее увеличение (р > 0,05). На всех сроках имели признаки прямого травмирующего воздействия импланта на окружающие ткани.
В подгруппе N1 - Ф в ответ на имплантацию отмечено достоверное увеличение числа ГКИТ до 90 суток эксперимента, затем их увеличение было недостоверным. Число ядер в составе ГКИТ нарастало на всех сроках (р < 0,05). Наряду с этим снижалось число макрофагов (р > 0,05), а число лимфоцитов до 90 суток имело тенденцию к увеличению, а к 180 суткам наоборот - к снижению (р < 0,05). Отличительной особенностью реакции на этот материал стала инфильтрация волокон полиморфноядерными лейкоцитами, интенсивность которой уменьшалась на протяжении всего эксперимента, но значимых отличий этот показатель достиг только к 90 суткам.
В подгруппе N1 - ОТ толщина капсулы, свидетельствующая о развитии реакции на инородное тело, нарастала на протяжении всего эксперимента (р < 0,05). Клеточное микроокружение с течением времени заменялось на фиброзные волокна. Число ГКИТ и количество ядер в их составе увеличивалось (р < 0,05), а число макрофагов уменьшалось. Имело место увеличение доли лимфоцитов и фибробластов, однако, эти показатели не достигали достоверных значений (рис. 1).
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
к ^ ^ ^ ^ ^
„Г „Г л*
с* > ^ ® 8 ^
о^ с?V
Х'О Л" ^
I Прочие клетки, %
I Полиморфноядерные лейкоциты,%
Лимфоциты,% I Фибробласты,% I Макрофаги,%
Рис. 1. Соотношение популяций клеток вокруг волокон имплантов (группа N1)
В группе животных N2, где имело место действие фактора натяжения на сроке 30 суток, в прямых мышцах выявлено изменение тинкториальных свойств в направлении ослабления восприятия к красителям, извитость мышечных волокон с утолщением некоторых из них и частичной потерей поперечно-полосатой исчерченности при сохранении эксцентричной позиции ядер. В периферических зонах от места пластики, представленных наружной, внутренней косой и поперечными мышцами явления начинающегося фиброза эндомизия. Относительные плотности (прямые мышцы): мышечной ткани - 90,2 ± 3,0 %, жировой -0,5 ± 0,1 %; соединительной - 9,3 ± 1,5 %. Толщина мышечных волокон - 66,7 ± 4,1. Относительные плотности (боковые мышцы): мышечной ткани - 87,3 ± 2,9 %, жировой - 1 ± 0,2 %; соединительной - 11,7 ± 1,8 %. Толщина мышечных волокон - 125 ± 3,3 мкм. К 90 суткам в прямых мышцах отмечены явления липоматоза. Реактивные изменения в эндомизии комплекса косых мышц были связаны с инициацией и прогрессированием фиброза. Относительные плотности (прямые мышцы): мышечной ткани - 74,4 ± 2,7 %, жировой - 18,4 ± 1,2 %; соединительной - 10,0 ± 2,0 %. Толщина мышечных волокон - 53,9 ± 3,8. Относительные плотности (боковые мышцы): мышечной ткани - 78,5 ± 3,1 %, жировой - 4,5 ± 0,5 %; соединительной - 17 ± 1,5 %. Толщина мышечных волокон - 64,1 ± 2,4 мкм.
К 180 суткам эксперимента в прямых мышцах выявлены признаки атрофии мышечной ткани и вакантное разрастание жировой. Для боковых мышц патологические изменения в виде фиброза. Относительные плотности (прямые мышцы): мышечной ткани - 55,8 ± 3,1 %, жировой - 31,2 ± 3,9 %; соединительной - 13,0 ± 1,5 %. Толщина мышечных волокон -29,3 ± 2,9. Относительные плотности (боковые мышцы): мышечной ткани - 70,6 ± 2,5 %, жировой - 5,5 ± 0,7 %; соединительной - 23,9 ± 1,9 %. Толщина мышечных волокон - 49,8 ± 1,5 мкм.
