CC BY
188
lililí
Обзоры
Роль эндотелиальных прогениторных клеток при атеросклерозе
А. Е. Семенова, И. В. Сергиенко, А. Л. Домбровский, А. В. Рвачева ФГБУРКНПКМЗиСРРФ, Москва
Абстракт
В настоящее время изучение эндотелиальных прогениторных клеток (ЭПК) для практического применения в клинике выглядит перспективным в связи с доказанным участием этих клеток в поддержании функции эндотелия и формировании новых сосудов. Установлено, что снижение количества ЭПК в крови является независимым предиктором заболеваемости и смертности от сердечно-сосудистых заболеваний. Рассматриваются подходы к увеличению количества и функциональной активности ЭПК.
Ключевые слова: чрескожное коронарное вмешательство, стенты с лекарственным покрытием Cypher и Promus, двойная антитромбоцитарная терапия.
Endothelial progenitor cells and atherosclerotic process
A.E. Semenova, I.V Sergienko, A.L. Dombrovskiy, A.V Rvacheva.
Russian Cardiology Research Complex, Moscow
Abstract
Practical use of endothelial progenitor cells (EPC) looks promising since it was found that these cells took an active part in endothelial function and new vessel growth. It is shown that EPC decrease is an independent predictor of cardiovascular morbidity and mortality. Different ways of EPC quantity increase and functional improvement are the subjects of investigation.
~ Key words: endothelial progenitor cells, vasculogenesis, endothelial function, cardiovascular disease.
Эндотелиальные прогениторные клетки (ЭПК) привлекают внимание ученых своим участием в процессах восстановления эндотелия и в формировании новых сосудов. Термины «прогени-торная клетка», «стволовая клетка» или «клетка-предшественник» относятся к клеткам иммунной системы, которые обладают способностью к самообновлению и дифференцировке в различные типы клеток. Поэтому эти клетки потенциально могут восстанавливать функцию поврежденных тканей [1,2]. ЭПК, по аналогии с другими клетками-предшественниками, являются специфичными для определенного клеточного ряда и включают крайне разнородную популяцию клеток, способных дифференцироваться исключительно в эндотелиальные клетки [3]. Большинство клеток-предшественников созревают из гемато-поэтических стволовых клеток, в основном находящихся в костном мозге, периферической крови и пупочном канатике, но также присутствующих в селезенке, кишечнике, печени, жировой ткани и адвентиции [4]. Независимо от своего источника все гематопоэтические стволовые клетки являются носителями маркеров CD34+ и CD133+. Помимо ЭПК, гематопоэтические стволовые клетки также способны вырабатывать миелоидную (за исключением эритроцитов) и гранулоцитарно-макрофагальную линии клеток. Поэтому, кроме
14
экспрессии маркеров гематопоэтических стволовых клеток, на поверхности ЭПК экспрессируются и эндотелиальные маркеры, такие как рецептор-2 сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGFR-2), СD31, эндотелиальная синтаза оксида азота (NO) и сосудистый эндотелиальный кадгерин [4-8]. Гематопоэтические стволовые клетки являются главным источником ЭПК, но они также могут вырабатываться и мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга. в связи с тем что CD14+ миелоидные субпопуляции экспрессируют и гематопоэтические, и эндотелиальные маркеры, CD 14+ моноциты способны дифференцироваться в эндотелиальные клетки [8-11].
Первая публикация о наличии в периферической крови ЭПК костномозгового происхождения была сделана Asahara с коллегами в 1997 году [12]. в настоящее время отсутствует стандартный набор маркеров для идентификации ЭПК. Используются поверхностные маркеры гематопоэтиче-ских и эндотелиальных клеточных линий, такие как CD34, CD133, рецептор 2 эндотелиального фактора роста (VEGFR2) либо рецептор домена киназы (KDR). Комбинации следующих маркеров для идентификации ЭПК использовались в исследованиях: CD34+/KDR+, CD34+/CD133+, CD133+/ ^+, CD34+/CD133+/KDR+, CD34-/KDR+, СD34+/ СD133+/VEGFR-2+ и СD34VСD133+/VEGFR-2+
[13-15]. При применении метода культивирования для функционального анализа ЭПК необходимо помнить, что в разных условиях культуры продуцируют разные фенотипы ЭПК, в частности, «ранние» недифференцированные клетки и «поздние» дифференцированные клетки либо их смесь.
ЭПК и васкулогенез.
ЭПК участвуют в процессе формирования кровеносных сосудов in situ, который называется васкулогенез [16-18]. Ранее считалось, что васкулогенез происходит только во время эмбрионального развития. в настоящее время получены доказательства участия ЭПК в формировании новых сосудов во взрослом организме: диагностика в периферической крови взрослых людей ЭПК костномозгового происхождения и подтверждение их участия в формировании новых сосудов [16]. ЭПК считаются основными клеточными стимуляторами пост-натального васкулогенеза. При введении ЭПК экспериментальным животным с ишемией конечности происходит их накопление в очагах неоваску-ляризации ишемизированных мышц, кожи, области раны [16-22].
Лечение стенозирующего атеросклеротического поражения в клинике ограничено возможностями хирургического (шунтирование) и эндова-скулярного (ангиопластика) лечения в комбинации с медикаментозной терапией. в ряде исследований на экспериментальных моделях ишемии конечностей [21,23] и у больных с ишемией конечностей, не корректирующейся традиционными методами лечения [24,25] показано, что пересадка монону-клеарных клеток из костного мозга, включая ЭПК, ведет к увеличению количества формирующихся коллатеральных сосудов.
ЭПК и эндотелиальная функция.