Для группы N3 исследование мышц показало те же закономерности, что и для группы N2. Морфометрия прямых мышц ПБС на 30 сутки показала, что относительные плотности: мышечной ткани - 89,9 ± 2,5 %, жировой - 0,8 ± 0,1 %; соединительной - 10,1 ± 0,9 %. Толщина мышечных волокон - 64,2 ± 2,4. Относительные плотности (боковые мышцы): мышечной ткани - 86,1 ± 2,8 %, жировой - 2,1 ± 1,2 %; соединительной - 11,8 ± 1,3 %. Толщина мышечных волокон - 121,8 ± 2,2 мкм. К 90 суткам относительные плотности: мышечной ткани - 69,1 ± 3,1 %, жировой - 16,3 ± 1,9 %; соединительной - 9,5 ± 1,0 %. Толщина мышеч-
ных волокон - 61,2 ± 1,3. Относительные плотности (боковые мышцы): мышечной ткани -79,9 ± 2,3 %, жировой - 3,6 ± 0,4 %; соединительной -16,5 ± 1,1 %. Толщина мышечных волокон - 60,7 ± 2,6 мкм. К 180 суткам относительные плотности: мышечной ткани - 56,3 ± 1,9 %, жировой - 29,1 ± 2,5 %; соединительной - 14,6 ± 1,3 %. Толщина мышечных волокон -29,7 ± 1,5 мкм. Относительные плотности (боковые мышцы): мышечной ткани - 75,4 ± 1,2 %, жировой - 4,3 ± 1,0 %; соединительной - 20,3 ± 1,5 %. Толщина мышечных волокон -46,9 ± 1,8 мкм
Применение синтетического импланта ОрШтеБЬ в качестве материала-вставки при натяжном закрытии ПБС (N3 - ОТ) способствовало достоверному увеличению толщины капсулы только до 90 суток. Толщина волокон нарастала, но без признаков фиброзной трансформации. Число ГКИТ к 90 суткам увеличивалось (р > 0,05), а затем уменьшалось (р < 0,05), тем не менее число ядер в их составе прогрессивно снижалось (р < 0,05). Имело место достоверное увеличение числа макрофагов и лимфоцитов.
В подгруппе N3 - Т толщина капсулы увеличивалась к 90 суткам (р < 0,05), а затем уменьшалась (р > 0,05). Число ГКИТ уменьшалось на протяжении всего эксперимента (р < 0,05 к 90 суткам), а достоверное снижение числа ядер в их составе происходило только к 180 суткам. Относительное число макрофагов достоверно увеличивалось к 30 и 90 суткам, а лимфоцитов только к 180 суткам.
В погруппе N3 - Ф толщина капсулы на всех сроках практически не изменялась, так же как и толщина коллагеновых волокон, входящих в ее структуру. Практически не увеличивалось число ГКИТ, а число ядер в их составе нарастало к 90 суткам, а затем снижалось (р < 0,05). Выраженность инфильтрации макрофагами была стабильна к 30 и 90 суткам, а затем уменьшалась (р < 0,05). Отличительной особенностью этих материалов стало наличие лейкоцитарной инфильтрации, которая имела тенденцию к снижению к концу эксперимента (р > 0,05). Количественные данные по группе N3 отражены на рис. 2.
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
о£> Ф
^ ^ ^ч^ <л
л?