ЭПК эффективно помогают поддерживать целостность сосудистого эндотелия, что тормозит развитие атеросклероза. Процесс привлечения и миграции ЭПК в организме, включая экзогенно введенные клетки, управляется клетками, находящимися непосредственно в зоне повреждения. Различные типы клеток внутри атеросклеротических бляшек способны мобилизировать и направить ЭПК к сосудам с поврежденным эндотелием. При атеросклеротическом поражении высвобождение ЭПК из мест их депонирования происходит в результате начала поступления молекулярных сигналов от иммунных клеток, расположенных внутри атеросклеротических бляшек. в восстановлении сосудистого повреждения принимают участие и активированные макрофаги М2 типа посредством выработки ими гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) [26], который облегчает выход ЭПК в кровеносное русло. Стимулированное цитокинами высвобождение про-
теаз, таких как эластаза, катепсин G и матрикс-ная металлопротеиназа 9 (ММР-9), отсоединяют ЭПК от адгезивного взаимодействия с клетками стромы [8,27]. Далее ЭПК привлекаются и моби-лизируются в зону повреждения. Важным направляющим сигналом является хемокин стромальный клеточный фактор 1 (SDF-1), который в базовом режиме вырабатывается костным мозгом и многими другими тканями. Однако в костном мозге существует градиент, который удерживает ЭПК. в условиях ишемии, воспаления и гипоксии данный градиент в костном мозге меняется на противоположный под воздействием индуцированного гипоксией фактора 1 (HIF-1), стимулирующего SDF-1 в поврежденных тканях [28-31]. Оксид азота, эстрогены, липопротеины высокой плотности (ЛВП), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и эритропоэтин также способствуют повышению плазменного титра ЭПК и привлечению ЭПК в область повреждения через расширение фосфатидил-инозитол-3-фосфат (PIP3)/Akt пути [32-34]. Связывание ЭПК с поврежденным эндотелием осуществляется с помощью молекул клеточной адгезии, таких как Р/Е-селектин и ICAM-1 [35]. При выраженном повреждении сосудов происходит активация тромбоцитов экспонированными белками матрикса с прилипанием тромбоцитов к лишенной эндотелия оголенной области сосудистой стенки. Активация тромбоцитов ведет к формированию микротромбов и экспрессии SDF-1, что направляет ЭПК к поврежденному эндотелию. Более того, ЭПК способны приклеиваться не только к эндотелию, но также к тромбоцитам через взаимодействие с Р-селектином и GPIIb интегрином [36-38]. Под воздействием напряжения сдвига ламинарного кровотока прикрепившиеся ЭПК начинают дифференцироваться в эндотелиальные клетки [2,39].
ЭПК и факторы риска сердечно-сосудистых осложнений.
В настоящее время показано, что количество и функциональная активность циркулирующих ЭПК являются маркерами сосудистого риска для множества заболеваний, в том числе, сердечнососудистой системы [40]. Данный биомаркер независим от других традиционных и нетрадиционных факторов риска, среди которых гипертония, гипер-холестеринемия и СРБ.
Возраст, мужской пол, артериальная гипертония, сахарный диабет, гиперлипидемия, курение, ожирение и гиподинамия являются факторами риска, способствующими развитию сосудистого повреждения. Известно, что сердечно-сосудистые факторы риска влияют на количество и функцию ЭПК. J. Hill et al. продемонстрировали наличие обратной связи между количеством ЭПК и суммарным числом факторов риска [7]. Интересно, что они нашли обратную корреляцию между коли-
lililí
Обзоры
чеством ЭПК и функцией эндотелия. Несколько исследователей подтвердили наличие связи между количеством ЭПК и факторами риска сердечнососудистых заболеваний (ССЗ) [41,42]. M. Vasa et al. продемонстрировали подавление миграции ЭПК у больных ИБС, усиливающейся на фоне увеличения количества факторов риска [42]. Также известно, что мононуклеарные клетки костного мозга, извлеченные у больных ИБС, имеют сниженную способность к неоваскуляризации. Очевиден тот факт, что наличие сердечно-сосудистых факторов риска обратно коррелирует с количеством и функциональным состоянием ЭПК. Однако механизм подавления ЭПК у больных ССЗ до конца не ясен. Снижение уровня периферических циркулирующих ЭПК происходит за счет уменьшения их мобилизации из костного мозга и истощения пула стволовых клеток. Как было указано выше, мобилизация ЭПК регулируется различными ангиоген-ными цитокинами, такими как VEGF, G-CSF и стро-мальный клеточный фактор 1, а также биодоступностью NO в костном мозге. NO участвует в регуляции функции ЭПК в ответ на различные стимулы через активацию матриксной металлопротеиназы 9 (ММР-9). ММР-9 индуцирует трансформацию Kit лиганды из мембраносвязанного в растворимое состояние, потенцируя последующий выход в кровоток с^-положительных стволовых клеток, включая общие предшественники гематопоэтических прогениторных клеток и ЭПС (например, гемангио-бласты). Эти данные согласуются с тем фактом, что у мышей, дефицитных по NO-синтазе (NOS 3_/_), значительно снижена мобилизация ЭПК [43]. Биодоступность NO зависит от сердечно-сосудистых факторов риска, которые снижают мобилизацию ЭПК. Функциональная способность ЭПК мигрировать и встраиваться в тубуло-подобные структуры при неоваскуляризации частично определяется эндотелиальным NOS-NO механизмом.
ЭПК и возраст.
Возраст является важным фактором, ведущим к снижению количества ЭПК и влияющим на их функцию. Многофакторный анализ показал, что возраст является независимым фактором снижения количества ЭПК [41]. Известно, что с возрастом биодоступности NО также снижается, что, вероятно, влияет на уровень ЭПК. Thum et al. [44] показали, что прием соматотропного гормона (гормон роста) у здоровых мужчин среднего возраста восстанавливает исходно сниженное количество ЭПК, их колониеобразующую способность, способность к миграции и образованию тубуло-подобных структур через IGF-1-опосредованную стимуляцию фос-фоинозитид (PI)-3-киназа/Akt/eNOS механизм.
VEGF известен своей способностью стимулировать мобилизацию ЭПК из костного мозга. в ишемизированных тканях экспрессия VEGFусилена,что ведет к мобилизации и привлечению ЭПК в область
16
ишемии. Перенос гена VEGF в ишемизированную ткань более чем в два раза повышает уровень циркулирующих ЭПК. Scheubel et al. [45] опубликовали данные, что у пожилых пациентов низкий уровень VEGF плазмы ассоциируется со сниженной мобилизацией ЭПК из костного мозга, однако причина пониженного уровня VEGF не известна. с другой стороны, нет четких данных о связи возраста и уровня VEGF. Возникающие с возрастом клеточное повреждение и/или нестабильность генома ведут к старению ЭПК, вероятно, вследствие роста окислительного стресса. ЭПК пожилых пациентов отличаются снижением количества теломераз и более выраженными процессами старения клеток [46].
ЭПК и пол.
Хотя эстрогены in vivo и in vitro ведут к повышению количества ЭПК и активизации таких их функций как адгезия, миграция, пролиферация и подавление апоптоза, нет достоверных данных за более высокий уровень и функциональную активность ЭПК у женщин. Masuda et al. [47] показали, что количество CD34+ клеток и АС133+ клеток, включая незрелые ЭПК достигает пика в постовуляторную фазу менструального цикла, следующую за пиком сывороточной концентрации эстрогена в периову-ляторную фазу, сделав предположение, что количество ЭПК регулируется менструальным циклом.
ЭПК и артериальная гипертония.
M. Vasa et al. [42] продемонстрировали, что количество и миграционная способность ЭПК снижены у больных артериальной гипертонией. При этом предполагаемое снижение мобилизации ЭПК из костного мозга может быть объяснено подавлением эндотелий-зависимой вазодилатации у больных с артериальной гипертонией вследствие снижения биодоступности NO [33]. Первичной причиной снижения биодоступности NO в данном случае считается накопление свободных кислородных радикалов (ROS), которые влияют на пролиферацию, старение и/или апоптоз ЭПК. Суммарные результаты исследований позволяют предположить, что ангиотензин II стимулирует начало старения ЭПС через gp91 phox-регулируемое усиление окислительного стресса у больных артериальной гипертонией [48]. Интересен тот факт, что у больных, принимавших ингибиторы ренин-ангиотензиновой системой (РАС), наблюдался повышенный уровень ЭПК. Bahlmann et al. в проспективных исследованиях показали наличие роста числа ЭПК у больных с нормальными цифрами АД либо умеренной артериальной гипертонией на фоне приема антагониста ангиотензин II рецептора олмесартана [49]. Эти данные подтверждают важную роль РАС в регуляции биоактивности ЭПС у больных артериальной гипертонией.
ЭПК и сахарный диабет.
У больных сахарным диабетом (СД) как 1, так и 2 типа количество ЭПК снижено. Tepper et al. [50] показали, что ЭПК, выделенные у больных СД, отличаются сниженной способностью к адгезии, пролиферации и образованию тубулопо-добных структур. Повышенный уровень гликиро-ванного гемоглобина, а также уровень глюкозы плазмы обратно коррелируют с количеством ЭПК. При сахарном диабете инсулинорезистентность через подавление PI3-киназа/Akt/eNOS пути оказывает существенное влияние на развитие эндотелиальной дисфункции и прогрессирование атеросклероза. Следствием инактивации PB-киназа/ Akt/eNOS пути является снижение биодоступности NO и мобилизации ЭПК из костного мозга. Krankel et al. показали, что токсическое воздествие глюкозы при наличии гипергликемии подавляет пролиферацию и усиливает апоптоз ЭПК посредством стимуляции p16Ink-4a и p21Waf-1 механизмов [51]. Стимуляция p16Ink-4a и p21 Waf-1 путей ведет к блокировке цикла деления клетки. Р38 митоген-активированная протеин киназа также имеет отношение к индуцированному гипергликемией подавлению ЭПК. Подавление миграционной и интегративной активности ЭПК при сахарном диабете связано с измененной биодоступностью NO и активностью ММР-9. Степень подавления функции ЭПК связана с тяжестью диабетической васку-лопатии, проявлениями которой являются стено-зирующий атеросклероз артерий нижних конечностей и стенозы сонных артерий. Эти данные позволяют предположить, что ЭПК играют важную роль в патогенезе диабетической васкулопатии.
ЭПК и дислипидемия.
В ряде исследований продемонстрировано, что высокий уровень ЛНП ведет к снижению количества и подавлению функции ЭПК [52]. Окисленные ЛНП индуцируют старение и подавление адгезивных, миграционных и тубулообразующих свойств ЭПК через инактивацию Akt/eNOS пути. Llevadot et al. показали, что усиление мобилизации ЭПК из костного мозга симвастатином происходит через активацию Akt/eNOS пути [53]. Деактивация тело-мераз окисленными ЛНП нивелировалась при приеме аторвастатина, что вело к восстановлению ЭПК и обратному развитию процессов старения ЭПК. Известно, что ЛВП предупреждают прогрессирование атеросклероза. Низкий уровень ЛВП ассоциируется с повышенным риском ССЗ. Хотя точные механизмы положительного влияния ЛВП на процессы атеросклероза до конца не ясны, их протек-тивный сосудистый эффект согласуется с данными о способности увеличивать количество и функциональную активность ЭПК. Показано, что введение ЛВП у больных сахарным диабетом ведет к увеличению количества ЭПК [54]. Усиление мобилиза-
ции и дифференцировки ЭПК под воздействием ЛВП, вероятно, происходит за счет активации PI3-киназа/Akt/eNOS пути и предупреждения апоптоза.
ЭПК и ожирение, инсулинорезистентность, метаболический синдром.
Известно, что ожирение способствует развитию эндотелиальной дисфункции и атеросклероза. Мало что известно о непосредственной связи между ожирением и ЭПК. Fadini et al. показали, что больные с метаболическим синдромом имеют пониженное содержание ЭПК [55]. Накопление висцерального жира ведет к стимуляции ФНОа и ИЛ-6 и подавлению адипонектина, следствием чего является эндотелиальная дисфункция и высокая инсулинорезистентность, отрицательно коррелирующие с количеством и функциональной активностью ЭПК. Агонисты рецептора-у, активирующего пролиферацию пероксисом (PPAR-y), повышают чувствительность к инсулину и положительно влияют (снижая сосудистое воспаление, улучшая эндотелиальную функцию и подавляя гиперплазию гладко-мышечных клеток) на состояние сосудистой сети. Было показано, что прием агонистов PPAR-y, пиоглитазона либо розиглитазона, повышает количество и миграционную способность ЭПК у больных ИБС и у больных сахарным диабетом 2 типа. Redondo et al. на культуре клеток in vitro так же подтвердили увеличение количества ЭПК на фоне добавления пиоглитазона и выявили, что увеличение числа ЭПК соотносится с активацией адгезии и дифференцировки ЭПК, но не с усилением пролиферации и подавлением апоптоза ЭПК [56]. Вышеизложенные данные поддерживают представление о наличии связи между биоактивностью ЭПК и инсулинорезистентностью.