I Прочие клетки, % (тучные, эозинофилы)
IПолиморфноядерные лейкоциты,%
Лимфоциты,%
Фибробласты,% Макрофаги,%
Рис. 2. Соотношение популяций клеток вокруг волокон имплантов (группа N3)
Обсуждение. Результаты проведенного эксперимента возможно рассмотреть с позиций оценки взаимного влияния фактора натяжения на мышечную ткань и на протезирующий материал. Известно, что при развитии грыжи любой локализации имеет место дистрофия тканей передней брюшной стенки по типу вакантной жировой и объясняется неспособностью мышечных волокон к сокращению вследствие утраты механизма передачи сигнала от апоневротиче-
ских структур [1, 5]. Рассматривая переднюю брюшную стенку как единый комплекс, следует отметить, что вышесказанное будет характерно только для утративших способность к сокращению мышечных волокон. Напротив, в мышцах антогонистах вследствие перераспределения нагрузки начинают преобладать противоположные процессы - компенсаторная гипертрофия, а затем развитие фиброза. Это продемонстрировано результатами проведенного эксперимента. Статистический анализ динамики изменения относительных плотностей различных тканей, формирующих прямые и боковые мышцы показал, что при моделировании натяжения не все мышцы в одинаковой степени его испытывают. Так, в прямых мышцах после моделирования сокращения практически не были возможны, и как следствие имело место развитие морфологических признаков их персистирующей альтерации с последующим развитием в них атрофии. Избыточная нагрузка на комплекс боковых мышц способствовал развитию компенсаторной гипертрофии мышечных волокон, а затем фиброза. Последние данные литературы свидетельствуют, что реализация любых механизмов, препятствующих нормальному сокращению мышц способствует дифференцировке и активации фиброзно-адипозной популяции клеток, которые становятся источниками жировой и фиброзной тканей [6, 7].
Имплантация любого синтетического материала сопровождается развитием реакции на инородное тело, исходом которой является формирование фиброзных капсул вокруг волокон протезирующего материала [4]. На первом этапе взаимодействия материал-ткань происходит конкурентная необратимая адсорбция белков, которые определяют тип популяций клеток для их последующей миграции и адгезии. Как правило, такими клетками являются макрофаги. Мигрируя к поверхности имплантов, происходит процесс их активации и слияния. Клеточное микроокружение секретирует множество факторов, определяющих ангиогенез и фиб-роплиферацию. Данные процессы были подтверждены качественно и количественно для различных материалов в пределах группы N1. Не обнаружено достоверной разницы по толщине капсулы между двумя материалами на основе полипропилена. Толщина капсулы, формируемая вокруг титановых имплантов, достоверно ниже, чем у полипропиленовых. В динамике в структуре капсулы происходило увеличение доли соединительной ткани. Наряду с этим число ГКИТ, окружающих волокна, нарастало, так же как и число ядер в их составе. Обратная зависимость наблюдалась для макрофагов: с течением времени их относительное содержание для титановых и полипропиленовых имплантов достоверно снижалось. Относительное число лимфоцитов для полипропиленовых и титановых эндопротезов изменялось в динамике как в направлении увеличения, так и снижения. В большинстве случаев эти изменения не были достоверными. Значительно отличалась реакция тканей на эндопротез Фторэкс. Среди микроокружения его волокон имелись ГКИТ, макрофаги и лимфоциты. Отличительной особенностью его от всех других анализируемых материалов стало наличие полиморфноядерной лейкоцитарной инфильтрации, интенсивность которой в погруппе N1 - Э снижалась достоверно только до 90 суток исследования. Наличие этих клеток в составе микроокружения возможно объяснить выраженной гидрофобностью материала, препятствующей адгезии клеток к его поверхности, процессам слияния для макрофагов, что подтверждалось наличием единичных ГКИТ в структуре микроокружения на всех сроках исследования. Известно, что при невозможности адгезии клеток к поверхности имеет место инициация процессов апоптоза с последующей инфильтрацией клеточного детрита полиморфноядерными лейкоцитами [8].