ЭПК и курение.
Kondo et al. показали, что курение сокращает число ЭПК у здоровых лиц, а отказ от курения восстанавливает их количество [57]. Данные о том, что курение ведет к снижению числа ЭПК, подтверждены и в ряде других исследований [58]. Хотя достоверная связь между курением и пониженным уровнем ЭПК у больных ИБС выявлена не была. По результатам анализа, проведенного Umemura T, et al. [59] курение не вело к снижению ЭПК у больных ИБС. с другой стороны, здоровые лица без факторов риска ССЗ имели более низкий уровень ЭПК при наличии курения в анамнезе. Причина такого несоответствия не ясна. Определение вклада других факторов риска, а также влияния продолжительности курения и отказа от курения на количество и функциональную активность ЭПК сделало бы возможным более точно установить роль курения как такового на биоактивность ЭПК. Связанная с курением выработка свободных кислородных радикалов (ROS) может быть причиной
НІНІ
Обзоры
снижения биодоступности NO, что ведет к подавлению мобилизации ЭПК из костного мозга. Повышение количества свободных кислородных радикалов также меняет функциональное состояние ЭПК. Michaud et al. показали, что повышенная выработка свободных радикалов кислорода у курильщиков подавляет такие свойства ЭПК, как адгезия, миграция и тубулообразование [58]. Повышение уровня ЭПК после отказа от курения было более выражено у мало курящих и менее выражено у много курящих, что может говорить о необратимом повреждении биоактивности ЭПК при активном курении.
ЭПК и гиподинамия.
Умеренные физические нагрузки улучшают эндотелиальную функцию и снижают заболеваемость и смертность от ССЗ. Предполагается, что увеличенная выработка NO и подавление свободных кислородных радикалов через активацию анти-оксидантных систем, таких как супероксид дисму-таза и глутатион пероксидаза, способствуют повышению биодоступности NO и защите от процессов, ведущих к атеросклерозу. Хотя не ясно, ведет ли гиподинамия непосредственно к снижению числа ЭПК, известно, что аэробные физические нагрузки увеличивают количество и функциональную активность ЭПК. Laufs et al. показали, что контролируемое проведение дозированных физических нагрузок в течение 4-х недель у больных хронической ИБС повышает количество ЭПК и подавляет апоптоз ЭПК [60]. Они также продемонстрировали на экспериментальной модели животных, что выполнение дозированных физических упражнений более 7 дней ведет к повышению уровня ЭПК через сти-
муляцию VEGF и активацию 1\Ю-зависимого пути. Установлено, что даже однократно спровоцированная физической нагрузкой ишемия миокарда ведет к увеличению числа ЭПК с пиком подъема через 24-48 часов после нагрузки [61].
ЭПК и другие факторы риска.
Интересным фактом является продемонстрированная в некоторых исследованиях тенденция наличия связи между пониженным уровнем ЭПК и семейным анамнезом ССЗ. Требуются исследования для оценки связи между ЭПК и полиморфизмами генов факторов, вовлеченных в процессы регуляции ЭПК. Также показано, что уровень гомо-цистеина обратно коррелирует с количеством ЭПК, а гипергомоцистеинемия подавляет способность ЭПК к миграции и адгезии. Есть данные о том, что преходящее повышение уровня мочевой кислоты стимулирует мобилизацию ЭПК.
Таким образом, показано, что наличие факторов риска ССЗ ведет к подавлению числа и активности ЭПК. Имеющаяся информация по влиянию различных факторов на уровень ЭПК суммирована в таблице 1.
Учитывая предполагаемую положительную роль ЭПК у больных атеросклерозом повышение их уровня и улучшение функциональной активности могут быть целью терапевтического воздействия.
ЭПК и терапевтический ангиогенез.
Терапевтический ангиогенез - это термин, который обозначает стимуляцию роста новых сосудов как инвазивно, введением ангиогенных факторов
Таблица 1. Влияние факторов риска сердечно-сосудистых осложнений и медикаментозной терапии на уровень ЭПК.
Факторы, влияющие на уровень ЭПК Уровень ЭПК
Пол отсутствие влияния
Пожилой возраст
Артериальная гипертония
Сахарный диабет
Факторы риска Дислипидемия снижение
Метаболический синдром
Курение*
Физические нагрузки
Гиподинамия не известно
Статины
Медикаментозная Ингибиторы ренин-ангиотензиновой системы повышение
терапия Агонисты PPAR-y
Эритропоэтин
Примечание: *Показано снижение уровня ЭПК вследствие курения у здоровых лиц, но не у больных ИБС.
роста или кодирующих их генов, ЭПК, стволовых клеток костного мозга, так и неинвазивно, например, с помощью усиленной наружной контрпульсации. в настоящее время накоплен экспериментальный и клинический опыт по применению ЭПК с целью стимуляции васкулогенеза. Показано, что введение ЭПК может способствовать улучшению эндотелиальной функции и снижать риск неблагоприятных событий. Известно, что количество ЭПК, а также их регенеративная и пролиферативная способность снижены у больных ИБС [7]. Причиной чего, вероятно, является истощение запаса ЭПК, продолжающееся длительное сосудистое повреждение [62] либо нарушение мобилизации ЭПК из костного мозга [63].
В таблице 2 приведены клинические исследования по введению селективных популяций клеток при ишемии миокарда.
Также проведен целый ряд клинических исследований по введению мононуклеарных клеток, а не ЭПК, что обусловлено различными причинами, среди которых удобство использования и отсутствие достоверных данных о наиболее эффективных субпопуляциях клеток [65]. Лабораторные исследования на животных позволяют предположить, что для значительного улучшения миокардиальной ишемии требуется системное введение в организм человека приблизительно 1,0х105 ЭПК на килограмм массы тела [22]. При заборе 100 мл периферической крови у здоровых добровольцев и 7-ми дней культивирования удается получить только около 5,0х106 клеток. Получается, что для лечения путем системного введения ЭПК может потребоваться забор 6-12 литров крови.
Кроме того, нужно помнить, что число и функция циркулирующих ЭПК снижаются у больных, требующих восстановительного лечения, среди которых возраст [73], СД [42,74], гиперхолестери-немия [42], гипертония [42,75] и курение [57,58]. Это делает внутрисистемное введение ЭПК у многих больных менее эффективным.
Способами обойти ограниченную доступность ЭПК могут быть: 1) трансплантация ЭПК непосредственно в ишемизированные ткани; 2) введение цитокинов или факторов роста для мобилизиции ЭПК из костного мозга перед забором [19,18]; 3) получение большей концентрации путем аспирации костного мозга или лейкофереза; 4) стимуляция функции ЭПК с помощью сопутствующей генной терапии; 5) обогащение культуры ЭПК через самообнавляющиеся эмбриональные стволовые/ прогениторные клетки, полученные из костного мозга. в случае невозможности получения требуемого количества и качества аутологичных ЭПК при помощи вышеизложенных методик, альтернативой может быть выделение аллогенных ЭПК из крови пупочного канатика либо культивирование эмбриональных стволовых клеток человека [76,77].
Существует 2 принятых подхода по трансплантации ЭПК непосредственно в ишемизирован-
ный миокард: внутрикоронарная инфузия и вну-тримиокардиальная инъекция. Эффект от данных способов введения по результатам нескольких небольших клинических исследованиях был умеренным. Для окончательной оценки целесообразности непосредственной трансплантации ЭПК в ткани требуется проведение крупномасштабных исследований. Интрамиокардиальная инъекция осуществляется через эндокард с помощью электромеханической направляющей системы [78-80] либо через перикард во время операции коронарного шунтирования. Нужно помнить, что миокардиальная инъекция потенциально способна увеличить выраженность миокардиального повреждения при проведении во время острой фазы инфаркта миокарда. Более того требуется настороженность у больных с неконтролируемой выраженной гиперлипидемией, учитывая данные по стимуляции атеросклеротического поражения аортального клапана у мышей, дефицитных по АроЕ [81].
В связи с данными о возможном подавлении функции и мобилизации ЭПК в условиях наличия ряда сопутсвующих заболеваний, проводятся разработки с целью восстановления потенциальной дисфункции ЭПК. Рассматривается комбинация введения ЭПК с локальной генной терапией [82] либо генетическая модификация ЭПК.
Помимо увеличения активности и биодоступности ЭПК, возможными путями повышения эффективности терапии может быть стимуляция выхода ЭПК из мест депонирования, а также пролиферации ЭПК, либо стимуляция секреции цитокинов из ЭПК, фибробластов, сосудистых ГМК и кардиоми-оцитов. При удачной разработке генной трансфекции использование генетически модифицированных ЭПК может рассматриваться как «второе поколение» терапии ЭПК. Генетически модифицированные ЭПК могут быть использованы в качестве векторов для генной терапии, что, в отличие от голых векторов, позволит клеткам с такими встроенными векторами оставаться активными в месте неоваску-ляризации более продолжительное время, и дает возможность запрограммировать их на более экспрессию нескольких ангиогенных факторов одновременно. Применение клеточной генной терапии позволит уменьшить вводимый объем, в сравнении с традиционной генной или белковой терапией, что, в свою очередь, позволит предупредить индуцируемое давлением расширение зоны повреждения.
Первая публикация о положительном влиянии генетически модифицированных ЭПК на неоваску-ляризацию в ишемизированной задней конечности на модели экспериментального животного была сделана 1шадиго е! а1. в 2002 г [83]. Трансплантация гетерологичных ЭПК со встроенным кодирующим человеческий VEGF-165 аденовирусом улучшала неоваскуляризацию и способствовала восстановлению кровотока, а также уменьшала выраженность некроза конечности и уровень самоотторже-
АТЕРОСКЛЕРОЗ И ДИСЛИПИДЕМИИ
Таблица 2. Клинические исследования по введению селективных популяций клеток при ишемии миокарда.
Исследования Заболевания Клетки Способ введения Средняя доза клеток (хЮ6) Пациенты (терапия: контроль) Дизайн Длительность наблюдения (мес) Результат
Ahmadi et al. [64] Недавний ИМ CD133+ Интрамиокардиально (во время КШ) 1,89 18:9 HP 6 Эффективно***
Balogh et al. [65] Недавний ИМ CD34+ Интракоронарно (1-15) 8:18 HP 6 Положительная тенденция*
Bartuneket al. [66] Острый ИМ CD133+ Интракоронарно 12,6 19:16 Р 4 Эффективно***
Boyle et al. [67] Постинфарктный кардиосклероз CD34+ (+GCSF) Интракоронарно 67 5:0 HP 12 Не применимо**
Erbs et al. [68] Постинфарктный кардиосклероз Культивированные ЭПК ПК Интракоронарно 69 13:13 р 3 Эффективно***
Li et al. [69] Острый ИМ ЭПК ПК (+GCSF) Интракоронарно 73 35:35 Когортное 6 Эффективно***
Losordo et al. [70] Стенокардия напряжения CD34+ Интрамиокадиально (NOGA) 0,3 18:6 Р 6 Безопасно
Stamm et al. [71,72] Недавний ИМ CD133+ Интрамиокардиально (во время КШ) 5,8 46:9 HP 6 Эффективно***
Примечания: ИМ - инфаркт миокарда; КШ - коронарное шунтирование; GCSF- гранулоцитарный колониестимулирующий фактор; HP - нерандомизированное; ЭПК ПК - эндотелиальные прогениторные клетки периферической крови; Р - рандомизированное; NOGA -электромеханическая 3D направляющая биологическия система доставки (Johnson & Johnson company, USA).
* Терапия по введению ЭПК ассоциировалась с тенденцией к улучшению, но результат не достигал статистической достоверности.
** Неконтролируемое исследование.
*** Улучшение клинико-инструментальных показателей без достоверного влияния на твёрдые конечные точки.
Обзоры
ния некротизированных тканей, при этом потребовалось 1/30 ЭПК от дозы немодифицирован-ных ЭПК в более ранних экспериментах [20]. Есть данные по сходным исследованиям и с другими генами [83-90].