Действие фактора натяжения в группе N3 продемонстрировало особенности реакции на протезирующие материалы, заключающиеся в динамическом изменении толщины капсулы с достоверным ее увеличением, а затем уменьшением для полипропиленовых и титановых им-
плантов. При этом данные морфометрии не позволили выявить фиброзные волокна, толщина последних изменялась в различных направлениях и недостоверно. Во всех подгруппах, за исключением N3 - Ф, не было отмечено прогрессивной динамики увеличения числа ГКИТ. Этот показатель был относительно стабильным и изменения его не носили достоверный характер. Достоверным показателем в подгруппах титанового и полипропиленовых имплантов стало уменьшение числа ядер в составе ГКИТ и нарастание числа макрофагов и лимфоцитов. Такие данные можно объяснить наличием постоянных сигналов к миграции клеток вследствие повреждающего действия волокон протезирующих материалов на микроокружение, при этом нарастающее число лимфоцитов, по-видимому, выполняло регуляторную роль в этом процессе. Ни в одном из случаев закрытия дефекта передней брюшной стенки с натяжением не были выявлены полиморфноядерные лейкоциты, которые являются не редкой находкой при морфологическом анализе биоптатов у больных с рецидивами грыж различных локализаций, что возможно объяснить не только активацией очагов дремлющей инфекции, но и реакцией организма на собственные поврежденные ткани, в образовании которых ключевая роль принадлежит фактору натяжения. В подгруппе N3 - Ф в целом прослежены те же закономерности по показателям макрофагов и лимфоцитов, что и для других видов имплантируемых материалов в этой группе, тем не менее, при сравнении этих показателей в динамике внутри подгруппы, не было выявлено достоверных различий, а при сравнении с подгруппой N1 - Ф показатели числа лейкоцитов и макрофагов были достоверно выше.
Таким образом, имплантация синтетических материалов без натяжения способствует развитию реакции на инородное тело с последующим формированием для полипропиленовых и титановых образцов фиброзной капсулы. При действии фактора натяжения вокруг волокон протезирующих материалов происходит развитие реакции на инородное тело, которая практически не сопровождается формированием фиброзной капсулы, а отражает процессы перманентного ре-моделирования как экстрацеллюлярного матрикса, так и микроокружения. При создании и доклинической оценке протезирующих материалов необходимо учитывать факторы, начинающие свое воздействие после имплантации и влияющих на показатели биосовместимости.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Белоконев В.И., Пушкин С.Ю. Результаты лечения больных срединной вентральной грыжей с применением синтетических эндопротезов // Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова. - 2010. - № 6. - С. 43-45.
2 Егиев В.Н. Ненатяжная герниопластика. - М.: Медпрактика, 2002.
3 Плешков В.Г., Агафонов О.И. Послеоперационные вентральные грыжи - нерешенные проблемы // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. - 2009. - Т. 2. - № 3. - С. 248-255.
4 Anderson, J.M. Foreign body reaction to biomaterials / J.M. Anderson, A. Rodriguez, D.T. // Chang Semin. Immunol. - 2008 - Vol. 20. - № 2. - P. 86-100.
5 Binnebosel M. Impact of mesh positioning on foreign body reaction and collagenous ingrowth in a rabbit model of open incisional hernia repair / M. Binnebosel, C.D. Klink, J. Otto, J. Conze, P.L. Jansen, M. Anurov et al. // Hernia.
- 2010. - Vol. 14. - № 1. - P. 71-77.
6 Charge, S.B. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration / S.B. Charge, M.A. Rudnicki // Physiol. Rev.
- 2004. - Vol. 84. - P. 209-238.
7 Joe A.W. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis / A.W. Joe, L .Yi, A. Natarajan, Le Grand F.., L.So, J.Wang et al. // Nat Cell Biol. - 2010. - Vol. 12. - P. 153-163.
8 Soehnlein O. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment / O. Soehnlein, L. Lindbom, C. Weber // Blood. - 2009. - Vol. 114. - № 21. - P. 4613-4631.
Рукопись получена: 12 октября 2016 г. Принята к публикации: 17 октября 2016 г.