Заключение.
В настоящее время показано, что сниженное количество ЭПК является независимым предиктором заболеваемости и смертности от ССЗ [49]. Это позволяет сделать предположение о прямом влиянии регуляции числа и функции ЭПК на развитие и прогрессирование ССЗ. Установлено, что повышение числа ЭПК, стимулированное ишемией,
способствует неоваскуляризации и уменьшению площади ишемического повреждения. к прогрессированию атеросклеротического поражения ведет отсутствие баланса между процессами повреждения и регенерации сосудистой стенки. Подавление биоактивности ЭПК может быть одним из тех механизмов, через которые происходит инициация, развитие и прогрессирование атеросклероза под воздействием факторов риска. Пока не разработаны методики, обеспечивающие надежную идентификацию, оптимальную доставку и функционирование ЭПК в зоне повреждения и отсутствуют крупномасштабные исследования, реальная возможность эффективного применения ЭПК в клинике останется предметом дискуссий.
Список литературы.
1. van Os R, Kamminga LM, de Haan G. Stem cell assay: Something old, something new, something borrowed. Stem Cells. 2004;22:1181-90.
2. Xu Q. Stem cells and transplant arteriosclerosis. Circ Res. 2008;102:1011-24.
3. Xu Q. The impact of progenitor cells in atherosclerosis. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 2006;3:94-101.
4. Hu Y, Davison F, ZhangZ, Xu Q. Endothelial replacement and angiogenesis in atherosclerotic lesions of allografts are contributed by circulating progenitor cells. Circulation. 2003;108:3122-7.
5. Yoder MC. Defining human endothelial progenitor cells. J Thromb Haemost. 2009;7:49-52.
6. Gallacher L, Murdoch B, Wu DM, et al. Isolation and characterization of human CD34(-)Lin(~) and CD34(+)Lin(~) hematopoietic stem cells using cell surface markers AC133 and CD7. Blood. 2000;95:2813-20.
7. Hill JM, Zalos G, Halcox JP, et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 2003;348:593-600.
8. Urbich C, Dimmeler S. Endothelial progenitor cells: Characterization and role in vascular biology. Circ Res. 2004;95:343-53.
9. RohdeE, Malischnik C, Thaler D, et al.Blood monocytes mimic endothelial progenitor cells. Stem Cells. 2006;24:357-67.
10. Schmeisser A, Garlichs CD, Zhang H, et al. Monocytes coexpress endothelial and macrophagocytic lineage markers and form cord-like structures in Matrigel under angiogenic conditions. Cardiovasc Res. 2001;49:671-80.
11. Fujiyama S, Amano K, Uehira K, et al. Bone marrow monocyte lineage cells adhere on injured endothelium in a monocyte chemoattractant protein-1-dependent manner and accelerate reendothelialization as endothelial progenitor cells. Circ Res. 2003;93:980-9.
12. Asahara T, Murohara T, Sullivan A, et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 1997;275:964-7.
13. Krause DS, Fackler MJ, Civin CI, May WS. CD34: structure, biology, and clinical utility. Blood. 1996;87:1-13.
14- Shalaby F, Ho J, Stanford WL, et al. A requirement for Flk1 in primitive and definitive hematopoiesis and vasculogenesis. Cell. 1997;89:981-90.
15. Friedrich EB, Walenta K, Scharlau J, et al. CD34-/CD133+/VEGFR-2+ endothelial progenitor cell subpopulation with potent vasoregenerative capacities. Circ Res. 2006Feb 17;98:e20-5. Epub 2006Jan 26.
16. Tepper OM, Capla JM, Galiano RD, et al. Adult vasculogenesis occurs through the in situ recruitment,proliferation and tubuli-zation of circulating bone marrow-derived cells. Blood. 2005 Feb 1;105:1068-77-Epub 2004 Sep 23.
17. Reyes M, Dudek A, Jahagirdar B, et al. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. J Clin Invest. 2002;109:337-46.
18. Takahashi T, Kalka C, Masuda H, et al. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med. 1999;5:434-8.
19. Asahara T, Takahashi T, Masuda H, et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells.Embo J. 1999;18:3964-72.
20. Kalka C, Masuda H, Takahashi T, et al. Transplantation of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97:3422-7.
21. Shintani S, Murohara T, Ikeda H, et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in patients with acute myocardial infarction. Circulation. 2001;103:2776-9.
22. Kawamoto A, Gwon HC, Iwaguro H, et al. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia. Circulation. 2001;103:634-7.
23. Takeshita S, Zheng LP, Brogi E, et al. Therapeutic angiogenesis: a single intra-arterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hindlimb model. J Clin Invest. 1994;93:662-70.
24. Tateishi-Yuyama E, Matsubara H, Murohara T, et al. Theraputic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bonemarrow cells: a pilot study and a randomized controlled trial. Lancet. 2002;360:427-35.
lililí
Обзоры
25- Higashi Y, Kimura M, Hara K, et al. Autologous bone-marrow mononuclear cell implantation improves endothelium-dependent vasodilation in patients with limb ischemia. Circulation. 2004;109:1215-18.
26. Lolmede K, Campana L, VezzoliM, et al. Inflammatory and alternatively activated human macrophages attract vessel-associated stem cells, relying on separateHMGB1-andMMP-9-dependentpathways.]LeukocBiol. 2009;85:779-87.
27. Heissig B, Hattori K, Dias S, et al. Recruitment of stem and progenitor cells from the bone marrow niche requiresMMP-9 mediated release ofkit-ligand. Cell.2002;109:625-37.
28. Lataillade ]], Domenech], Le Bousse-Kerdiles MC. Stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)\CXCR4 couple plays multiple roles on haematopoietic progenitors at the border between the old cytokine and new chemokine worlds: survival, cell cycling and trafficking. Eur Cytokine Netw. 2004;15:177-88.
29- Petit I,]in D, Rafii S. The SDF-1-CXCR4 signaling pathway: A molecular hub modulating neo-angiogenesis. Trends Immunol. 2007;28:299-307.
30. Abbott ]D, Huang Y, Liu D, et al. Stromal cell-derivedfactor-1alpha plays a critical role in stem cell recruitment to the heart after myocardial infarction but is not sufficient to induce homing in the absence of injury. Circulation. 2004;110:3300-5.
31. Dentelli P, Rosso A, Balsamo A, et al. C-KIT, by interacting with the membrane-bound ligand, recruits endothelial progenitor cells to inflamed endothelium. Blood. 2007;109:4264-71.
32. Ceradini D], Kulkarni AR, Callaghan M], et al. Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF-1. Nat Med. 2004;10:858-64.
33. Aicher A, Heeschen C, Mildner-Rihm C, et al. Essential role of endothelial nitric oxide synthase for mobilization of stem and progenitor cells. Nat Med. 2003;9:1370-6.
34. Zhang Q, Yin H, Liu P, et al. Essential role of HDL on endothelial progenitor cell proliferation with PI3K/Atkt/cyclin D1 as the signal pathway. Exp Biol Med (Maywood) 2010;235:1082-92.
35. Zampetaki A, KirtonJP, Xu Q. Vascular repair by endothelial progenitor cells. Cardiovasc Res. 2008;78:413-21.
36. De Boer HC, Verseyden C, Ulfman LH, et al. Fibrin and activated platelets cooperatively guide stem cells to a vascular injury and promote differentiation towards an endothelial cell phenotype.Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2006;26:1653-9.
37. Langer H, May AE, Daub K, et al. Adherent platelets recruit and induce differentiation of murine embryonic endothelial progenitor cells to mature endothelial cells in vitro. Circ Res. 2006;98:e2-10.
38. Lev EI, Estrov Z, Aboulfatova K, et al. Potential role of activated platelets in homing of human endothelial progenitor cells to subendothelial matrix. Thromb Haemost. 2006;96:498-504.
39. Zeng L, Xiao Q, MargaritiA, et al. HDAC3 is crucial in shear- and VEGF-induced stem cell differentiation toward endothelial cells] Cell Biol. 2006;174:1059-69-
40. Sen S, McDonald SP, Coates PT, Bonder CS. Endothelial progenitor cells: novel biomarker and promising cell therapy for cardiovascular disease. Clin Sci (Lond). 2011 Apr;120:263-83.
41. Umemura T, Higashi Y, Nishioka K, et al. Relationship Between CD34+AC133+CD45low Endothelial Progenitor Cells and Cardiovascular Risk Factors (abstract). Hypertension. 2007;50:e130.
42. Vasa M, Fichtlscherer S, Aicher A, et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ Res. 2001;89:E1-E7.
43. Ozuyaman B, Ebner P, Niesler U et al. Nitric oxide differentially regulates proliferation and mobilization of endothelial progenitor cells but not of hematopoietic stem cells. Thromb Haemost. 2005;94:770-2.
44- Thum T, Hoeber S, Froese S, et al. Age-dependent impairment of endothelial progenitor cells is corrected by growth-hormone-mediated increase of insulin-like growth-factor-1. Circ Res. 2007;100:434-43.
45- Scheubel RJ, Zorn H, Silber RE, et al. Age-dependent depression in circulating endothelial progenitor cells in patients undergoing coronary artery bypass grafting.] Am Coll Cardiol. 2003;42:2073-80.
46. Beausejour C. Bone marrow-derived cells: the influence of aging and cellular senescence. Handb Exp Pharmacol. 2007;180:67-88.
47- Masuda H, Kalka C, Takahashi T, et al. Estrogen-mediated endothelial progenitor cell biology and kinetics for physiological postnatal vasculogenesis. Circ Res. 2007;101:598-606.
48. Imanishi T, Hano T, Nishio I. Angiotensin II accelerates endothelial progenitor cell senescence through induction of oxidative stress.] Hypertens. 2005;23:97-104-
49- Werner N, Kosiol S, Schiegl T, et al. Circulating endothelial progenitor cells and cardiovascular outcomes. N Engl] Med. 2005;353:999-1007.
50. Tepper OM, Galiano RD, Capla]M, et al. Human endothelial progenitor cells from type II diabetics exhibit impaired proliferation, adhesion, and incorporation into vascular structures. Circulation. 2002;106:2781-6.
51. Krankel N, Adams V, Linke A, et al. Hyperglycemia reduces survival and impairs function of circulating blood-derived progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25:698-703-
52. Zhou B, Ma FX, Liu PX, et al. Impaired therapeutic vasculogenesis by transplantation of OxLDL-treated endothelial progenitor cells.] Lipid Res. 2007;48:518-27-
53- Llevadot ], Murasawa S, Kureishi Y, et al. HMG-CoA reductase inhibitor mobilizes bone marrow--derived endothelial progenitor cells.] Clin Invest. 2001;108:399-405-
54- van Oostrom O, Nieuwdorp M, Westerweel PE, et al. Reconstituted HDL increases circulating endothelial progenitor cells in patients with type 2 diabetes. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007;27:1864-5-
55- Fadini GP, de Kreutzenberg SV, Coracina A, et al. Circulating CD34+ cells, metabolic syndrome, and cardiovascular risk. Eur Heart], 2006;27:2247-55-
56. Redondo S, Hristov M, Gumbel D, et al. Biphasic effect of pioglitazone on isolated human endothelial progenitor cells: involvement of peroxisomeproliferator activated receptor-gamma and transforming growth factor-betal. Thromb Haemost. 2007;97:979-87.
57. Kondo T, Hayashi M, Takeshita K, et al. Smoking cessation rapidly increases circulating progenitor cells in peripheral blood in chronic smokers.Arterioscler Thromb VascBiol. 2004;24:1442-7.
58. Michaud SE, Dussault S, Haddad P, et al. Circulating endothelial progenitor cells from healthy smokers exhibit impaired functional activities. Atherosclerosis. 2006;187:423-32.
59. Umemura T, Higashi Y. Endothelial progenitor cells: therapeutic target for cardiovascular diseases. JPharmacol Sci. 2008 Sep;108:1-6. Epub 2008 Sep 6.
60. Laufs U, Werner N, Link A, et al. Physical training increases endothelial progenitor cells, inhibits neointima formation, and enhances angiogenesis. Circulation. 2004;109:220-6.
61. Adams V, Lenk K, Linke A, et al. Increase of circulating endothelial progenitor cells in patients with coronary artery disease after exercise-induced ischemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004;24:684-690.
62. Khakoo AY, Finkel T. Endothelial progenitor cells.Annu Rev Med 2005;56:79-101.
63. Linke A, Erbs S, Hambrecht R Exercise and the coronary circulation-alterations and adaptations in coronary artery disease.
Prog Cardiovasc Dis 2006;48:270-84.
64. Ahmadi H, Baharvand H, Ashtiani SK, et al. Safety analysis and improved cardiac function following local autologous transplantation of CD133(+) enriched bone marrow cells after myocardial infarction. Curr Neurovasc Res. 2007;4:153-60.
65. Balogh L, Czuriga I, Hunyadi J, et al. [Effects of autologous bone marrow derived CD34+ stem cells on the left ventricularfunction following myocardial infarction] Orvosi hetilap. 2007;148:243-9.
66. Bartunek J, Vanderheyden M, Vandekerckhove B, et al. Intracoronary injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells promotes cardiac recovery after recent myocardial infarction: feasibility and safety. Circulation. 2005;112:1178-83.
67. Boyle AJ, Whitbourn R, Schlicht S, et al. Intra-coronary high-dose CD34+ stem cells in patients with chronic ischemic heart disease: a 12-month follow-up. International journal of cardiology. 2006;109:21-7.
68. Erbs S, Linke A, Adams V, et al. Transplantation ofblood-derived progenitor cells after recanalization of chronic coronary artery occlusion: first randomized and placebo-controlled study. Circulation research. 2005;97:756-62.
69. Li ZQ, Zhang M, Jing YZ, et al. The clinical study of autologous peripheral blood stem cell transplantation by intracoronary infusion in patients with acute myocardial infarction (AMI) International journal of cardiology. 2007;115:52-6.
70. Losordo DW, SchatzRA, White CJ, et al. Intramyocardial transplantation of autologous CD34+ stem cells for intractable angina: a phase I/IIa double-blind, randomized controlled trial. Circulation. 2007;115:3165-72.
71. Stamm C, WestphalB, Kleine HD, et al. Autologous bone-marrow stem-cell transplantation for myocardial regeneration. Lancet. 2003;361:45-6.
72. Stamm C, Kleine HD, Choi YH, et al. Intramyocardial delivery of CD133+ bone marrow cells and coronary artery bypass graftingfor chronic ischemic heart disease: safety and efficacy studies. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 2007;133:717-25.
73. Heiss C, Keymel S, Niesler U, et al. Impaired progenitor cell activity in age-related endothelial dysfunction. J Am Coll Cardiol. 2005;45:1441-8.
74. IiM, Takenaka H, Asai J, et al. Endothelial progenitor thrombospondin-1 mediates diabetes-induced delay in reendothelial-ization following arterial injury. Circ Res. 2006;98:697-704.
75. Imanishi T, Moriwaki C, Hano T, Nishio I. Endothelial progenitor cell senescence is accelerated in both experimental hypertensive rats and patients with essential hypertension.JHypertens. 2005;23:1831-7.
76. Murohara T, Ikeda H, Duan J, et al. Transplanted cord blood-derived endothelial precursor cells augment postnatal neovas-cularization.J Clin Invest. 2000;105:1527-36.
77. Levenberg S, Golub JS, AmitM, et al. Endothelial cells derived from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica. 2002;99:4391-6.
78. Beeres SL, Bax JJ, Dibbets-Schneider P, et al. Intramyocardial injection of autologous bone marrow mononuclear cells in patients with chronic myocardial infarction and severe left ventricular dysfunction. The American journal of cardiology. 2007;100:1094-8.
79. Perin EC, Dohmann HF, Borojevic R, et al. Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure. Circulation. 2003;107:2294-302.
80. Kawamoto A, Tkebuchava T, Yamaguchi J, et al. Intramyocardial transplantation of autologous endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization of myocardial ischemia. Circulation. 2003;107:461-8.
81. George J, Afek A, Abashidze A, et al. Transfer of endothelial progenitor and bone marrow cells influences atherosclerotic plaque size and composition in apolipoprotein E knockout mice. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 2005;25:2636-
41.
82. Kawamoto A, Murayama T, Kusano K, et al. Synergistic effect ofbone marrow mobilization and vascular endothelial growth factor-2 gene therapy in myocardial ischemia. Circulation. 2004;110:1398-405.
83. Iwaguro H, Yamaguchi J, Kalka C, et al. Endothelial progenitor cell vascular endothelial growth factor gene transfer for vascular regeneration. Circulation. 2002;105:732-8.
84. Murasawa S, Llevadot J, Silver M, et al. Constitutive human telomerase reverse transcriptase expression enhances regenerative properties of endothelial progenitor cells. Circulation. 2002;106:1133-9-
23
85. Nagaya N, Kangawa K, Kanda M, et al. Hybrid cell-gene therapy for pulmonary hypertension based on phagocytosing action of endothelial progenitor cells. Circulation. 2003;108:889-95.
86. KongD, Melo LG, Mangi AA, et al. Enhanced inhibition of neointimal hyperplasia by genetically engineered endothelial progenitor cells. Circulation.2004;109:1769-75.
87. Griese DP, Achatz S, Batzlsperger CA, et al. Vascular gene delivery of anticoagulants by transplantation ofretrovirally-trans-duced endothelial progenitor cells. Cardiovascular research. 2003;58:469-77.
88. Cho HJ, Youn SW, Cheon SI, et al. Regulation of endothelial cell and endothelial progenitor cell survival and vasculogenesis by integrin-linked kinase. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 2005;25:1154-60.
89. Jiang M, Wang B, Wang C, et al. Angiogenesis by transplantation of HIF-1 alpha modified EPCs into ischemic limbs. Journal of cellular biochemistry. 2008;103:321-34-
90. Choi JH, Hur J, Yoon CH, et al. Augmentation of therapeutic angiogenesis using genetically modified human endothelial progenitor cells with altered glycogen synthase kinase-3beta activity. The Journal of biological chemistry. 2004;279:49430-8.
